Questi virus replicano mediante un intermedio a DNA grazie alla capacità di codificare per un enzima noto come Trascrittasi Inversa,

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1 HIV human immunodeficiency virus

2 I retrovirus sono virus ad RNA a singolo filamento a polarità positiva, dotati di envelope con una struttura ed una composizione di base molto simile tra loro. Questi virus replicano mediante un intermedio a DNA grazie alla capacità di codificare per un enzima noto come Trascrittasi Inversa, Tale enzima copia l RNA genomico in un DNA a doppio filamento che successivamente si integra in un cromosoma della cellula ospite. La trascrittasi inversa è stata scoperta nel 1970 da Baltimore D. e Temin H. (Nobel per la Medicina). Esistono due gruppi principali di retrovirus che infettano l uomo: Oncoretrovirus (correlati a tumori) Lentivirus Molti gruppi di retrovirus infettano gli animali, ma sequenze di retrovirus endogeni sono state identificate lungo tutto il genoma umano. Come la maggior parte dei virus rivestiti sono estremamente sensibili ai fattori che alterano la tensione superficiale e si trasmettono mediante contatto stretto con le fonti di infezione, come fluidi corporei, sangue ed emoderivati.

3 I lentivirus sono dei retrovirus responsabili di malattie neurologiche e immunologiche che si manifestano dopo un lungo periodo di incubazione; Infettano cellule linfoidi ed hanno una spiccata propensione a replicare nei macrofagi; I lentivirus possono persistere nell ospite infetto apparentemente per lunghi periodi di tempo in uno stato di latenza clinica; Nel tempo il virus diviene altamente citopatico causa la morte delle cellule infette e facilita l infezione a quelle non infette che condurrà lentamente ad una drastica immuno-deplezione dell ospite; I lentivirus patogeni per l uomo sono rappresentati dai virus responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita, Acquired Immuno- Deficiency Syndrome AIDS; Di questi il più rappresentativo è HIV human immunodeficiency virus; Sono noti due tipi di HIV denominati HIV-1 e 2 che sono distinguibili sulla base della loro organizzazione genetica e sulle relazioni genetiche con altri lentivirus che colpiscono i primati;

4 L HIV è un virus che mostra una notevole variabilità genetica e fenotipica causata da mutazioni puntiformi, riarrangiamenti o ricombinazioni genetiche. Dall analisi della sequenza nucleotidica del genoma di diversi virus sono stati identificati due sierotipi: HIV-1 e HIV-2 classificati in base a criteri filogenetici HIV-1 comprende 3 gruppi: Classificazione Gruppo M-Major; Gruppo N-New e Gruppo O-Outlier. I gruppi O e N sono i principali responsabili di malattie in Africa centrooccidentale, il gruppo M è il principale responsabile di malattia in tutto il mondo ed è suddiviso in 11 sottotipi o clades indicati da A a K. Analisi di omologia di sequenza del gene env (responsabile della sintesi delle spicole glicoproteiche) hanno evidenziato fino al 25-35% di divergenza tra i diversi sottotipi. Diversi studi suggeriscono che alcuni sottotipi possono essere associati ad un aumentato rischio di trasmissione e di progressione più veloce allo sviluppo dell AIDS.

5 A causa di epidemie e superinfezioni i ceppi di HIV-1 possono ricombinare e formare virus a mosaico, detti Forme Ricombinanti Circolanti CRF con una spiccata capacità replicativa e adattabilità all ospite. Anche HIV-2 comprende 6 distinte linee filogenetiche denominate con le lettere da A a F. HIV-1 e HIV-2 divergono per il 55-60%; La loro struttura genetica è pressocché identica ma si differenziano per un gene ausiliare vpu in HIV 1 e vpx in HIV-2. Entrambi i tipi di HIV riconoscono il recettore CD4 e i co-recettori CCR5 e CXCR4 per entrare nelle cellule. HIV-1 è responsabile di pandemia in tutto il mondo HIV-2 è confinato all Africa occidentale. HIV-1 è più aggressivo e virulento, la malattia da HIV-2 è più lenta con una progressione prolungata nel tempo, una bassa carica virale e trasmissibilità. L ospite naturale di HIV non è l uomo ma molto probabilmente questi virus sono l effetto di una zoonosi.

