APPLICAZIONI ELETTROFORESI. qpe: quadro proteico elettroforetico

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1 APPLICAZIONI ELETTROFORESI qpe: quadro proteico elettroforetico

2 QUADRO PROTEICO ELETTROFORETICO L esame si utilizza per separare le proteine del siero nelle sei frazioni principali. 1. ALBUMINA 2. α 1 GLOBULINE 3. α 2 GLOBULINE 4. β 1 GLOBULINE 5. β 2 GLOBULINE 6. γ GLOBULINE

3 Albumina Valori di riferimento: 3,6-4,9 g/dl È la proteina più abbondante della frazione sieroproteica L ipoalbuminemia è responsabile di ipoprotidemia, poiché l albumina costituisce da sola il 55-64% delle proteine plasmatiche totali Le funzioni principali sono: il mantenimento della pressione osmotica del sangue Il trasporto di acidi grassi, bilirubina, ormoni e farmaci Emoconcentrazione Infusione di albumina Insufficiente apporto Ridotto assorbimento Perdita Ridotta sintesi Ipercatabolismo Emodiluizione

4 Alfa1-globuline Valori di riferimento: 0,2-0,4 g/dl Tale frazione elettroforetica esprime principalmente il comportamento dell 1-glicoproteina, dell 1-fetoproteina, dell 1-lipoproteina Gravidanza Malattie infettive Malattie infiammatorie croniche Infarto del miocardio Neoplasie Carenza congenita di 1-antitripsina Sclerodermia Sindrome nefrosica

5 Alfa2-globuline Valori di riferimento: 0,4-0,8 g/dl Tale frazione elettroforetica esprime principalmente il comportamento dell 2-macroglobulina, dell aptoglobina, dell antitrombina III, protrombina, ceruloplasmina, colinesterasi, pre- -lipoproteine Infezioni acute batteriche Traumi Interventi chirurgici Infarto del miocardio Neoplasie Epatopatie croniche Diabete mellito Sindrome di Down Epatite virale Collagenopatie Pancreatite

6 Beta-globuline Valori di riferimento: 0,6-1 g/dl Tale frazione elettroforetica esprime principalmente il comportamento della transferrina, C3, proteina C reattiva, 2-microglobulina, -lipoproteine, Ig Talora è possibile osservare uno sdoppiamento in frazioni 1 e 2 1: transferrina, comlpemento e Ig 2: microglobuline, lipoproteine e IgM Gravidanza Cirrosi epatica Sindrome nefrosica A-beta-lipoproteinemia congenita Atransferrinemia congenita Enteropatie essudative

7 Gamma-globuline Valori di riferimento: 0,9-1,4 g/dl Comprendono le immunoglobiline (G, M, A, D, E) In particolare la frazione IgG, in condizioni normali, è prevalente sulle altre Un aumento delle -globuline può essere distinto nei quadri della gammopatia policlonale o monoclonale Policlonale: con aumento di molte classi di immunoglobuline Epatopatie croniche (epatite cronica, cirrosi epatica) Infezioni congenite Infezioni batteriche acute e croniche Parassitosi Monoclonale: con aumento di un unico tipo di immunoglobulina Malnutrizione Ustioni Terapia immunosoppressiva Sindrome nefrosica

8 Migrazione elettroforetica Proteine Funzione Pre-albumina Pre-albumina Indicatore nutrizionale Lega retinolo e ormoni tiroidei Albumina Albumina Maggiore contributo alla pressione oncotica (6g/100ml) Trasporta bilirubina, steroidi, ac.grassi 1 -globuline 1 -antitripsina (90% del totale!) 1 -lipoproteine (HDL) 1 -antichimotripsina 1 -glicoproteina acida Inibitore proteasi. Aumenta nell infiammaz.; deficit congenito causa cirrosi e enfisema giovanili Trasporto lipidi (colesterolo) Inibisce serin-proteasi. Aumenta nell infiammaz. Fase acuta infiammaz. 2 -globuline Aptoglobine Legano emoglobina. Aumentano nell infiammaz. Ceruloplasmina 2 -macroglobulina Inibitore perossidasi Inibitore trombina, pepsina, tripsina. Aumenta nella nefrosi.

