Riproduzione e ciclo cellulare

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1 CAPITOLO 7 Riproduzione e ciclo cellulare Gli organismi pluricellulari complessi, come l essere umano, sono formati da miliardi di cellule diverse che svolgono funzioni specifiche: difendono da agenti patogeni, assorbono gli elementi nutritivi, trasportano l ossigeno, sviluppano i nostri pensieri ed altro ancora. Eppure esse derivano tutte da un unica cellula, lo zigote o cellula uovo fecondata. Durante lo sviluppo embrionale, a partire dallo zigote, si generano tutte le cellule che costituiscono i diversi tessuti e caratterizzano un organismo vivente. Due processi sono fondamentali per far sì che da una singola cellula (zigote) si sviluppi un organismo completo: I) la singola cellula deve crescere e dividersi per dare origine a più cellule; II) le cellule che da essa originano devono acquisire via via delle proprietà peculiari, trascrivendo specifici geni che le portino a formare i vari tessuti dell organismo. Questi due processi sono conosciuti come il ciclo cellulare ed il differenziamento cellulare. Durante gli anni 90 si è compreso che un terzo processo svolge un ruolo importante nell omeostasi tissutale: la morte cellulare. Ciclo, differenziamento e morte cellulare, complessivamente, determinano lo stato proliferativo di una cellula e quindi di un tessuto; il governo vigile di tali opzioni regola la crescita armoniosa degli organismi pluricellulari. odificazioni che provochino malfunzionamenti in uno di questi processi sono alla base dell aumentato potenziale proliferativo delle cellule che ha come conseguenza diretta lo sviluppo di neoplasie. Divisione cellulare Prima di descrivere i diversi modi attraverso i quali una cellula può dare origine a delle cellule figlie, bisogna considerare che negli organismi unicellulari la divisione cellulare corrisponde alla riproduzione dell intero organismo; negli organismi pluricellulari, invece, la divisione cellulare è prerogativa per la determinazione, l accrescimento e l omeostasi dei diversi tessuti. Gli organismi unicellulari più semplici, i procarioti, si dividono per scissione (vedi Capitolo 8). La cellula aumenta di dimensioni, replica il DNA e successivamente si divide dando vita a due cellule figlie. Il cromosoma batterico, circolare ed associato alla membrana plasmatica, si replica e le due nuove molecole di DNA si separano una dall altra mentre la cellula si allunga (Figura 7.1). Alla fine, nella zona equatoriale della cellula, a partire dalla membrana plasmatica, si formerà una strozzatura che progressivamente si accentuerà fino a scindere la cellula nelle due cellule figlie. 333

2 La divisione cellulare nei batteri può essere un processo assai rapido e durare meno di 30 minuti, di contro negli eucarioti essa è più complessa e ne esistono due tipi: mitosi e meiosi. Negli eucarioti superiori tutte le cellule della linea somatica e quelle della germinale non differenziate (ovogoni e spermatogoni) si dividono per mitosi, mentre la meiosi è un processo che interessa esclusivamente la linea germinale ed in particolare quelle cellule che hanno iniziato lo specifico percorso differenziativo (ovociti I e spermatociti I). La mitosi negli organismi pluricellulari è fondamentale per la formazione dei tessuti e per l omeostasi tissutale. Durante la mitosi, il patrimonio genetico viene fedelmente replicato ed equamente ripartito tra le cellule figlie. Al termine della meiosi, invece, il patrimonio genetico delle cellule figlie è diverso per due motivi: I) il patrimonio cromosomico risulta dimezzato da diploide (2n) ad aploide (n). Con il termine ploidia si indica il numero delle serie di cromosomi delle cellule di un organismo: le cellule diploidi possiedono coppie di cromosomi omologhi (2n); mentre le cellule aploidi hanno un solo set di cromosomi (n); II) attraverso processi di ricombinazione omologa si aumenta la variabilità del patrimonio genetico. Citoplasma DNA Avviene la replicazione del DNA Parete batterica embrana plasmatica I due genomi si allontanano, la cellula si allunga e si incomincia a vedere una strozzatura: inizio