VIRUS ENTERICI NEGLI ALIMENTI. Simona Di Pasquale

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1 VIRUS ENTERICI NEGLI ALIMENTI Simona Di Pasquale Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari

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3 Alimenti responsabili della trasmissione dei Virus Enterici e fonti di contaminazione Prodotti della pesca Prodotti vegetali Acqua Frutta Latte Carne Secrezioni ed escrezioni umane Animali infetti Insetti Roditori

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5 Contaminazione primaria Impiego acque reflue o inquinate per l irrigazione Prodotti ortofrutticoli Contaminazione delle superfici della pianta durante l irrigazione o la fertilizzazione Contaminazione attraverso le radici? Frutti di mare Possibile contaminazione durante il loro accrescimento se allevati in acque non sicure, in quanto il sistema di alimentazione filtrante tende a concentrare agenti infettivi

6 Contaminazione secondaria Contatto con altri alimenti Operatori che non rispettano le norme igieniche Acqua utilizzata per la preparazione o il lavaggio degli utensili In Alaska un epidemia di Epatite A venne attribuita ad una bevanda ghiacciata venduta al mercato, preparata da un addetto affetto da HAV che aveva usato dell acqua presa dal lavandino del bagno e utensili conservati nelle vicinanze del servizio igienico

7 Virus Enterici 120 differenti specie I virus si presentano come particelle inerti sferiche con diametro che variano: da nm (Picornavirus-Epatite A, e Calicivirus-Norovirus) a 75 nm (Rotavirus) I virus presentano una superficie esterna costituita da un rivestimento che protegge il filamento di RNA. I virus trasmessi con gli alimenti contengono una singola catena di RNA, mentre per virus enterici con DNA non è stata provata la trasmissione attraverso alimenti e acqua. Studi riferiscono che dosi minime, fino ad una singola unità virale infettante le colture cellulari, hanno prodotto infezione per via orale.

8 Classificazione dei Virus Enterici Virus dell'epatite a trasmissione oro-fecale: Virus dell epatite A (HAV) Virus dell epatite E (HEV); Virus che provocano gastroenteriti: calicivirus enterici umani i Norovirus (NoV) e i Saporovirus (SaV); Rotavirus, Adenovirus tipo 40 e 41, Virus che replicano nell'intestino umano ma provocano patologie in altri organi, quali il sistema nervoso centrale o il fegato Enterovirus

9 Virus dell Epatite A Famiglia: Picornaviridae Genere: Hepatovirus Dimensioni: nm Presenza del capside Singolo filamento di RNA

10 Classificazione del virus dell Epatite A Genotipi Ceppi umani Ceppi isolati da scimmie

11 ancora La variabilità notata a livello nucleotidico non si riflette però in un equivalente grado di variazione a livello aminoacidico. Tale basso livello di diversità antigenica comporta che, attualmente, tutti i virus di HAV appartengono allo stesso sierotipo, e che l immunità acquisita a seguito di un infezione, anche asintomatica, perdura per tutta la vita verso tutti i diversi genotipi umani.

12 Sorgente L uomo Epidemiologia dell HAV Diffusione Malattia diffusa in tutto il mondo Malattia correlata alle condizioni socio-economiche, alle abitudini alimentari ed igieniche, la densità di popolazione

13 Cenni clinici Periodo di incubazione è variabile tra giorni (con una media di 30gg) Sintomi: anoressia, nausea, vomito,febbre, diarrea dolori addominali, ittero accompanato da urine color marsala. La loro risoluzione si verifica generalmente entro 1-2 settimana Convaescenza prolungata Letalità molto bassa (<0.1%) Modalità di trasmissione Oro-fecale Alimenti Acqua

14 Fattori di rischio censiti dal SEIEVA (2004) Fattore di rischio Fascia di età e TOTALE n (%) n (%) n (%) n (%) Consumo di frutti 112 (45) 203 (75) 407 (68) 722 (65) di mare Contatto con itterico 67 (32) 26 (10) 42 (8) 135 (14) Notte fuori città 63 (25) 98 (37) 264 (44) 425 (38)

15 Virus dell Epatite E Famiglia: Caliciviridae Dimensioni: nm Presenza del capside Singolo filamento di RNA

16 Epidemiologia dell HEV Sorgente L uomo Diffusione Malattia diffusa soprattutto nei paesi in via di sviluppo Africa-Asia- America Centrale Molte epidemie sono state osservate nei paesi tropicali dopo la stagione delle piogge In Italia il rischio di epatite E è limitato a viaggiatori diretti verso aree endemiche. Tuttavia, circa l'1% degli italiani ha anticorpi anti-hev. In Europa e USA l'epatite E è tipicamente una malattia da importazione. Recentemente sono stati identificati casi sporadici in pazienti che non si erano mai recati all'estero o che non avevano avuto contatti con soggetti provenienti da aree endemiche.