6 Epidemiologia L AIDS è stato identificato negli USA per la prima volta nel 1981, in seguito alla comparsa di un insolito numero di casi di un raro tumore cutaneo, il sarcoma di Kaposi e di infezioni opportunistiche in maschi omosessuali. I pazienti avevano una netta riduzione del numero di Linfociti T CD4+ e sviluppavano infezioni opportunistiche normalmente tenute sotto controllo da un sistema immunitario immunocompetente. La malattia, inizialmente identificata in omosessuali, soggetti emofiliaci e persone che utilizzavano droga da iniezione, portava inesorabilmente alla morte. Studi retrospettivi indicarono poi che il virus HIV-1 circolava in Africa già negli anni 50 e negli USA negli anni 70. Nel 1985 è stato identificato un secondo virus in grado di determinare l AIDS denominato appunto HIV-2, inizialmente endemico solo in Africa occidentale, attualmente casi di malattia da HIV-2 sono stati registrati nell emisfero occidentale. Alla fine del 2007 più di 33 milioni di persone risultavano infette da HIV nel mondo, con 2,5 milioni di nuove infezioni e 2,1 milioni di persone morte per AIDS nel 2007

7 Struttura di HIV HIV ha una forma sferica con un diametro di nm, rivestito da envelope che circonda un capside di forma conica. L Envelope presenta delle spicole costituite da due proteine gp120 e gp41, la prima con funzione di antirecettore la seconda con funzioni fusogene. Ogni peplomero o spicola è formato da 4 eterodimeri in cui la proteina gp120 lega con la sua estremità C-ter l estremità N-ter di gp41. Associato all Envelope verso il capside c è una matrice proteica costituita dalla proteina p17. Tale proteina è soggetta ad una modifica post-traduzionale definita meristilazione, ovvero l aggiunta di una molecola di acido meristilico a residui della porzione N-ter. Tale struttura è coinvolta nel montaggio delle glicoproteine dell envelope nella costituzione del virione durante la fase di gemmazione. Il capside ha una struttura a cono con un diametro inferiore di 60nm e superiore di 20nm ed è costituito dalla proteina p24.

8 Antirecettore Fusogena Miristilazione Peplomero C-ter di gp120 lega L N-ter di gp41 Strutture a tronco di cono P17 proteina di matrice

9 Struttura di HIV Il virione maturo contiene tutto il materiale utile alla replicazione virale: Due copie identiche di RNA a singola catena a polarità positiva ssrna+, legate a due proteine basiche denominate p7 e p6; Molecole di trna utilizzate come innesco per la Trascrittasi Inversa; La Trascrittasi inversa RT, coinvolta nella replicazione virale; L integrasi IN, coinvolta nell integrazione del DNA virale nel genoma della cellula ospite; La proteasi PR coinvolta nella maturazione del virione.

10 Struttura di HIV Tale complesso costituito da acidi nucleici ed enzimi è contenuto in una sezione centrale della particella virale denominata CORE

11 Genoma di HIV Come tutti i retrovirus HIV possiede i tre geni fondamentali per la sua replicazione, nell ordine: Gag, Pol ed Env. Gag (Group-specific Antigen) codifica per le proteine strutturali interne del virus: capside, nucleocapside e matrice (in alcuni retrovirus animali la prteasi; Da Pol (Polymerase) derivano la trascrittasi inversa, la proteasi e l'integrasi; Env (Envelope) codifica per le proteine dell'involucro esterno: la gp120 SU e la gp41 TM. Rispetto ad altri retrovirus HIV ha un organizzazione più complessa poiché contiene una serie di geni accessori a cui espressione dipende da fenomeni di splicing dell mrna e porta alla produzione di proteine regolatrici o accessorie durante l infezione

12 Genoma di HIV

13 Genoma di HIV Le due molecole di ssrna a polarità positiva di HIV sono poliadenilate all estremità 3 come negli mrna eucariotici, per effetto di una modifica post-trascrizionale che avviene a opera dei sistemi presenti nella cellula ospite. Inoltre all estremità 5 viene aggiunto un gruppo Cap dal sistema di trascrizione cellulare. I due genomi sono, inoltre, tenuti insieme da sequenze complementari associate all estremità 5 della molecola. L RNA di HIV è caratterizzato all estremità da sequenze ripetute R coinvolte nella retro-trascrizione e sequenze uniche U5 e U3, situate all estremità 5 e 3 delle due molecole di RNA. Tali sequenze durante la retro-trascrizione sono trascritte ad ambedue i lati, formando sequenze identiche U3-R-U5 definite long terminal repeat LTR localizzate ai lati del DNA provirale.

