Aflatossine Determinazioni rapide. Dr.ssa Lucia Monti CRA-FLC, Settore lattiero-caseario - Lodi (lucia.monti@entecra.it)

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1 Aflatossine Determinazioni rapide Dr.ssa Lucia Monti CRA-FLC, Settore lattiero-caseario - Lodi (lucia.monti@entecra.it)

2 Determinazioni rapide VANTAGGI monitoraggio di un gran numero di campioni contemporaneamente tempi brevi di risposta costi più contenuti personale non specializzato (ma comunque qualificato) possibilità di analisi in-situ SVANTAGGI minore sensibilità e specificità possibilità di falsi positivi o falsi negativi

3 Matrici Mangimi Cereali AFB 1, AFB 2, AFG 1, AFG 2 Latte e derivati AFM 1, AFM 2 (AFB 1, AFB 2 )

4 Tipologie FLUORESCENZA METODI IMMUNOENZIMATICI: FLUORIMETRIA ELISA STRIP/CARD REATTIVE IMMUNOSENSORI SPETTROSCOPIA NIR

5 FLUORESCENZA Esame della granella con luce UV (365 nm) in camera oscura. Fluorescenza giallo-verde è data da acido kojico, un metabolita prodotto da A. flavus, che reagisce con la perossidasi dei tessuti della granella ELEVATA PROBABILITA DI FALSI POSITIVI (il fungo può produrre l acido kojico, ma non le aflatossine); i campioni che presentano fluorescenza si devono analizzare per confermare l eventuale presenza della micotossina NO CORRELAZIONE tra fluorescenza e livello di contaminazione (fluorescenza più evidente in granella danneggiata o rotta, dove la muffa invade l endosperma)

6 STRUMENTO AFLAFLESH: costituito da un nastro trasportatore, lampade a raggi UV, telecamera digitale ad alta risoluzione per la rivelazione degli immagini. Risultato finale espresso sia in numero totale di chicchi contaminati, sia in superficie totale espressa in pixel: possibilità di indicare classi di appartenenza Esame su 5 kg di granella; tempo 10 min.

7 METODI IMMUNOENZIMATICI

8 Anticorpi Policlonali: miscela di anticorpi ottenuti dall immunizzazione di un animale con un antigene; sono prodotti da cellule diverse e riconoscono epitopi diversi dello stesso antigene Monoclonali: sono prodotti da un unica linea cellulare e sono diretti contro un solo epitopo dell'antigene (maggiore specificità) Ricombinanti: prodotti da organismi geneticamente modificati (non molto utilizzato per le aflatossine)

9 Preparazione dei campioni Mangimi e cereali: Riduzione delle dimensioni: triturare e miscelare il campione; pesare la quantità adeguata Estrazione: diluire con un soluzione di estrazione (sz. acqua/metanolo), agitare e filtrare (filtrazione grossolana) Diluizione: diluire un aliquota dell estratto e filtrare (filtrazione più fine) Latte: sgrassato per centrifugazione (t<10 C) Latte in polvere: ricostituito in acqua al 10%

10 Preparazione dei campioni Formaggio molle: estrazione con solventi Triturare e miscelare il campione (eliminare eventuali muffe superficiali); pesare la quantità adeguata Estrazione: aggiungere solvente organico (diclorometano), agitare, filtrare ed evaporare solvente sotto N 2 Risospendere in solvente (metanolo e/o eptano e/o esano) e PBS Centrifugare ed eliminare lo strato superiore di solvente Diluire con tampone la fase inferiore acquosa

11 Preparazione dei campioni Formaggio a pasta dura: digestione enzimatica con pepsina riturare e miscelare il campione; pesare la quantità adeguata strazione: aggiungere una soluzione di pepsina allo 0.2% in 0.1N HCl e incubare a 42 C per 16 ore sotto agitazione entrifugare; recuperare il surnatante e filtrarlo per eliminare il grasso relevare una quota di filtrato e neutralizzarla con 0.5N NaOH (ph 7 7.5)

12 Preparazione dei campioni Panna o burro Pesare il burro o la panna e diluirli (1:5) in metanolo Scaldare fino a fusione del grasso e agitare vigorosamente Centrifugare per 10 a bassa temperatura Prelevare lo strato superiore ed eventualmente filtrarlo Purificazione AFM 1 mediante colonna di immunoaffinità Eluizione dell aflatossina con metanolo Diluizione dell eluato con tampone PBS e dosaggio

