Variabilità somaclonale e selezione di somacloni

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1 Variabilità somaclonale e selezione di somacloni

2 Le piante possono essere moltiplicate dall uomo mediante: RIPRODUZIONE SESSUALE Semi Piante figlie geneticamente diverse tra loro e rispetto alla pianta madre RIPRODUZIONE ASESSUALE (propagazione vegetativa) Metodi tradizionali (talea) Moltiplicazione in vitro Clone: piante figlie geneticamente identiche tra loro e alla pianta mare

3 Le piante di interesse commerciale vengono spesso moltiplicate mediante riproduzione asessuale per far si che le piante figlie conservino i caratteri della pianta madre e che non emergano nuovi caratteri indesiderati

4 La propagazione in vitro delle piante viene effettuata principalmente attraverso: ORGANOGENESI DIRETTA Moltiplicazione di germogli e loro radicazione (micropropagazione) Germogli multipli Germogli radicati Protoplasto Callo buio Callo luce ORGANOGENESI INDIRETTA Rigenerazione da cellule indifferenziate

5 ORGANOGENESI INDIRETTA Rigenerazione da callo o da protoplasti Callo Protoplasti Plantula Caulogenesi (Citochinine) La plantula rigenerata può essere messa a dimora se il sistema vascolare delle radici è connesso con quello del germoglio Germogli multipli Rizogenesi (Auxine)

6 ORGANOGENESI DIRETTA Moltiplicazione di germogli Germoglio Citochinine inibizione dominanza apicale Germogli multipli Separazione dei germogli Radicazione Messa a dimora Previa acclimatazione Pianta Plantula

7 Spesso le piante propagate in vitro presentano eterogeneità fenotipica (seppure originate da espianti della medesima pianta madre!) M.K. Biswas, M. Dutt, U.K. Roy, R. Islam, M. Hossain - Development and evaluation of in vitro somaclonal variation in strawberry for improved horticultural traits - Scientia Horticulturae 122 (2009) Tale fenomeno è molto più frequente (ma non esclusivo) in piante rigenerate da cellule indifferenziate

8 Somacloni e variabilità somaclonale definizione The term somaclone was coined to refer to plants derived from any form of cell culture, and the term somaclonal variation was coined to refer to the genetic variation among such plants.

9 Variabilità somaclonale Alterazioni geniche Mutazioni puntiformi Mutazioni cromosomiche Modificazioni genomiche Sostituzioni nucleotidiche Delezioni Inversioni Duplicazioni Traslocazioni Poliploia Aneuploidia Modificazioni epigenetiche Metilazione del DNA

10 Variabilità somaclonale Alterazioni geniche ereditabili/non ereditabili Mutazioni puntiformi Mutazioni cromosomiche Stabili Ereditabili Modificazioni genomiche Modificazioni epigenetiche Instabili Non ereditabili

11 Variabilità somaclonale Alterazioni geniche ereditabili/non ereditabili EPIGENETIC VARIATION is often unstable and can disappear either after plants are removed from culture or within a few clonal or sexual generations (Kaeppler et al., 2000), while GENETIC VARIATION is stable and then heritable (Skirvin et al., 1994). The success in applying somaclonal variation in plant breeding is therefore dependent on the genetic stability of the selected somaclones.

12 Variabilità somaclonale Fattori determinanti Numerosi studi hanno evidenziato una correlazione tra variabilità somaclonale e: 1) tipo e concentrazione di auxine nel mezzo colturale 2) numero di subcolture

13 Variabilità somaclonale Fattori determinanti Oltre agli 1) ormoni e al 2) numero di subcolture, altri fattori possono influenzare la variabilità somaclonale: 3) Genotipo: Le diverse varietà di una specie, sulla base del diverso genotipo, possono essere più o meno suscettibili ai fattori determinanti la variabilità somaclonale Ad es., alcune varietà possono avere sistemi di prevenzione delle mutazioni e riparazione del DNA più efficaci rispetto ad altri individui della stessa specie

14 Variabilità somaclonale Fattori determinanti Oltre agli 1) ormoni e al 2) numero di subcolture, altri fattori possono influenzare la variabilità somaclonale: 4) Tipo di espianto: Diversi tipi di espianto, seppure ottenuti dal medesimo individuo, possono originare diversi gradi di variabilità somaclonale In genere, più giovani sono gli espianti e minore è l incidenza della variabilità somaclonale (i tessuti più maturi sono mosaici di mutanti mitotici)