14 Genoma di HIV 2 molecole di RNA a singola catena a polarità positiva Coda di polia CAP 7metil-guanilato R sequenze ripetute U3 e U5 sequenze uniche LTR-Long Terminal Repeat: sono sequenze non codificanti e altamente conservate contenenti informazioni essenziali per l inserzione del DNA virale nel genoma della cellula ospite.

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16 LTR Long Terminal Repeat La regione U3 della LTR a monte del DNA provirale contiene segnali necessari alla trascrizione del DNA provirale, In particolare contiene una TATA box ed una CAT box, La TATA box è la sequenza promotrice per la trascrizione, la CAT box è una sequenza di regolazione della trascrizione. Le regioni R ed U5 all estremità 3 contengono segnali di terminazione. A monte della LTR al 5 si trova la sequenza PBS, Primer Binding Site, complementare all estremità 3 del trna che funge da primer. Il genoma di HIV oltre ai 3 geni strutturali in direzione 5-3 : gag, pol, ed env, possiede anche 6 geni regolatori e con funzioni accessorie,

17 LTR Long Terminal Repeat

18 I geni gag, pol ed env sono trascritti e tradotti in poliproteine che sono scisse in proteine funzionali. Il precursore proteico espresso da gag p55 viene scisso in: p17, p24 e p15. p17 costituisce la proteina di matrice, p24 la proteina del capside Il gene Gag p15 è scissa in p7, p6, p2 e p1 che formano legami con l RNA

19 Il gene pol Dal precursore del gene pol si ottengono per scissione: La trascrittasi inversa/ribonucleasi H (RT/RNasi H); La proteasi PR; L integrasi IN. La trascrittasi inversa è un eterodimero formato da due polipeptidi p66 e p51, è una DNA polimerasi-rna dipendente, richiede ioni Mg 2+ e un tratto di RNA a doppio filamento come primer, rappresentato dal trna complementare al PBS. Il prodotto della RT è un ibrido RNA/DNA, che va incontro a degradazione dell RNA mediante l attività della RNasi H, liberando così il DNA provirale.

20 La trascrittasi inversa ha una peculiare struttura a forma di mano in cui le due sub unità p51 e p66 interagiscono costituendo il pollice, il palmo e le dita con il sito catalitico altamente conservato in una porzione di p66 che costituisce il palmo. La RT pol durante la sua attività causa un elevato numero di errori che determinano: La elevata variabilità genetica di HIV; La variabilità nella resistenza ai farmaci retrovirali; Sotto la pressione selettiva del sistema immunitario dell ospite è responsabile dell accumulo di varianti virali nell ospite stesso.

21 La Proteasi PR Un ruolo fondamentale nell assemblaggio dei virioni è svolto dalla Proteasi PR: la proteina di 99aa coinvolta nella scissione delle poliproteine prodotte da gag, pol ed env; Tale molecola è prodotta come un dimero ed è attivata da un taglio auto-catalitico; La Proteasi retrovirale ha una tipica sequenza Asp-Thr-Ser-Gly comune al sito attivo delle proteasi cellulari Il mancato funzionamento della Proteasi impedisce il taglio delle poliproteine nella fase di maturazione del virus questo causa virioni con proteine non funzionanti che non hanno potere infettivo; Oggi gli inibitori della proteasi sono importanti farmaci antiretrovirali poiché bloccano il potere infettivo dei virioni.

22 L Integrasi IN L integrasi IN è un endonucleasi di 288 aa codificata dalla porzione 3 del gene pol; E coinvolta nell integrazione del genoma virale in quello della cellula ospite mediante attività di taglio e di congiunzione; IN funziona in forma dimerica ed è costituita da tre domini: 1. Il dominio N-ter necessario per la dimerizzazione e per il legame con lo zinco indispensabile per l attività enzimatica; 2. il dominio centrale con una triade amminoacidica altamente conservata con funzione di sito attivo; 3. il dominio C-ter coinvolto nel legame al DNA della cellula ospite. Gli inibitori della IN sono importanti farmaci retrovirali il loro sviluppo è ancora oggetto di ricerche ed ha richiesto molti anni. L integrazione è specifica nelle regioni LTR del virus ma casuale nel genoma cellulare

23 Il gene env Il precursore codificato da env è il polipeptide gp160 scisso nelle due glicoproteine gp120 detto subunità SU posizionata sull envelope e gp40 detta TM che rappresenta la porzione transmembrana delle spicole. gp120 e gp40 40 sono responsabili del legame a CD4 localizzato sulla membrana plasmatica dei linfociti T CD4+, macrofagi, monociti e cellule dendritiche. L attacco avviene tra gp120 e CD4 mentre gp40 ha funzioni fusogene. gp120 è coinvolta anche nel legame con i corecettori ed ha una porzione altamente variabile responsabile del tropismo cellulare e del legame ai co-recettori.