13 FLUORIMETRIA Colonnine di immunoaffinità: clean-up step prima di HPLC opp. quantificazione mediante fluorimetro Preparazione del campione Caricamento in colonna Lavaggio con acqua Eluizione con metanolo Addizione di una soluzione di sviluppo in grado di aumentare la fluorescenza delle aflatossine (sz. bromo o iodio) Lettura in un fluorimetro calibrato (λexc = 363 nm, λem =440 nm) Tempo di analisi <30 min + preparazione del campione MATRICI: - mais, riso, mandorle, arachidi Range di det.: ppb (aflatossine totali: B1, B2,G1,G2) - latte: Range di det.: ppt RECUPERI: 80-90%

14 ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay) 1 tipo saggio competitivo diretto Supporto di polistirene Ab specifici per la sostanza da ricercare Antigene contenuto nella soluzione standard o nel campione Antigene legato ad un Ab coniugato ad un enzima Substrato incolore Prodotto colorato Misurazione fotometrica a λ=450 nm

15 ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay) 2 tipo Test immunoenzimatico competitivo Ab-anti aflatossina AF campione o standard AF coniugata all enzima Ab di cattura contro Ab-anti aflatossina Substrato incolore Prodotto colorato Lavaggio di ciò che non ha reagito

16 Dosaggio di tipo qualitativo o semi-quantitativo (presenza/assenza rispetto ad un valore di riferimento) controllo Controllo: standard di aflatossina a 20 ppb Campione:.-più blu, contenuto aflatossina inferiore rispetto al controllo Tempo saggio: 5 min Campione + controllo Campione - -meno blu (maggiore componente rossa), contenuto aflatossine maggiore rispetto al controllo Possibilità di standard a diverse conc., lettura allo spettrofotometro e quantificazione (limite di rilevabilità: 5 ppb)

17 Dosaggio quantitativo (lettura a λ=450 nm con un apposito lettore) Colore sviluppato inversamente proporzionale alla quantità di aflatossina presente nel campione CALCOLO DEI RISULTATI assorbanza dello standard (o dei campioni) B assorbanza del valore massimo B 0 *100= x (%) - il valore massimo di assorbanza (standard a conc=0) viene posto uguale al 100% e gli altri valori sono espressi in percentuale: - curva standard in un sistema di coordinate semi-logaritmiche Log concentrazione (ppt) - in base ai valori di B/B 0 di ciascun campione interpolare le corrispondenti concentrazioni sulla curva di calibrazione. - moltiplicare i valori di concentrazione per il fattore di diluizione applicato. Abs%

18 Limiti di rilevabilità mangimi e cereali: 1/5 ppb latte: 5 ppt latte in polvere: (relativamente al latte ricostituito) 5 ppt, (relativamente al peso in g) 50 ppt formaggio molle (estrazione con solvente) ppt formaggio a pasta dura (metodo enzimatico) 120 ppt burro: 12.5 ppt Tempi di analisi: da 15 a 120 min

19 ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay) Normativa UNI EN ISO 14675/2003 Latte e prodotti del latte: Linee guida per una descrizione normalizzata di prove immuno-enzimatiche competitive - Determinazione del contenuto di aflatossina M 1 Parametri di saggio raccomandati Anticorpi monoclonali o policlonali Saggio immunoenzimatico competitivo Formato: piastra a 96 pozzetti Tempo di saggio: 3-4 ore Concentrazione delle tossina espressa come assorbanza relativa Cross-reattività con AFM 1 : 100%, con altre aflatossine: < 20% Standard in doppio, a 6 o più diluizioni incluso lo zero, con una concentrazione tra 5 e 50 ng/l o più Curva di taratura: modello logistica a quattro parametri opp. cubica; regressione lineare solo nella parte lineare della curva standard

20 Precisione Standard: CV dell assorbanza relativa in condiz. di ripetibilità :<10% CV dell assorbanza relativa in condiz. di riproducibilità :<20% Campioni: limite di ripetibilità: <100ng/kg ad un livello 200 ng/kg (latte in polvere) limite di riproducibilità: <150ng/kg ad un livello 200ng/kg (latte in polvere) limite di rilevabilità: <5 ng/kg (latte) limite di quantificazione: <10ng/kg (latte) Recupero: >80% tra 10 e 50 ng/kg (latte) (correz. per il recupero non necessaria) SENSIBILITA del saggio in funzione di TEMPO E TEMPERATURA (affinità antigene-anticorpo regolata da reazioni termodinamiche) SPECIFICITA (capacità dell anticorpo, in presenza di molecole diverse, di complessare un solo tipo di molecola): condizione soddisfatta da anticorpi monoclonali e da antisieri contro molecole a basso PM PRECISIONE data la non-linearità della curva, letture di assorbanza relativa intorno al 50% danno risultati più precisi

21 Kit ELISA (Progetto Aflarid) Utilizzo del kit ELISA anche per l analisi dei reflui di caseificazione (siero, scotta, latticello), analizzati previa neutralizzazione con NaOH 1N. Le analisi ELISA effettuate da laboratori diversi forniscono dati comparabili su matrici liquide (R 2 = 0,9724), dando buone garanzie di affidabilità della tecnica di screening. Le analisi ELISA hanno fornito risultati comparabili ai dati HPLC. Pratiche di estrazione con solvente si sono rivelate adatte al dosaggio della tossina in campioni di formaggi a pasta molle.