15 Variabilità somaclonale Fattori determinanti Oltre agli 1) ormoni e al 2) numero di subcolture, altri fattori possono influenzare la variabilità somaclonale: 5) Substrato Per motivi ad oggi ignoti, la frequenza della variabilità somaclonale può essere diversa in colture mantenute su mezzi colturali di diversa composizione Le principali differenze tra mezzi colturali sono: micro- e macro-nutrienti, vitamine, chelanti del Fe e tamponi

16 Variabilità somaclonale Fattori determinanti Oltre agli 1) ormoni e al 2) numero di subcolture, altri fattori possono influenzare la variabilità somaclonale: 6) Condizioni colturali Anche le condizioni colturali, principalmente illuminazione, temperatura e umidità, possono incidere sul grado di variabilità somaclonale In generale, più sono stressanti le condizioni di crescita, maggiore è la probabilità di insorgenza di variazioni somaclonali

17 Variabilità somaclonale Potenzialità La variabilità somaclonale può rappresentare un problema per la propagazione di genotipi di elezione tuttavia, può anche rappresentare un vantaggio per alcune applicazioni: Selezione di somacloni iperproducenti composti di interesse industriale Selezione di somacloni resistenti a composti chimici (alluminio, NaCl) Selezione di somacloni resistenti a stress biotici o abiotici (funghi, siccità, insetti)

18 Variabilità somaclonale Valutazione Il grado di variazione somaclonale viene valutato sulla base di diversi parametri: fenotipici (altezza pianta, resistenza a stress) biochimici (analisi delle proteine, formazione di metaboliti secondari) genetici (analisi del cariotipo, analisi con marcatori molecolari, grado di metilazione DNA) SELEZIONE VISIVA (visual screening) ANALISI CHIMICHE ANALISI CITOGENETICHE E BIOMOLECOLARI

19 Variabilità somaclonale In vitro ed ex vitro IN VITRO: sulle masse cellulari indifferenziate (ad es. produzione di pigmenti) EX VITRO: sulle piante rigenerate (caratteri morfologici o fisiologici)

20 Variabilità somaclonale Valutazione con markers molecolari Una delle tecniche più diffuse è: RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA

21 Variabilità somaclonale RAPD test Principale vantaggio: può essere effettuato su piante con genoma parzialmente o totalmente ignoto È una PCR in cui, invece di primers disegnati appositamente sulle sequenze target, si usano primers casuali (random primers) di piccole dimensioni (8-12 bp)

22 1. Estrazione del DNA Variabilità somaclonale RAPD test 2. Amplificazione del DNA mediante PCR con random primers 3. Separazione elettoforetica su gel di agarosio 4. Confronto tra gli ampliconi ottenuti da diversi somacloni 5. Analisi statistica dei dati ottenuti

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24 Dipendenza dal genotipo Variabilità somaclonale Problemi Non sempre la selezione dei somacloni è un metodo adeguato all ottenimento di nuove varietà vegetali: Variazioni instabili e non ereditabili I caratteri di interesse possono non essere modificati Molti cambiamenti sono indesiderati Incontrollabile e non prevedibile

25 Estrazione di metaboliti vegetali e loro identificazione/quantificazione mediante HPLC

26 Estrazione Solubilizzazione dei metaboliti La gran parte delle metodiche per l analisi dei metaboliti vegetali richiedono che essi siano: in fase liquida (es. HPLC e NMR) in fase gassosa (es. GC) Il materiale vegetale non può essere analizzato tal quale

27 Estrazione in fase liquida Matice fresca e secca L estrazione dei metaboliti può essere effettuata su: -Biomassa vegetale fresca (idratata) -Biomassa vegetale secca (disidratata) Essiccazione

28 Estrazione Essiccazione L essiccazione viene generalmente effettuata in stufa ad alte temperature e per tempi lunghi (per es. foglie 70 C per 72 h) Inadatta per metaboliti termolabili, che devono essere estratti da biomassa fresca o essiccata in liofilizzatore Stufa da laboratorio Liofilizzatore da bancone

29 Estrazione Triturazione L efficienza dell estrazione è tanto maggiore quanto più è ampia la superficie di contatto tra matrice vegetale e solvente Triturazione del materiale vegetale Triturazione di foglie secche con pestello e mortaio