24 Geni regolatori Il genoma di HIV contiene 6 geni con funzioni regolatorie o accessorie che sono: tat; rev; nef; vpr; vpu e vif. La loro sequenza è localizzata a monte e a valle del gene env.

25 Geni regolatori Il gene tat (Trans Activator of Transcription) codifica per una proteina di 86 aa a funzione nucleare che agisce da attivatore trascrizionale del genoma provirale, favorendo la RNApol II cellulare, Può essere rilasciata dalle cellule infette e transattivare cellule non infette, È una proteina particolare in grado di legare l'rna, cosa non convenzionale, dal momento che la maggior parte dei transattivatori lega il DNA. Tat lega una piccola struttura a stem-loop, conosciuta col nome di transactivation responsive element (TAR), localizzata all'estremità 5' dell'rna di HIV. E coinvolta nell apoptosi e nella deplezione dei linfociti T CD4+. Il gene rev (Regulator of Virion Expression) codifica per una nucleoproteina coinvolta nel trasporto degli RNA virali, come Tat lega segnali cellulari ed è indispensabile alla replicazione virale. Rimane localizzata nel nucleo della cellula infetta e promuove il trasporto degli mrna virali.

26 Geni regolatori Il gene nef (Negative Expression Regulatory Factor) codifica per una fosfoproteina meristilata che gioca un ruolo chiave nella replicazione e nella patogenesi virale, Nef media i suoi effetti prima che la RT termini la retro-trascrizione aumentando la capacità di sopportare la replicazione virale nella cellula ospite, E coinvolta nella down regolazione del recettore per CD4 e delle molecole MHC-1 sulla cellula ospite. Nef sequestra il CD4 a livello citoplasmatico. Vpr, Vif e Vpu svolgono diversi ruoli nella patogenesi dell infezioni in fasi diverse del ciclo replicativo, tra cui: trasporto del DNA provirale e delle proteine virali nel nucleo (trasporto del complesso di Preintegrazione), trasporto transmembrana di molecole, induzione della degradazione del recettore per CD4, arresto del ciclo cellulare in fase G2/M.

27 Tropismo cellulare HIV è in grado di infettare tutte le cellule del sistema immunitario in grado di esprimere CD4: linfociti T helper CD4+, macrofagi, monociti, cellule gliali e dendritiche. La sola presenza di CD4 non è sufficiente, perché mentre CD4 media l attacco con gp120, sono richiesti dei co-recettori coinvolti nel legame con gp40 e quindi nella fusione dell envelope virale alla membrana della cellula ospite. I due co-recettori più importanti sono CCR5 e CXCR4. I cor-ecettori sono molecole con 7 domini transmembrana e sono coinvolti nel tropismo di HIV verso le cellule ospiti.

28 Gli isolati di HIV sono classificati in base al loro tropismo in: T-tropici con tropismo verso i linfociti T e in M-tropici con tropismo verso monoiciti e macrofagi, a loro volta in ceppi che inducono sincizi SI e ceppi non inducenti sincinzi NSI. Inoltre si parla di stipiti R5 e X4 con tropismo per le cellule esprimenti CCR5 e CXCR4 rispettivamente, ci sono inoltre virus dual-tropico che sfruttano entrambi i corecettori. Nell infezione da HIV in fase precoce si hanno stipiti M-tropici non inducenti sincinzi in fasi tardive appaiono varianti T-tropiche inducenti sincinzi.

29 Adsorbimento e penetrazione Il primo step nell infezione da HIV è il riconoscimento delle cellule target, il virus attraverso gp120 lega i due target in sequenza CD4 e CCR5. gp120 in seguito al legame con CD4 va incontro a modifiche conformazionali che espongono gli epitopi della proteina al legame con il corecettore. Il completamento del legame porta altre variazioni conformazionali che espongono la porzione N-ter di gp40 che funge da segnale di fusione, sia ha fusione così tra l envelope e la membrana citoplasmatica.