17 Diffusione dell Epatite E 1956 Nuova Delhi (India) circa casi dal 1986 al 1988 Nord-Ovest Cina circa casi Spagna 84.2% delle acque di scarico erano positive 2004 Darfur (Africa Centrale) 1000 casi di contagio e 27 morti (di cui 8 donne incinte)

18 Cenni clinici La malattia ha sintomi di malattia acuta itterica autolimitante molto simile a quella causata dal virus dell Epatite A Periodo di incubazione medio di 6 settimane con un range di 2-9 settimane Non è evidenziata cronicizzazione della malattia E stato rilevato in più epidemie un alto tasso di mortalità nelle donne in gravidanza (circa 20%) specialmente durante il primo trimestre La patologia è stata raramente rilevata nei bambini Modalità di trasmissione L acqua contaminata da feci risulta essere la causa più importante di trasmissione della malattia Oro-fecale Alimenti

19 Fattori di rischio Acqua in bottiglie non sigillate Verdure crude non lavate con acqua potabile Frutta non sbucciata Frutti di mare Alimenti d'ogni tipo manipolati o consumati crudi

20 Norovirus (prima Norwalklike-viruses) Famiglia: Caliciviridae Dimensioni: nm Presenza del capside Singolo filamento di RNA Causano malattia in persone di tutte le età Vinjè 2004

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22 Classificazione dei Caliciviruses (2001) GIII GI GII

23 Classificazione (2004)

24 Epidemiologia dei Norovirus Sorgente L uomo Diffusione Incidenza delle malattie trasmesse da Norovirus ( ) 47% USA 80% Paesi Bassi 27% Inghilterra e Galles 56% Finlandia

25 Cenni clinici La malattia è considerata essere autolimitante, Periodo di incubazione di 1-3 giorni Sintomi: febbre, vomito, diarrea e nausea. Sono più lievi nei bambini, a differenza delle altre gastroenteriti virali. La loro risoluzione si verifica generalmente entro 2-3 giorni. In uno studio epidemiologico condotto in Olanda > 20% delle persone che aveva avuto una malattia riportava sintomi anche dopo due settimane (Rockx, 2002) Modalità di trasmissione Elevata infettività <10 particelle virali Vie di diffusione varie: Oro-fecale Alimenti Acqua Aerosol

26 Fattori di rischio Frutti di mare consumati crudi o poco cotti Verdure fresche Frutti di piante a basso fusto (lamponi berries ) CDC risultati relativi a 232 episodi di tossinfezioni nel periodo Luglio 1997 Giugno 2000 non determinato 24% acqua 3% interumano 16% alimenti 57% ristoranti asili nido scuole crociere e vacanze non determinato

27 Stagionalità dei casi di NoV Lopman BMC Public Health Mar 24;3(1):13. Mounts et al J Infect Dis May;181 Suppl 2:S284-7

28 Norovirus associati con le crociere Luglio- Novembre epidemie a bordo di navi da crociera della stessa compagnia Ottobre epidemia a bordo di una nave da crociera nel Mediterraneo Gennaio epidemia a bordo di una nave da crociera nei Caraibi - epidemia a bordo di una nave da crociera in Florida

29 Ragioni per cui i Norovirus sono associati alle navi da crociera I focolai epidemici vengono individuati e denunciati più rapidamente su una nave da crociera che sulla terraferma. La vicinanza degli alloggi potrebbe accrescere le occasioni di contatto di gruppo. L arrivo di altri passeggeri potrebbe causare il contagio di altri passeggeri e membri dell equipaggio

30 Distribuiti in tutto il mondo Molluschi bivalvi Importante apporto nutrizionale per l uomo Animali scavatori sessili o sedimentari, chesi nutrono di piccole particelle alimentari presenti nell acqua o nei sedimenti, mediante un meccanismo di filtrazione C Litri/ora Mitilo 14 1,5 Ostrica Europea litri/giorno Ostrica Americana Organismi filtratori trattengono nel loro organismo non solo il placton necessario al loro metabolismo, ma anche batteri e virus (es. HAV, HEV, Novorirus) eventualmente presenti nell ambiente.