9 -globuline Pre- lipoproteine (VLDL) Trasporto lipidi (trigliceridi) Transferrina Emopexina -lipoproteine (LDL) Trasporto ferro. Aumenta nell anemia sideropenica. Lega l eme. Diminuisce nelle anemie emolitiche. Trasporto lipidi (colesterolo) 2 -microglobulina fibrinogeno Componente antigene HLA I. Aumenta nell infiammaz. e diminuita clearance renale Precursore fibrina Complemento (C1,3,4) Proteina C reattiva (CRP) Risposta immune. Aumenta nell infiammaz. Norm. assente, compare in fase acuta infiammaz. Opsonizza batteri e funghi, chemoattrattore. -globuline Ig G-A-M-D-E Anticorpi. Picco monoclonale nel mieloma. Aumento policlonale nelle infezioni/infiammaz. croniche

10 La metodica usata è l elettroforesi su acetato di cellulosa o anche su gel di agarosio in mezzo alcalino (ph 8.5); le proteine separate sono colorate. L analisi è effettuata su siero non su plasma per eliminare l interferenza del fibrinogeno Separazione delle proteine in condizioni native

11 Migrazione elettroforetica anodica delle proteine sieriche a ph 8.5 Con un sistema di deposizione, si pone (sul lato catodico della lastrina e in più posizioni) una goccia di siero (~ 3 µl) Si fa passare una corrente di ~ Volt per ~ 15 minuti. A tale ph le proteine sono cariche negativamente e migrano verso l anodo

12 CAMPIONI DA EVITARE: Non utilizzare campioni di siero emolizzati L'emolisi causa un aumento delle zone alfa-2 e beta. Evitare campioni di plasma Evitare campioni vecchi o mal conservati o francamente lipemici

13 LA METODICA le proteine sieriche, in un mezzo a PH basico, sottoposte ad un campo elettrico costante, tendono a migrare verso il polo positivo (anodo) con una differente velocità di migrazione: - direttamente proporzionale alla carica elettrica - inversamente proporzionale alla massa molecolare Il risultato sono le proteine divise in bande o zone di migrazione.

14 Il grado di migrazione verso anodo dipende da carica elettrica, massa e forma della proteina - albumina migra più velocemente perché più piccola e anionica - globuline si separano in frazioni

15 Colorazione con coloranti idonei Scansione densitometrica della lastrina e si ottiene un elettroferogramma (tracciato) Dall integrazione delle aree sottese ai picchi e conoscendo la concentrazione proteica totale sarà possibile calcolare le concentrazioni delle singole proteine.

16 I tracciati elettroforetici una volta colorati sono letti mediante il densitometro: le bande proteiche vengono trasformate in picchi di diversa altezza, a base larga o stretta a seconda della loro intensità di colorazione e della loro larghezza, che rispecchiano la quantità proporzionale delle diverse proteine contenute nel siero.

17 Sul protidogramma di un soggetto normale si ritroveranno quindi diversi picchi e curve: il primo, più alto e stretto è quello di albumina, seguito da quello molto basso di α1 globuline, e da quelli di α2, di β1, di β2 globuline; al termine del grafico si vanno a posizionare le γ globuline con una curva bassa e larga.

18 Aumenti o diminuzioni in altezza o nel numero di tali picchi, sono quindi da mettere in relazione all aumento o alla diminuzione patologica o fisiologica delle proteine che le compongono. Esempi di tracciati anomali

19 ACETATO DI CELLULOSA O AGAROSIO? Elettroforesi su Acetato di Cellulosa: separa solo 6 componenti proteiche Elettroforesi su gel di Agarosio: separa 10 tipi di proteine non adattata a lettura densitometrica valutazione in riferimento ad un siero normale

20 GEL D AGAROSIO Si possono individuare: prealbumina, α1 antitripsina, α2 macroglobulina, aptoglobina, β lipoproteina, transferrina, complemento

21 Variazioni del qpe Relative ad erroneo campionamento Fisiologiche Patologiche

22 Relative ad erroneo campionamento Si possono verificare falsi aumenti di β globuline per migrazione di plasma, anziché di siero: Il fibrinogeno (presente nel plasma anche in concentrazioni pari a mg/dl) migra tutto in zona β2 causando un aumento proporzionalmente rilevante, ma non patologico, di queste proteine.

23 Situazione simile si ha anche con la migrazione di campioni sierici emolizzati o lipemici: sia l emoglobina, sia le lipoproteine vanno infatti a posizionarsi tutte in zona β causandone un aumento più o meno importante.

24 Fisiologiche Importante ricordare che la composizione in proteine del siero varia con l età: - neonati hanno basse concentrazioni di proteine (<5 g/l) e basse quote di globuline, che aumentano man mano con la somministrazione del colostro e con l alimentazione raggiungendo valori normali tra i 6 mesi e l anno di vita. - anziani, al contrario, possono avere valori più alti di γ globuline e leggermente più bassi di albumina. - durante l ultimo periodo di gravidanza vi è una diminuzione di globuline, per loro passaggio nel colostro, mentre nel corso di lattazione è l albumina a diminuire per un suo passaggio nel latte.