30 Eventi successivi all entrata L RNA virale di HIV viene retrotrascritto nel citosol in una molecola di ssdna ad opera della RT utilizzando come innesco il trna, successivamente la RNasi H degrada l RNA dell ibrido e la RT con funzione di DNApol- DNA dip replica l elica formando un dsdna complesso di preintegrazione. Il DNA virale migra nel nucleo dove per azione di una IN penetra nel genoma della cellula ospite grazie alle informazioni contenute nelle LTR. In alcuni casi si può avere una infezione latente, in alternativa si ha un infezione produttiva poiché il DNA virale viene trascritto dalla RNA pol cellulare Produzione di mrna che andranno in contro a maturazione e traduzione con produzione di proteine strutturali e funzionali.

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32 L integrazione del DNA virale è una fase molto delicata del ciclo infettivo di HIV, E un processo stabile e produttivo ed è mediato dall Integrasi IN che è altamente conservata tra gli stipiti virali, L integrazione richiede anche l intervento degli enzimi cellulari che riempiono i gap tra le due molecole, Nel genoma cellulare il DNA virale è fiancheggiato dalle LTR e la trascrizione è finemente regolata dall interazione tra LTR, fattori di trascrizione cellulari e proteine regolatorie virali come Tat, Il promotore TATA box localizzato nella U3 al 5 è riconosciuto dal fattore nucleare NF-kB, La trascrizione del genoma virale avviene per azione della RNApol II cellulare, Vengono prodotti così 3 classi di mrna virali: precosissimi, precoci e tardivi, che codificano nell ordine proteine regolatrici, proteine coinvolte nella sintesi del genoma virale e infine proteine strutturali,

33 Maturazione dei virioni La sintesi di proteine di HIV nel citoplasma segue la sequenza di trascrizione dei diversi mrna, TAT, REV e NEF sono definite proteine precocissime poiché sono molecole con funzioni regolatorie del ciclo cellulare e replicativo del virus, Pol codifica per le proteine funzionali precoci. Gag, Env e Vpu, Vpr e Vif sono proteine tardive. Le proteine strutturali una volta sintetizzate migrano verso il citosol e la membrana per l assemblaggio dei virioni. In questa fase l RNA virale interagisce con i precursori del capside, il quale è assemblato dove sono localizzate gp120 e gp40 sulla membrana. Le proteine Vif e Vpu legano e inducono degradazione del CD4 cellulare in modo che non leghi prematuramente Env.

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35 Trasmissione Dagli inizi dell'epidemia, sono state individuate principalmente tre vie di trasmissioni dell'hiv, tutte riguardanti la penetrazione diretta di sangue o altre secrezioni infette nel circolo ematico di un soggetto sano. HIV inoltre è un virus a bassa contagiosità, che per trasmettersi ha bisogno di un'elevata concentrazione di particelle virali vitali. Tale condizione si realizza pressoché esclusivamente nel sangue e nelle secrezioni genitali, in particolare lo sperma; in misura minore, ma comunque sufficiente, nelle secrezioni vaginali. Altre secrezioni contengono HIV a bassa concentrazione, ma l'esperienza e numerosi studi sperimentali escludono la trasmissibilità tramite queste secrezioni, salvo situazioni del tutto eccezionali, come la presenza abbondante di sangue nella saliva.

36 Trasmissione L'immissione di sangue infetto nel circolo di un soggetto sano genera un'infezione pressoché certa. Questo tipo di contagio è stato molto frequente prima della messa a punto del test per HIV, tramite: -trasfusioni di sangue infetto (ad esempio per pazienti emofiliaci); -trapianti di organi di donatori infetti; -accidentali casi di ferimento con strumenti quali rasoi, aghi (anche da tatuaggio) o bisturi appena venuti in contatto con materiale infetto, soprattutto in ambito professionale (incidenti di laboratorio). L'esclusione sistematica dalle donazioni dei soggetti infetti e la sterilizzazione di tutti gli strumenti che entrano in contatto col sangue ha reso questo tipo di contagio prettamente episodico. Lo scambio di sangue fu inoltre responsabile dell'esplosione dell'epidemia tra tossicodipendenti da eroina, tramite lo scambio di siringhe usate.