della scissione nella zona centrale Ciclo cellulare Le cellule eucariotiche riproducono se stesse grazie ad una serie ordinata di eventi che, invariabilmente, ad ogni divisione cellulare si ripetono con la medesima sequenza e che termineranno, nella maggior parte dei casi, con una mitosi o, nel caso delle cellule germinali, con una meiosi. Tale ordine, come vedremo, è stato rigorosamente conservato nel corso dell evoluzione. Questa sequenza ordinata di eventi sfocia nella riproduzione delle cellule ed è stata denominata ciclo cellulare. Lo scopo del ciclo cellulare è quello di generare due cellule figlie con lo stesso patrimonio cromosomico della cellula madre, copie quasi fedeli di questa: infatti il DNA duplicato sarà copia fedele, il citoplasma e gli organuli cellulari, poi, saranno equamente (ma non sempre) redistribuiti tra le due cellule figlie. Durante il ciclo cellulare la cellula svolge molte attività: si muove, cresce in dimensioni, produce ATP, sintetizza lipidi e proteine, ripara il DNA ecc ecc., ma tre eventi sono fondamentali affinché la cellula possa dividersi; essa deve: 1) replicare il DNA; 2) prepararsi alla divisione, modificando in modo appropriato i propri organuli ed il proprio genoma (frammentazione degli organuli e compattamento del DNA); 3) separare fisicamente in due parti il citoplasma attraverso un processo denominato citodieresi. FIGURA 7.1 La scissione è terminata: si sono formate le due cellule figlie Divisione per scissione di un batterio. Differenti fasi del ciclo cellulare Se osservassimo al microscopio ottico un fibroblasto umano in coltura, in presenza degli appropriati nutrienti e di idonei fattori di crescita, con particolare dedizione e per un periodo continuo di 24 ore, ci accorgeremmo di un radicale cambiamento che coinvolge l organizzazione generale della cellula. Ad un certo momento la cellula si arrotonda, il nucleo si disgrega, i cromosomi diventano visibili, la cellula si solleva dal substrato d adesione, si allunga e, infine, si divide dando origine a due cellule. Questi cambiamenti, descritti collettivamente con il termine di mitosi (dal Greco mitos = filo, con riferimento alle strutture compattate ma filiformi dei cromosomi), sono, seppur radicali, reversibili e di breve durata (circa un ora). I primi biologi cellulari, studiando la crescita delle cellule dal vivo, osservavano principalmente la fase della mitosi (fase ). 334 Capitolo 7 Riproduzione e ciclo cellulare

3 INTERFASE FIGURA 7.2 Il ciclo cellulare rappresentato come un alternanza di mitosi ed interfase. Il lungo periodo che separa una mitosi dalla successiva è invece definito interfase, in quanto rappresenta il tempo che separa due fasi mitotiche (Figura 7.2). Durante l interfase la cellula deve crescere di dimensioni, deve replicare il DNA e deve monitorare l integrità del genoma, controllare cioè che il DNA non abbia accumulato un eccessivo numero di mutazioni. Tutto questo avviene senza che si osservi alcun cambiamento drastico nell organizzazione generale della cellula. Con il progredire degli studi è emerso che molte di queste attività cellulari che si osservano durante l interfase avvengono in modo ordinato e sequenziale. La replicazione del DNA ha luogo durante un periodo limitato dell interfase noto come fase S, di sintesi del DNA. Questa fase è separata da quelle adiacenti da due intervalli di tempo detti, rispettivamente, fase G 1 e G 2 (dall Inglese gap, che significa intervallo); la durata di queste due fasi può variare ampiamente nei diversi tipi cellulari (Figura 7.3). Vediamo quale ruolo esercitano gli intervalli (G 1 e G 2 ): durante questi due momenti la cellula integra le informazioni che riceve dall ambiente esterno (ad esempio, l arrivo di segnali che possono essere dei fattori di crescita, soprattutto in G 1 ) ed interno (informazioni circa la fedeltà della replicazione del DNA, in G 2 ) e verifica che tutte le condizioni richieste per la formazione di due nuove cellule siano state soddisfatte. Queste fasi rappresentano momenti decisionali fondamentali per la cellula; a conferma di ciò, come condizione estrema e se le condizioni richieste