30 Estrazione Polverizzazione Esistono metodiche che permettono di ottenere polveri finissime, con enormi incrementi della superficie di contatto matrice/solvente Polverizzazione in N 2 liquido (-196 C) A B C Polverizzazione in N 2 liquido di radici coltivate in vitro D

31 Estrazione Omogeneizzazione Esistono strumenti che permettono di ridurre la matrice vegetale in piccolissimi frammenti direttamente nel solvente di estrazione Omogeneizzatori a immersione Ultraturrax

32 Estrazione Sonicazione È possibile incrementare la permeabilità delle membrane biologiche, aumentando di molto l efficienza dell estrazione Sonicazione Bagno a ultrasuoni

33 Estrazione Estratti totali Spesso gli estratti totali vengono ottenuti con solventi a polarità media Estratti etanolici e metanolici Matrice vegetale Estrazione con MeOH o EtOH Estratto totale L estratto così ottenuto è molto complesso, cioè composto da un numero elevatissimo di metaboliti

34 Estrazione Estratti totali È possibile ottenere estratti totali più semplici (minor numero di metaboliti) e quindi più facili da analizzare Estrazioni seriali con solventi a polarità crescente Matrice vegetale Estrazione con cloroformio (CHCl 3 ) Estratto 1 Estrazione con acetato di etile (EtOAc) Estatto 3 Estrazione con metanolo (MeOH) Estratto 2

35 Frazionamento Colonne cromatografiche Diversi metodi permettono di ottenere dagli estratti totali delle frazioni, ciascuna contenente un numero limitato di metaboliti Separazione cromatografica

36 Evaporazione Evaporazione del solvente Spesso i metaboliti contenuti negli estratti e nelle frazioni sono troppo diluiti per essere analizzati L estratto deve essere portato a secco e poi risolubilizzato in un piccolo volume di solvente Evaporatore rotante (rotavapor)

37 Analisi HPLC Separazione, identificazione e quantificazione L HPLC è una delle metodiche più usate per l analisi dei metaboliti contenuti in estratti e frazioni High Performance Liquid Chromatography High Pressure Liquid Chromatography

38 Analisi HPLC Principi generali Un piccolissimo volume di estratto viene iniettato nel sistema HPLC attraverso l iniettore Hamilton Iniettore

39 Analisi HPLC Principi generali L estratto raggiunge la colonna cromatografica attraverso un piccolo tubo, sospinto da una soluzione sotto pressione (eluente) Eluente L eluente costituisce la FASE MOBILE del sistema

40 Analisi HPLC Principi generali All interno della colonna si trova un materiale granulare nei cui interstizi (pori) la fase mobile può fluire colonne Il materiale interno alla colonna costituisce la FASE STAZIONARIA

41 Analisi HPLC Principi generali Le diverse molecole presenti nell estratto procederanno a diversa velocità nella colonna Separazione sulla base della loro affinità con la fase fissa e con la fase mobile: SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA

42 Analisi HPLC Principi generali Ciascuna sostanza raggiungerà il detector dopo un certo tempo dall iniezione (tempo di ritenzione) Detector Nel detector viene misurata l assorbanza della sostanza ad una o più lunghezze d onda

43 Analisi HPLC Principi generali Il detector restituisce un profilo cromatografico in cui a ciascun picco corrisponde una determinata sostanza Tempo di ritenzione L area sottesa al picco è proporzionale alla concentrazione della sostanza

44 Analisi HPLC Analisi di metaboliti noti Per l identificazione e per la quantificazione degli analiti sono necessari gli standard, ossia campioni puri dell analita L HPLC non è adatta alla caratterizzazione strutturale di composti ignoti, poiché richiede la disponibilità di standard Per la gran parte dei metaboliti noti sono disponibili in commercio gli standard, cioè campioni puri degli analiti

45 Uso degli standard Determinazione del tempo di ritenzione L attribuzione di un è effettuata sulla base dell identità con il tempo di ritenzione dello standard Standard Caffeine Sorbate Benzoate Energy Drink

46 Uso degli standard Determinazione del tempo di ritenzione Con soluzioni a diversa concentrazione di standard viene costruita una retta di taratura e viene determinata l equazione della retta Mediante l equazione della retta è possibile calcolare la concentrazione dell analita nell estratto