22 l metodo di estrazione con pepsina, ad oggi consigliata solo per formaggi a pasta dura e lunga maturazione, andrebbe approfondita per la verifica della sua efficacia anche per il dosaggio della tossina in altre matrici: ad es., la procedura di estrazione con solvente non sembra sufficiente per determinare un recupero completo della tossina da campioni di mozzarella ed è necessaria la digestione con pepsina per ottenere recuperi prossimi al 100%. (T. M.P Cattaneo, E.V. Panarelli, S. Iametti, A. Pietri, L. Monti. Studio di parametri che possono influire sulle performance di metodi immunochimici per il dosaggio di AFM 1 in matrici casearie. Atti del II Congresso nazionale Le Micotossine nella filiera agro-alimentare Rapporti ISTISAN 07/37 Rev., )

23 Strip/card reattive 1 TIPO: Anticorpo marcato con oro colloidale Membrana assorbente Finestra di lettura Direzione di flusso Anticorpo di controllo Antigene immobilizzato Anticorpo marcato con oro colloidale Applicazione del campione ASSENZA DI AF PRESENZA DI AF 2 TIPO: Rilevazione aflatossina coniugata con enzima Linea di Controllo Linea di Test Test negativo (valore di AF < limite di rilevabilità del metodo) Linea di Controllo Test positivo Se non compare la linea di controllo il test non è valido

24 Strip/card reattive Analisi semi-quantitativa: rivelazione visiva di bande colorate Esempio: Interpretazione dei risultati e relativi tempi di incubazione risultato negativo 20 ppb 10 ppb 4 ppb Banda di controllo* Banda del test dopo 4 (+-) + (+-) (+-) Banda del test dopo 8 (+-) ++ + (+-) Banda del test dopo 16 (+-) * visibile chiaramente dopo 2 minuti +++ = banda intensamente colorata ++ = banda chiaramente visibile + = banda visibile (+-) = banda debole Possibilità di far reagire le strip in condizioni controllate in appositi incubatori Possibilità di leggere le strip con appositi lettori per quantificare il risultato

25 Immunosensori elettrochimici Università di Tor Vergata - Prof. Giuseppe Palleschi Sistema immunoenzimatico competitivo diretto Supporto (elettrodo stampato) rivestito con Ab monoclonali anti-af Competizione tra l AF libera e quella coniugata all enzima (perossidasi) Aggiunta del substrato ( tetrametilbenzidina, TMB)+ H 2 O 2 Rilevazione: l attività della perossidasi, che converte il substrato in un prodotto elettroattivo, è misurata elettrochimicamente I valori di corrente registrati vengono confrontati con quelli dello standard zero senza aflatossina

26 eterminazione su elettrodi usa e getta accoppiati con strumentazione portatile per misure sul campo Rilevazione cronoamperometrica applicando un potenziale di mv Tempo = 75 min Limite di determinazione 25 ppt; range di lavoro tra 30 e 160 ppt Contro-elettrodo di grafite Elettrodo di lavoro di grafite Elettrodo di riferimento d argento L. Micheli, R. Grecco, M. Badea, D. Moscone, G. Palleschi, An electrochemical immunosensor for aflatoxin M1 determination in milk using screen-printed electrodes. Biosensors and Bioelectronics 21 (2005)

27 Sistema elettrochimico multicanale, costituito da una piastra ELISA di tipo competitivo diretto monouso da 96 pozzetti sul cui fondo sono localizzati elettrodi stampati: supporti plastici di 0.5 mm su cui si trovano un elettrodo a carbonio (Ø3 mm) e un elettrodo di riferimento ad Ag/AgCl Sistema di rilevazione: amperometria pulsata intermittente (IPA): a ciascun pozzetto vengono inviati impulsi con potenziale di 100 mv della durata di 10 ms e una frequenza di 5 Hz, alternati a periodi più lunghi in cui la piastra è scollegata dal circuito Range di lavoro pg ml -1 e limite di determinazione 1 pg ml -1. D. Neagu, S. Perrino, L. Micheli, G. Palleschi, D. Moscone Aflatoxin M1 determination and stability study in milk samples using a screen-printed 96-well electrochemical microplate. International Dairy Journal 19 (2009)