non sono state soddisfatte, il ciclo cellulare può essere bloccato nelle fasi G 1 e G 2. Le cellule umane più comunemente usate per lo studio del ciclo cellulare sono stati i fibroblasti, il cui ciclo dura approssimativamente 24 ore. In altri eucarioti più semplici, come il lievito, il ciclo cellulare è decisamente più rapido e si completa in circa 2 ore. Nelle cellule umane 8-10 ore sono necessarie per la replicazione del DNA (fase S), la fase è sempre relativamente breve (all incirca 1 ora), la fase G 1 dura mediamente 9-11 ore, mentre altre 4 ore sono richieste per la fase G 2. Come si è detto precedentemente, la durata delle fasi può variare notevolmente nei diversi tipi cellulari. Nelle fasi iniziali dello sviluppo embrionale, ad esempio, il ciclo è molto rapido ed in alcuni organismi si stenta a distinguere le fasi G 1 e G 2. Si osservano rapide alternanze di fasi e fasi S anche perché molte delle macromolecole necessarie per la costruzione delle nuove strutture cellulari sono state già accumulate dalla cellula uovo (vedi Capitoli 8 e 9). Ciclo cellulare nei tessuti adulti Durante la fase G 1 la cellula integra i segnali che riceve dall ambiente esterno e decide se replicare il proprio DNA. Allorquando viene replicato il DNA, non è più possibile evitare la mitosi, quindi è nella fase G 1 che viene deciso se duplicare o meno una cellula. Negli organismi pluricellulari, come l uomo, alcune cellule prolungano enormemente la durata della fase G 1, perché non sono presenti i segnali idonei a far partire la proliferazione oppure perché la cellula si è estremamente specializzata (differenziata) e in quel particolare tessuto non è richiesta un ulteriore crescita. Quando la cellula non si divide per un periodo di tempo piuttosto lungo, si dice che è uscita dal ciclo cellulare (Figura 7.3) e si trova in una nuova fase chiamata fase G 0 (G-zero). Alcune cellule del nostro organismo, quali i neuroni e le cellule muscolari, stazionano per tutta la loro vita nella fase G 0. Altri tipi cellulari, quali ad esempio gli epatociti oppure i fibroblasti, restano per lunghi periodi in fase G 0, ma possono rientrare nel ciclo. Questo è il motivo per cui il fegato può, in particolari condizioni, rigenerare ed i fibroblasti sono coinvolti nei fenomeni di cicatrizzazione delle ferite. Altri tessuti, invece, sono sottoposti a continuo rinnovo, come avviene nel sistema ematopoietico, l epidermide e molti epiteli (ad esempio quello che riveste l intestino). In questi tessuti, molto dinamici in termini di popolazioni cellulari, si osserva un incessante rinnovo per tutta la vita dell organismo (Figura 7.4). Per mantenere l omeo- G 0 Punto di restrizione G1 Figura 7.3 Le diverse fasi del ciclo cellulare. Alla fase G 1 segue la fase S di sintesi del DNA, alla quale succede la fase G 2. Il ciclo termina con la mitosi e la separazione in due della cellula (citodieresi). Il punto di restrizione in G 1 o START, nel lievito, è un momento decisionale molto importante prima del quale la cellula sceglie se dividersi ed entrare in fase S oppure se uscire dal ciclo per entrare in uno stato di non proliferazione denominato fase G 0 del ciclo cellulare o quiescenza. S G2 Ciclo cellulare 335

4 stasi tissutale, da un lato alcune cellule si dividono mentre, all altro estremo, altre cellule muoiono per apoptosi (vedi in seguito). Le cellule che si dividono in continuazione sono le cosiddette staminali, cellule indifferenziate che, dividendosi, danno origine a cellule figlie che potranno iniziare un percorso differenziativo specifico per un dato tipo di tessuto. Una caratteristica del ciclo cellulare delle cellule staminali è la sua asimmetria; la mitosi di una cellula staminale genera infatti due cellule figlie che hanno a disposizione due alternative: possono rimanere cellule staminali oppure possono intraprendere la strada che le porterà a differenziarsi ed, alla fine, ad uscire dal ciclo ed eventualmente morire. Cosa determini il destino di una cellula è ancora argomento di intenso studio ed il dibattito resta vivace, anche se vi sono alcune osservazioni che indicano nell ambiente extracellulare