37 La maggior parte delle infezioni del virus dell'hiv avviene attraverso rapporti sessuali penetrativi non protetti, sia etero che omosessuali. La secrezioni genitali possono raggiungere livelli elevanti di cariche virale e la dinamica della penetrazione favorisce la microfessurazione delle mucose genitali attraverso le quali il virus può entrare nel circolo dell'individuo sano. Lo sperma è mediamente più infettante delle secrezioni vaginali, perché oltre al virus libero può contenere linfociti infetti. La donna diventa più infettante in presenza di sangue mestruale, infezioni o infiammazioni vaginali. I rapporti anali rappresentano un maggior rischio di contagio, per la maggiore facilità con cui crea microtraumi e per la natura della mucosa rettale meno idonea a contrastare l'impianto dell'infezione. Lo stesso pene è dotato di mucose che possono presentare ulcere e piaghe dovute ad altri tipi di patologie, e che possono lacerarsi durante i rapporti sessuali entrando in contatto con sangue e secrezioni infette.

38 Patogenesi e manifestazioni cliniche In assenza di terapie l'infezione da HIV evolve inesorabilmente verso uno stato di malattia e quindi morte. L'infezione è suddivisa in 3 stadi: infezione acuta, stadio di latenza clinica e stadio sintomatico. Solo con l'ultimo stadio, in cui la sindrome inizia a manifestarsi con infezioni opportunistiche, si parla di immunodeficienza e quindi di AIDS. Con le moderne terapie, anche in caso di AIDS conclamato, è diventata possibile una regressione tra le fasi. I linfociti perduti per via della replicazione dell'hiv vengono ricostruiti dall'organismo ma, a lungo andare, le quantità sempre maggiori di virus immessi nel sistema circolatorio ne infettano un numero sempre maggiore, portando la loro quantità al di sotto di una soglia critica (~200 per millilitro di sangue, a fronte di /ml in un individuo sano), che rende l'organismo attaccabile con successo da qualsiasi di agente patogeno.

39 Patogenesi e manifestazioni cliniche L'avanzamento dell'infezione viene calcolato misurando la carica virale e la quantità di danno provocato dalla replicazione in termini di scomparsa dei linfociti T CD4+. La misurazione di questi parametri si è rivelata particolarmente utile: non è infatti eccezionale riscontrare gravi quadri di immuno-compromissione in assenza di sintomi clinici rilevanti. Un'alta carica virale indica un'intensa attività replicativa dell'hiv e quindi un'elevata distruzione di linfociti CD4+; tale dato esprime la velocità con cui l infezione corre verso l AIDS. La conta dei linfociti T CD4+ presenti nel sangue indica invece il grado di compromissione del sistema immunitario. I 2 parametri danno una stima dei tempi entro i quali si raggiungerà una soglia critica e quindi uno sviluppo della sindrome di immunodeficienza AIDS conclamato

40 Andamento della carica virale e dei linfociti TCD4+ durante l infezione di HIV Il tasso di progressione clinica della malattia varia notevolmente ed è influenzato da molti fattori, come: la suscettibilità dell'ospite, la funzionalità immunitaria, l'assistenza sanitaria e le possibili co-infezioni e quale particolare ceppo del virus è coinvolto.

41 La trasmissione eterosessuale rappresenta la modalità di trasmissione dominante: 85%

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43 La diagnosi di infezione da HIV si basa su: i. indagini sierologiche verso gli anticorpi diretti contro il virus; ii. isolamento del virus; Diagnosi di laboratorio iii. misura degli antigeni virali gp120 e gp41; iv. ricerca quantitativa del DNA e dell RNA virale; v. misura dei linfociti CD4+ nel sangue. Nello screening di popolazioni di donatori o di sospetto contatto con HIV si utilizza il saggio ELISA. Che consente di stabilire se ripetuto 2 volte consecutive a distanza di alcuni mesi lo stato di sieropositività. Le indagini per western blot sono utilizzate per confermare la positività al saggio ELISA.

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45 Oggi sono disponibili test rapidi per la ricerca di anticorpi specifici per HIV-1, Sono saggi rapidi che possono essere effettuati su siero, plasma, sangue intero o saliva, Non possono essere però utilizzati durante l infezione primaria (PERIODO «FINESTRA») quando gli anticorpi sono ancora assenti, ovvero non è avvenuta sieroconversione e nei bimbi al disotto dei 18 mesi che hanno anticorpi materni. In alcune circostanze è possibile ricercare l antigene questo in caso di infezione in atto accompagnata da intensa replicazione virale.