28 Determinazione in flusso dell AFM 1 (flow-injection immuno-assay FI-IA) con rilevazione amperometrica Incubazione off-line dell AFM 1, dell Ab anti-afm 1 e dell AFM 1 * coniugata all enzima Iniezione nel sistema I complessi AFM1-Ab e AFM1*-Ab si legano alla proteina G, con elevata affinità per la regione costante delle Ig Eluizione dell antigene marcato con l Ab e misurazione amperometrica dell attività dell enzima (perossidasi) in seguito all ossidazione di un substrato Rilevazione amperometrica Range di concentrazione tra 20 e 500 ppt di AFM 1, limite di determinazione 11 ppt, buona riproducibilità (RSD < 8%), alta produttività (6 campioni in triplo in 1 ora). M. Badea, L. Micheli, M.C. Messia, T. Candigliota, E. Marconi, T. Mottram, M. Velasco-Garcia, D. Moscone, G. Palleschi, Aflatoxin M1 determination in raw milk using a flow-injection immunoassay system, Analytica Chimica Acta 520 (2004)

29 Spettroscopia NIR Near Infra Red Spectroscopy (λ: nm) Consente l analisi di campioni tal quali, senza uso di reagenti chimici Tempo d analisi < 2 min Possibilità di misurare diversi parametri contemporaneamente; Metodo sufficientemente accurato e preciso per l analisi della composizione in macrocostituenti dei prodotti alimentari; possibile dosaggio di costituenti minori Disponibilità di strumentazione portatile per rilevazioni in campo Spettro NIR Pre-processamento dei dati Calibrazione Partial Least Squares Cross-validazione o validazione su set indipendente Predizione: verifica della robustezza della calibrazione

30 NIR-AFB 1 V. Fernández-Ibañez, A. Soldado, A. Martínez-Fernández, B. de la Roza-Delgado. Application of near infrared spectroscopy for rapid detection of aflatoxin B1 in maize and barley as analytical quality assessment. Food Chemistry 113 (2009) Messe in luce le potenzialità della tecnica NIR come tecnica di screening per la determinazione dell AFB 1 in granella di mais e orzo a valori di 20 ppb (152 campioni) No falsi negativi Possibilità di applicare la tecnica on-line Necessità di ampliare il data-set per migliorare l equazione di calibrazione Sono state evidenziate differenze tra gli spettri delle diverse popolazioni di campioni contaminati. Evidenziate bande di assorbimento nell IR riconducibili all infezione fungina e determinate da composti cellulari del fungo.

31 NIR-AFM campioni di prodotti lattiero-caseari (grana, mozzarella, crescenza, caprino, ricotta, panna e burro) a diverso contenuto naturale di AFM 1 : lettura in capsula Petri, in trasmittanza ad una λ da 850 a 1050 nm, ogni 2 nm per un totale di 100 punti per spettro. Confronto dati spettrali - dati ELISA Costruzione di curve di calibrazione suddividendo i campioni in 3 set: Formaggi freschi (80), Formaggi a lunga stagionatura (37), Prodotti a elevato contenuto lipidico (23) Valori di coefficiente di regressione lineare ( R ) sempre superiori a 0.90, valori di slope sempre superiori a 0.75, errori standard in calibrazione (RMSEC%) compresi tra 7 e 11%, errori standard in validazione (RMSECV%) contenuti tra 12 e 16% per i formaggi freschi e comunque inferiori al 20% per le altre categorie di prodotto Analisi qualitativa PLSDR sul campione formaggi freschi, suddividendo i campioni in due categorie in funzione della concentrazione di AFM1 (> o < 200 ppt): buone potenzialità di classificazione con potere discriminante pari al 90%. Cattaneo T.M.P., Panarelli E.V., Barzaghi S., Giangiacomo R., Dosaggio di Aflatossina M1 in prodotti caseari mediante spettroscopia nel vicino infrarosso (NIR). Atti del VI Congresso Nazionale di Chimica degli alimenti. A cura di J.D. Coïsson, M. Arlorio, A. Martelli. Ed. Taro (Alessandria), (2007).

32 Correlazione dati NIR- CE (elettroforesi capillare) usando i valori dell area del picco dell as 1 -I-caseina come variabile: determinazione indiretta della presenza di AFM 1 in funzione dell attività proteolitica nei formaggi contaminati. Cattaneo T.M.P., Cabassi G., Panarelli E.V., Giangiacomo R., Why does NIT discriminate Quark type cheese manufactured in the presence or absence of aflatoxin M1 (AFM1)? J. Near Infrared Spectrosc. 16 (3) , 2008

33 Per la sicurezza degli operatori del laboratorio.. Evitare il contatto del reagente con la cute: indossare indumenti protettivi, inclusi guanti in lattice, e camici. Indossare mascherina e occhiali protettivi. Decontaminare la vetreria e le soluzioni contenenti le tossine con una soluzione di ipoclorito di sodio per una notte e sciacquare con abbondante acqua distillata.