31 Casi di Epatite A trasmessi con i molluschi Anno N o di casi Luogo dell epidemia Alimento implicato Sospetta causa Texas, Georgia Ostriche Acque di scarico non trattate UK Noci di mare Acque di scarico Stati/USA Ostriche Raccolta in acque non approvate morti Cina Molluschi di acqua dolce Raccolta nel fiume dopo piogge Puglia Cozze e vongole Rinfresco? Australia Ostriche Acque non trattate Spagna Vongole peruviane Non conosciuto 2004 >400 Campania Vongole e tarufi Rinfresco?

32 Principali epidemie da Noroviruses trasmesse dai molluschi 1977 Massachusetts (USA) 83 casi molluschi cotti al forno (Snow Montain agents) 1978 Sidney (Australia) 2000 casi (Norwalk virus) UK sei diversi episodi epidemici associati al consumo di mo lluschi (SRSV) 1993 Luisiana (USA) 180 casi ostriche crude e stufate

33 Fattori che influenzano la sopravvivenza del virus nell ambiente Temperatura (<10 C) Salinità Antagonismo microbico Radiazioni solari Associazione con plancton Sedimenti I virus possono sopravvivere in acqua di mare fino a 130 gg

34 D. L.vo 530/92 norme sanitarie per la produzione e la immissione sul mercato dei molluschi bivalvi vivi destinati al consumo umano. Limiti di tollerabilità per i contaminanti chimici e biologici*; Distinzione delle zone di produzione dei molluschi (A, B,C); Depurazione/stabulazione di tutti i molluschi provenienti da acque classificate non idonee *Coliformi fecali; E.coli, Salmonelle, Biotosine algali, Mercurio e Piombo NON PREVEDE LIMITI PER PRESENZA DI VIRUS ENTERICI

35 Classificazione delle zone di produzione dei molluschi Zona A Coliformi fecali <300/100g di polpa nel 100% dei campioni E.coli <300/100g di polpa nel 100% dei campioni Salmonelle assenti in 25 g di polpa nel 100% dei campioni Mercurio <0.5 ppm nella polpa nel 100% dei campioni Piombo <2 ppm nella polpa nel 100% dei campioni Zona B Coliformi fecali <6.000/100g di polpa nel 90% dei campioni E.coli <4.600/100g di polpa nel 90% dei campioni Mercurio <0.5 ppm nella polpa nel 100% dei campioni Piombo <2 ppm nella polpa nel 100% dei campioni Zona C Coliformi fecali non oltre /100 g di polpa nel 100% Mercurio <0.5 ppm nella polpa nel 100% dei campioni Piombo <2 ppm nella polpa nel 100% dei campioni Direttamente al consumo Depurazione o stabulazione in zona A Stabulazione in zona A per almeno 2 mesi

36 Metodi di depurazione Cloro CHIMICI Iodofori Ozono Raggi UV FISICI Filtrazione

37 Cloro Efficace nel ridurre la contaminazione batterica Non risulta altrettanto efficace nei confronti dei virus enterici A bassi livelli di concentrazione può influenzare l attività di filtrazione dei molluschi (riduzione del cloro residuo mediante tiosolfato). Iodofori Utilizzata in molti Paesi Europei (0,1-0,4 ppm) Efficace per i batteri ma non per i virus Il virus dell HAV viene inattivato solo a concentrazioni > 100ppm

38 Ozono Diffuso in Francia, Australia e in Italia Agisce sui batteri con azione combinata di ossidazione delle proteine, alterazione delle strutture molecolari (riguardo i legami HS) e di blocco en zimatico I virus sono più sensibili dei batteri in quanto l ossidazione delle proteine avviene più facilmente in quanto privi di membrana cellulare Raggi UV Non lascia residui, non influenza i processi fisiologici dei mol luschi Efficaci su tutti i microrganismi solo quando vengono a stretto contatto con i raggi (acqua poco torbida, flusso a strato sottile e lampade sem pre efficienti) Il sistema deve essere regolarmente pulito Comporta rischi elevati

39 Sopravvivenza dei virus enterici Al congelamento consente la sopravvivenza dei virus enterici Episodio di Gastroenterite da NoV causato da mitili congelati per 15 sett. Sopravvivenza dell Epatite A in frutti di mare per settimane o addirittura mesi Alla cottura provoca la denaturazione delle proteine del capside e/o la frammentazione dell acido nucleico Spesso però i componenti stessi degli alimenti possono proteggere i virus dall effetto della temperatura,infatti è noto che un ambiente proteico protegge i virus