il responsabile di tale destino. Questo concetto risulta più chiaro se facciamo riferimento alle cellule staminali che si trovano nello strato basale dell epidermide, in diretto contatto con la lamina basale. In tale tessuto solo una delle due cellule figlie generate dalla mitosi di una staminale mantiene i contatti con la lamina basale. È proprio questa cellula che conserva le proprietà staminali (Figura 7.5). A tal proposito, è stato dimostrato che, anche quando vengono perdute le caratteristiche staminali perché ha inizio un percorso differenziativo, la cellula può ancora dividersi ma, a differenza della staminale, il numero di divisioni sarà limitato nel tempo. etodiche per l analisi del ciclo cellulare Il ciclo cellulare potrebbe essere descritto anche come un alternanza di cambiamenti nella ploidia cellulare. Le cellule somatiche umane, per esempio, sono diploidi ed hanno un patrimonio di 46 (2n) cromosomi corrispondente a 23 (n) coppie di cromosomi omologhi (parzialmente omologhi nel maschio, XY). Nelle cellule umane esistono due coppie per ogni gene, ad eccezione dei geni presenti sul cromosoma X nelle cellule maschili. Più precisamente, le cellule nella fase G 1 sono diploidi (2n), mentre già con la fase S, quando avviene la sintesi del DNA, avremo una situazione eterogenea a seconda se la cellula si trova all inizio o alla fine di tale fase, ma invariabilmente si passerà da una certa quantità di DNA al doppio di essa per cui nella fase G 2 il genoma sarà tetraploide (4n). Questo DNA sarà suddiviso nella successiva fase di mitosi tra le due cellule figlie nuovamente diploidi. Le variazioni nel contenuto del DNA possono essere sfruttate per determinare in quale fase del ciclo si trova una cellula. Esistono dei coloranti fluorescenti che legano il DNA, proporzionalmente alla sua quantità, e permettono quindi di valutare la sua concentrazione in una cellula. Le cellule vengono trattate con i coloranti e poi analizzate grazie ad una particolare apparecchiatura, il citofluorimetro, ottenendo delle rappresentazioni del ciclo cellulare come quella rappresentata in Figura 7.6. che muoiono che si differenziano che si dividono Lamina basale FIGURA 7.4 Esempio di un tessuto ad elevato ricambio come, ad esempio, la nostra pelle. nello strato più a contatto con la lamina basale sono in attiva proliferazione e si dividono continuamente. Negli strati superiori si consolida il programma differenziativo, mentre negli strati apicali le cellule infarcite di cheratina e proteine accessorie svolgono un azione protettiva che terminerà con la loro morte ed il distacco. Lamina basale staminale FIGURA 7.5 Numero di cellule staminale itosi asimmetrica CELLULA ADRE che inizia il differenziamento CELLULE FIGLIE differenziata Esempio di mitosi asimmetrica in una cellula staminale. 2n 4n G 1 S G 2 Contenuto di DNA (intensità della fluorescenza) FIGURA 7.6 Analisi della quantità (n) di DNA in una popolazione cellulare mediante citofluorimetria dopo colorazione con ioduro di propidio. In ascissa è rappresentato il contenuto di DNA, mentre in ordinata il numero di cellule. Nella fase G 1 la quantità di DNA è pari a 2n, in G 2 è pari a 4n, mentre in S è eterogenea variando da 2n a 4n. 336 Capitolo 7 Riproduzione e ciclo cellulare

5 Un altra importante metodica, che ha permesso di definire la posizione nel ciclo cellulare di una singola cellula e la durata delle diverse fasi, si basa sull uso di derivati radioattivi delle basi dei nucleotidi del DNA (usando, ad esempio, una timina dove al posto di alcuni atomi d idrogeno era inserito tritio) oppure degli analoghi delle basi evidenziabili poi con un anticorpo specifico (largamente utilizzata è la 5- bromo-desossiuridina, un analogo delle timina). Le cellule vengono fatte crescere in presenza di questi traccianti della replicazione al fine di individuare quali e quante sono quelle che stanno attraversando la fase S. Regolazione del ciclo cellulare Alcuni sistemi, definibili come veri e propri controlli di qualità, verificano il passaggio attraverso le diverse fasi che contraddistinguono il ciclo cellulare. Infatti è fondamentale sottolineare