25 Variazioni fisiologiche Importante per l interpretazione. ETA : - bassa concentrazione alla nascita (<5 g/dl) - aumento con assunzione del colostro (Ig) - 6 mesi - 1 anno: range normali - anziani: aumento globuline (Ig e proteine della fase acuta) GRAVIDANZA: - globuline e PT diminuiscono verso la fine della gravidanza LATTAZIONE: - riduzione albumina e PT

26 Variazioni patologiche DISCRASIA PROTEICA: - anomalie qualitative: proteine con struttura anomale DISPROTEINEMIE: anomalie quantitative o qualitative - Iperproteinemia: 1.Non selettiva: aumento di tutte le proteine. Emoconcentrazione 2.Selettiva: aumento della concentrazione di alcune proteine infiammazione o neoplasia dei linfociti B

27 Ipoproteinemie 1. Non selettiva: diminuzione di tutte le proteine. Perdita di proteine (emodiluizione) o diminuita sintesi (proporzionale) di proteine. 2. Selettiva: diminuzione della concentrazione di alcune proteine. Perdita di proteine (piccole dimensioni) o diminuita sintesi di una o più proteine.

28 Iperproteinemie 1. da emoconcentrazione Patogenesi: concentrazione delle proteine plasmatiche a causa della perdita di H 2 O (disidratazione). Proporzionale aumento della concentrazione di tutte le frazioni e di fibrinogeno.

29 Iperproteinemie 2. da aumentata sintesi proteica a. Patologie infiammatorie (danno tissutale acuto) b. infezione batteriche, micotiche, virali e protozoarie c. patologie non infettive: (necrosi, neoplasia, patologie immunomediate) d. Neoplasia dei linfociti B e mieloma

30 Patologie infiammatorie L infiammazione stimola la sintesi di alcune globuline da parte degli epatociti e di Ig dai linfociti B. 3 gruppi di proteine nella disprotinemia infiammatoria 1. Proteine della fase acuta positive - a1-antitripsina, serum amiloide A, aptoglobina, a1- antichimotripsina, a2macroglobuline ceruloplasmina regione a proteina C-reattiva, fibrinogeno, transferrina, b - lipoproteine regione b

31 Funzioni: regolazione della risposta infiammatoria, rimozione di prodotti del catabolismo cellulare (danno o infiammazione), modulazione della risposta immunitaria. La produzione può aumentare poche ore dopo l insorgenza della malattia e persistere fino alla sua scomparsa.

32 2. Proteine della fase acuta negative: proteine la cui produzione diminuisce in fase acuta per diminuita produzione epatica. Albumina e transferrina Diminuzione dopo 1 settimana (emivita)

33 3. Proteine della fase cronica Aumento dopo 1-3 sett. dall insorgere della patologia (patologia cronica) Immunoglobuline (in maggioranza IgG) e complemento (C3) Gammopatia policlonale

34 Aumento delle a globuline anche in disordini non infiammatori: Somministrazione di cortisone : aumento della frazione a2 (aptoglobina) Emolisi: aumento della frazione a2 (aptoglobina) Insufficienza renale Sindrome nefrosica: aumento della frazione a

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36 Gammopatie Aumento delle immunoglobuline (frazione β) e γ globulinica GAMMOPATIE POLICLONALI Aumento di molte classi di immunoglobuline Ampia base di aumento in zona γ, ma anche β,(igm) Stimolo cronico antigenico (patologie infiammatorie, immunomediate e epatiche), in particolare patologie infettive.

37 GAMMOPATIE MONOCLONALI Aumento di una singola classe di Ig. Banda stretta in zona β o γ - Neoplasia plasmocitaria e disordini linfoproliferativi (linfociti B) Patogenesi: molecola (o subunità) immunoglobulinica omogenea prodotta da un singolo clone di plasmacellule o di linfociti B - Mieloma associato a proteinuria di Bence Jones (aumentata produzione di catene leggere di Ig e passaggio nelle urine)

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40 IPOPROTEINEMIA 1. da aumentata perdita proteica dallo spazio vascolare a. Perdita ematica b. Nefropatia proteino-disperdente c. Enteropatia proteino-disperdente d. Dermatopatia proteino-disperdente 2. da diminuita sintesi e/o aumentato catabolismo proteico a. Insufficienza epatica b. Malassorrbimento o maldigestione c. Cachessia d. Ipoplasia o aplasia linfoide 3. da mancato trasferimento di Ac materni 4. da emodiluizione

41 FIBRINOGENO AUMENTO - Emoconcentrazione - Infiammazione (infezione, trauma, neoplasia) - aumentata sintesi epatica

42 DIMINUZIONE : aumentato consumo coagulazione intravascolare formazione di trombi o vasculite aumento della fibrinogenolisi ridotta sintesi insufficienza epatica (grave) disordini congeniti fuoriuscita dal letto circolatorio