46 Terapia: farmaci antiretrovirali

47 Terapia antiretrovirale combinata potente HAART Highly Active Anti-Retroviral Therapy, ossia terapia antiretrovirale altamente attiva, è il termine che descrive l uso contemporaneo di tre o più farmaci antiretrovirali per il trattamento dell infezione da Hiv. Si parla anche di terapia combinata o combinazione o triplice. L'obiettivo della terapia antiretrovirale è l'abbattimento della carica virale e l'aumento dei linfociti CD4. In commercio ci sono quattro diverse tipologie di farmaci, dette classi : IF: inibitori della fusione, cioè inibitori di ingresso N(t)RTI: inibitori della trascrittasi inversa, nucleosidici e nucleotidici NNRTI: inibitori della trascrittasi inversa, non nucleosidici IP: inibitori della proteasi

48 Determinazione della carica virale nel sangue La carica virale nel sangue, o viremia, è rappresentata dal numero di copie virali presenti nell'unità di volume di sangue. Tipicamente, questo valore viene espresso in numero di copie per ml di sangue. I test molecolari basati sull amplificazione degli acidi nucleici usati per la misura della viremia sono: la PCR quantitativa, o Q-PCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction), usata molto frequentemente che quantifica l'hiv-rna il test bdna (branched-chain DNA) il test NASBA (Nucleid Acid Sequence-Based Amplification) Essi consentono di misurare valori di viremia compresi tra qualche decina di copie ed un milione di copie per ml. Se il valore di viremia, pur non essendo nullo, è al di sotto di tale intervallo (per cui questi test non sono in grado di misurarlo), si dice che la viremia non è rilevabile. Valori di viremia non rilevabili si riscontrano, di solito, in pazienti trattati con la HAART.

49 Saggio immunoenzimatico Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ELISA ELISA: Combina la specificità degli anticorpi con la sensibilità dei dosaggi enzimatici. Principio: è una tecnica che sfrutta la capacità delle superfici di plastica di adsorbire quantità piccole ma rivelabili di una specifica molecola. Si tratta di un saggio in fase solida effettuato su piastre da micro-dosaggio (multiwell). Ogni piastra contiene 96 pozzetti e permette di saggiare contemporaneamente un elevato numero di campioni. Limite: fornisce informazioni solo sulla presenza/concentrazione di una molecola, ma non fornisce informazioni sulle sue proprietà biochimiche, come peso molecolare, localizzazione cellulare, ecc.

50 Saggio immunoenzimatico Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ELISA Consideriamo che il pozzetto della multiwell contenga l anticorpo specifico per l antigene che ricerchiamo. Si aggiunge il siero-campione che potrebbe contenere l antigene. Si incuba e si procede al lavaggio per eliminare gli antigeni che non si sono legati. A questo punto si aggiungono Anticorpi Secondari marcati con un Enzima. Questi si fissano all antigene. Si procede, quindi, al lavaggio e si aggiunge poi uno specifico Substrato per l enzima. Se compare una Colorazione significa che la reazione è Positiva. L intensità del colore viene misurata allo spettrofotometro.

51 Saggio immunoenzimatico Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ELISA Tecnica ELISA indiretta

52 Il metodo più utilizzato per la rivelazione dell avvenuto legame antigeneanticorpo consiste nella coniugazione dell anticorpo secondario con una molecola che può essere direttamente rivelata. Anticorpi coniugati ad enzimi Vengono utilizzati enzimi in grado di convertire un substrato incolore in un prodotto colorato. Alkaline phosphatase phosphatase: per anticorpi coniugati alla fosfatasi alcalina si usa in genere il substrato p-nitrophenylphosphate (pnpp), che sviluppa un intenso colore giallo misurabile a 410 nm. Peroxidase: per gli anticorpi coniugati alla perossidasi si possono scegliere diversi substrati, tra i più utilizzati: 2,2-azinodiethyl-benzthiazoline sulfonate (ABTS), che sviluppa un colore blu-verde misurabile a 410 nm. o-phenylene diamine (OPD), sviluppa un colore arancio scuro misurabile a 492 nm.