40 Efficacia della depurazione su molluschi artificialmente contaminati ponendoli a contatto per 1,5 h con acqua marina contenente 2 log TCID 50/ml di HAV Determinazione Qualitativa Determinazione Quantitativa Tempo (h) RT-Nested-PCR Metodo integrato Colture Cellulari RT-PCR Colture Cellulari log TCID 50/ml±DS ± ± <1 3.5± <1. <1. 72 <1 <1 96 <1 <1 120 <1 <1

41 Prove sperimentali dell inattivazione del virus dell Epatite A Trattamento a 60 C Tempo (minuti) Sospensione virale Determinazione Determinazione Qualitativa* Quantitativa* Contaminazione di omogenato di mollusco con HAV Determinazione Qualitativa* Determinazione Quantitativa* ± ± <1 3.5± <1. <1. 20 <1 <1 25 <1 <1 30 <1 <1 *(Log TCID50 ml -1 ± SD)

42 Tempo (minuti) Determinazione Qualitativa* Trattamento a 80 C Sospensione virale Determinazione Quantitativa* Contaminazione di omogenato di mollusco con HAV Determinazione Qualitativa* Determinazione Quantitativa* ± ±0.1 3 N.T. 3.5±0.3 6 N.T. 2.4± N.T. 1.5± N.T. <1 Trattamento a 100 C ± ±0.1 1 N.T. 2.1±0.2 2 N.T. N.T. 5 N.T. N.T. *(Log TCID50 ml -1 ± SD)

43 Prove sperimentali dell inattivazione del virus dell Epatite A Antipasto di cozze: i mitili sono stati posti in un contenitore e sottoposti a cottura (i campioni sono stati prevelati dopo 3, 6 and 9 min. ) Cozze gratinate: i mitili sono stati aperti e posti in un contenitore. Successivamente venivano ricoperti con un impasto composto da: cipolla aglio pangrattatoe burro. I mitili sono stati poi grigliati per 5 minuti. Sugo di cozze: Olio, aglio, succo di pomodoro sono stati posti in pentola per 15 min., poi sono stati aggiunti i mitili l origano e il prezzemolo e fatti cuocere per 8 minuti dopo l ebollizione.

44 Effetto della cottura su molluschi sperimentalmente contaminati con l Epatite A Piatti Tempo (min) RT- nested PCR Determinazione Qualitativa Metodo Integrato Colture cellulari RT-PCR Determinazione Quantitativa (Log TCID50 ml -1 ± SD) Colture Cellulari ± 0.8 Antipasto di mare 3 6 < 1 < 1 9 < 1 Cotte gratinate ± 0,8 < 1 Cozze al sugo N.D. N.D ± 0.8 N.D

45 Prove sperimentali su vegetali contaminati con acqua contenente 5 log TCID50/ml di HAV e conservati a 4 C Obiettivo Valutare l assorbimento dell HAV sulla superficie di differenti vegetali (lattuga, finocchi, carote) Effetti del lavaggio domestico Persistenza della contaminazione virale Risultati e Conclusioni La lattuga sembra avere la più alta capacità di adsorbimento Il livello di contaminazione del virus nelle carote e nei finocchi decresce rapidamente. Il lavaggio non garantisce l eliminazione del virus dai vegetali.

46 Rischi delle contaminazioni virali degli alimenti Ad eccezione di specifici alimenti che sono consumati crudi o poco cotti (vegetali e molluschi), la contaminazione virale dei prodotti di origine animale riveste in genere, nell industria alimentare un rischio minore delle contaminazioni batteriche e fungine perché: I virus a differenza dei batteri non crescono sugli alimenti e q uindi trattamenti non idonei o pratiche di stoccaggio non corrette non provocano un rischio per il consumatore La cottura degli alimenti sono distruttive per i virus La depurazione si è rilevato di scarsa utilità per eliminare i virus dal corpo dei molluschi I sistemi di lavaggio della verdura sono poco efficaci ad eliminare i virus dai vegetali a foglia larga

47 Tecniche di rilevamento ed identificazione dei virus Sistemi biologici : inoculazionie in scimmie (non più utilizzata) Sistemi cellulari: colture cellulari (tempi estremamente lunghi) Sistemi immunologici: test di immunoflorescenza, Elisa, radioimmunologici, test radioimmunofocus (basso limite di sensibilità) Sistemi molecolari: sonde molecolari, PCR, Real Time PCR - SYBR Green e Real Time PCR - Sonda Sistemi integrati: colture cellulari e PCR

48 .infine Sistemi molecolari Sistemi integrati HAV RT-PCR-Nested Colture Cellulari-RT PCR Norovirus HEV RT-PCR Non Coltivabili

49 Grazie per l attenzione