che il passaggio da una fase all altra non è un evento automatico, anzi la transizione tra le diverse fasi è sottoposta a continue verifiche per essere sicuri che le procedure caratteristiche di ciascuna fase siano state completate (ad esempio, in fase S la replicazione del DNA). È richiesto che ogni fase sia correttamente terminata affinché la successiva possa essere avviata, quindi, durante il ciclo, la cellula è sempre sotto esame. a più che di esame dovremmo parlare di autocertificazione perché essa stessa effettua le verifiche. Queste verifiche sono denominate checkpoint o punti di controllo del ciclo cellulare (Figura 7.7). Il sistema dei checkpoint opera affinché le diverse fasi si attivino in sequenza temporale ordinata; sono tre i checkpoint del ciclo cellulare che sono stati studiati più in dettaglio: I) il checkpoint che controlla l ingresso nella fase S (transizione G 1 S S). Questo controlla che il DNA sia integro, che vi siano gli elementi nutritivi necessari per la crescita cellulare e, soprattutto negli organismi pluricellulari, che nell ambiente extracellulare vi siano i fattori di crescita idonei. Il non superamento di questo checkpoint provoca l uscita delle cellule dal ciclo, anche per periodi di tempo particolarmente lunghi; una permanenza prolungata fuori dal ciclo è descritta come fase G 0 o quiescenza cellulare. II) il checkpoint che controlla l ingresso nella fase (transizione G 2 S ). A questo punto la cellula controlla che il DNA non abbia subìto danni o mutazioni; tale controllo impedisce ad una cellula, che non abbia completato correttamente la duplicazione del DNA, di proseguire con la mitosi. III) il checkpoint che controlla il completamento della fase (metafase S citodieresi). Il checkpoint mitotico opera affinché sia controllata la progressione della mitosi; in questo modo è verificata l interazione tra le fibre del G 0 -Integrità DNA -Segnali esterni -Nutrienti G 1 G 2 fuso mitotico ed i diversi cromosomi, ed il loro corretto allineamento nella zona equatoriale della cellula (Figura 7.7). Qualora non siano soddisfatti i requisiti richiesti, la progressione del ciclo cellulare può essere bloccata ai vari punti di controllo. Il blocco è garantito dall interazione degli elementi molecolari che costituiscono il checkpoint, di cui parleremo brevemente in seguito, con il macchinario che controlla la progressione del ciclo cellulare. Come vedremo nei successivi paragrafi, la scoperta del macchinario che controlla il ciclo cellulare e la comprensione della sua regolazione furono possibili grazie al lavoro febbrile svolto in molti laboratori sparsi in varie regioni del mondo. La sua scoperta è stata una tappa fondamentale nell avanzamento delle nostre conoscenze nell ambito biomedico con implicazioni essenziali per la comprensione dei meccanismi molecolari che sono alla base della trasformazione tumorale. L interruttore che controlla il ciclo cellulare Come sono orchestrati i cambiamenti di una cellula quando entra in mitosi? Chi decide se il DNA deve essere replicato? Come fa la cellula a scegliere se uscire dal ciclo cellulare ed entrare nella fase G 0 o proseguire verso la fase S? Infine, perché molte cellule tumorali non riescono più ad arrestare il ciclo cellulare e si dividono in continuazione? Tutte queste domande sono sorte spontanee ai primi ricercatori che studiavano e descrivevano il ciclo cellulare. Ci si rese conto fin dal principio che, per rispondere a queste domande, era di fondamentale importanza identificare quale macchinario molecolare controllasse il ciclo cellulare; tra i ricercatori era forte la convinzione che la definizione di tali problematiche avrebbe fornito un contribuito fondamentale per comprendere le basi molecolari del cancro. I primi passi in questa direzione furono compiuti all inizio degli anni 70, grazie ad esperimenti basati sulla fusione di cellule in diverse fasi del ciclo cellulare. Come rappresentato nella Figura 7.8 è possibile fondere le mem- S -Fuso mitotico -Integrità DNA replicato FIGURA 7.7 I diversi checkpoint (punti di controllo) che agiscono durante il ciclo cellulare. Ciclo cellulare 337