53 Nel caso in cui l anti-ig in eccesso sia stata coniugata alla Perossidasi si aggiunge H 2 O 2 e il substrato cromogeno. La Perossidasi riduce l H 2 O 2 e ossida il substrato cromogeno producendo colore. Nel caso in cui l anticorpo specifico non sia presente, l anti-ig dopo il lavaggio sarà completamente eliminata insieme alla Perossidasi coniugata perciò l aggiunta di H 2 O 2 e del substrato cromogeno non produrrà alcun colore.

54 Saggio immunoenzimatico diretto Scopo: questo ELISA viene utilizzato per determinare la presenza e la concentrazione di un antigene in un campione biologico. Caratteristiche: è veloce ed accurato; utilizzando l antigene purificato (se disponibile) come standard, permette di determinare la quantità assoluta dell antigene nel campione analizzato. richiede due anticorpi che riconoscono epitopi diversi sull antigene. Questo risultato può essere raggiunto sia utilizzando due anticorpi monoclonali con diversa specificità, o anticorpi policlonali che contengono molteplici specificità e riconoscono regioni o epitopi diversi sull antigene. Vantaggi: L antigene non deve essere purificato. Elevato grado di specificità. Limite: non tutti gli anticorpi possono essere utilizzati.

55 Saggio immunoenzimatico indiretto Scopo: rivelare presenza e concentrazione di anticorpi nel siero e/o plasma Caratteristiche: è veloce ed accurato; permette di determinare: 1) la presenza di anticorpi contro l antigene immobilizzato; 2) la quantità di immunoglobuline presenti, grazie all utilizzo di controlli positivi presenti in concentrazioni note. 3) Il titolo anticorpale, ovvero la più alta diluizione a cui l anticorpo è ancora in grado di dare un segnale positivo; Limite: l antigene deve essere sempre purificato.

56 ELISA: APPLICAZIONI I tests ELISA rappresentano un mezzo fondamentale per l industria farmaceutica, con applicazioni nella scoperta di farmaci, negli studi con modelli animali, nei trials clinici. Drug discovery: nelle industrie farmaceutiche più di molecole sono testate di routine con kit ELISA nelle fasi iniziali dello screening per identificare molecole promettenti. Food science industry: i kit ELISA vengono utilizzati per analizzare le tossine nel cibo. Negli ultimi anni l utilizzo della tecnica ELISA si è sempre più diffuso, in particolare è utilizzata per: Determinare presenza e concentrazione di un antigene nel campione da testare; Determinare presenza e concentrazione di un anticorpo nel campione da testare; Determinare presenza e concentrazione di citochine secrete, sia in vivo che in vitro.

57 Diagnosi molecolare Per diagnostica molecolare in microbiologia clinica si intende la possibilità di identificare un microrganismo in base ad una o più sequenze geniche specifiche. La diagnostica molecolare si rivela spesso più sensibile e/o specifica dei metodi tradizionali e si ricorre sempre più a tali metodiche quando il microrganismo sia: difficilmente o affatto coltivabile; quando cresce molto lentamente in vitro; quando la sua manipolazione è troppo pericolosa per l operatore e la comunità; quando il costo dell indagine tradizionale è più elevato di quello della diagnosi molecolare. Presenta il vantaggio di poter essere effettuata direttamente sul campione, di non avere la necessità di attendere che il microrganismo cresca o che sia vivo al momento del processamento del campione.

58 Diagnosi molecolare: punti critici sono molto più complessi da utilizzare dei metodi tradizionali; richiedono un diverso grado di competenze tecniche da parte degli operatori; necessitano di apparecchiature più costose; l interpretazione dei dati richiede un più elevato livello di competenze. Vantaggio: Elevata sensibilità e rapidità

59 PCR Polymerase Chain Reaction tale metodica consente di identificare e tipizzare un microrganismo mediante l analisi della sequenza di regioni del genoma altamente conservate come gli rrna 16S e 23S

60 I limiti delle metodiche molecolari basati sulla PCR sono: Facile contaminazione dei campioni negativi; Amplificazione del DNA/RNA di microrganismi anche morti; Una possibile cross-reattività con microrganismi diversi con un genoma ad elevato grado di omologia; Falsi negativi per la presenza di inibitori della Taq-polimerasi; Necessità di utilizzare una coppia di primers specifica per una particolare specie microbica.

61 NATs: Nucleic Acid Amplification Technology Multiplex PCR; Nested PCR; RT-PCR; real-time PCR; real-time RT PCR; LCR (Ligase Chain Reaction); SDA (Strand Displacement Amplification)

62 Tessuti criopreservati; paraffinati; formalinizzati