Con quali altre proteine interagisce la mia proteina di interesse? (network, interazioni.)

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1 La PROTEOMICA studia tutti i complementi proteici, i proteomi, che derivano dai vari tessuti o tipi cellulari. Al giorno d oggi, la proteomica può essere divisa in proteomica classica (sistematica e differenziale) e proteomica funzionale. La Proteomica classica concentra il suo interesse sullo studio dei proteomi completi Quali proteine sono presenti in una cellula o in un tessuto? mentre la proteomica funzionale studia gruppi più limitati di proteine Come appare una particolare proteina? (struttura, modificazioni ) Con quali altre proteine interagisce la mia proteina di interesse? (network, interazioni.)

2 Caratterizzazione dei complessi : Natura delle molecole presenti nei complessi Stabilità, cinetica di formazione-dissociazione dei complessi, variazione della loro composizione Proprietà funzionali dei complessi Interazioni proteiche dirette e indirette all interno dei complessi

3 Lo studio dell INTERACTOMA Conoscere i DETTAGLI delle interazioni all interno di network e della loro DINAMICA: - Stabilire QUALI proteine interagiscono - Stabilire COME varia la composizione dei complessi proteici in funzione delle condizioni (Es. Risposta a specifici segnali cellulari) - Confermare l esistenza di proteine che non sono state predette e attribuire loro un ruolo potenziale. -Stabilirei siti molecolari di interazione - Determinare i parametri cinetici di interazione

4 ANALISI DELLE INTERAZIONI PROTEINA-PROTEINA Tecniche di determinazione diretta delle interazioni: -analisiin vitro : es. co-purificazione / spettrometria di massa (gel-filtrazione filtrazione, ultracentrifugazione, coimmunprecipitazione ) -analisiin vivo : es. Two Hybrid System, FRET Tecniche per la caratterizzazione delle interazioni: -protein-array - spettrofluorimetria - spettrofotometria -.

5 ANALISI IN VITRO DELLE INTERAZIONI PROTEINA-PROTEINA Co-Immunoprecipitazione Immunoprecipitazione: L anticorpo diretto verso la proteina di interesse viene aggiunto a lisati cellulari. Gli immunocomplessi vengono isolati mediante aggiunta di proteina-a immobilizzata su resina. L ANALISI DEGLI IMMUNOPRECIPITATI viene di solito effettuata mediante SDS-PAGE seguita da immunorivelazioni specifiche o mediante 2D-E seguita da colorazione delle proteine totali. Maria Monti, Stefania Orru`, Daniela Pagnozzi, and Piero Pucci Interaction Proteomics; Bioscience Reports, Vol. 25, Nos. 1/2, February/April 2005

6 Pull-Down Assay: la proteina di interesse viene usata come esca per catturare eventuali partner fisiologici. Di solito la proteina esca viene prodotta come proteina di fusione ricombinante. Essa viene fatta interagire in vitro con un lisato cellulare. Gli eventuali complessi formatisi vengono purificati per affinità. Maria Monti, Stefania Orru`, Daniela Pagnozzi, and Piero Pucci Interaction Proteomics; Bioscience Reports, Vol. 25, Nos. 1/2, February/April 2005

7 Tap-Tag Tag Assay La proteina di interesse (esca) viene fatta esprimere con una doppia specifica marcatura (tag): CBP (Calmodulin Binding Peptide) e Proteina A (IgG binding domains of Staphylococcus aureus-protein A). Tra le regioni codificanti per i due tag è inserito un sito di idrolisi specifico per la Proteasi del Virus del Tabacco (TEV). I complessi proteici sono isolati mediante due processi cromatografici di affinità. Variazioni rispetto alla strategia originale: possibilità di introdurre i Tag sia all N che al C-terminale della proteina esca e nuovi tipi di Tag. Le cellule (procariotiche o eucariotiche) possono essere trasfettate sia transientemente che stabilmente. Non si dovrebbe mai avere OVERESPRESSIONE. Le interazioni si stabiliscono in vivo Il sistema TAP-tag è stato messo a punto per l isolamento di complessi espressi a livelli naturali.

8 CROSSLINKING Il cross linking chimico fissa complessi multimolecolari,, creando legami covalenti purificazione, arricchimento specifico e analisi. Può essere effettuato sia in vivo che in vitro. Non dàd informazioni sulla forza delle interazioni. Una volta identificati i partners molecolari,, permette la mappatura dei siti (amminoacidi) di interazione. Situazione ideale : COMPLESSI BIMOLECOLARI

9 GRUPPI FUNZIONALI DELLE PROTEINE Ammine Primarie ( NH2): N-terminali e catena laterale delle lisine (Lys, K) (gruppo epsilon-amminico). Gruppi carichi positivamente in condizioni fisiologiche; solitamente esposti sulla superficie esterna della proteina. Carbossili ( COOH): C-terminali e catene laterali di aspartato (Asp, D) e glutammato (Glu, E). Solitamente esposti sulla superficie esterna della proteina e quindi accessibili per la coniugazione senza dover denaturare la proteina. Sulfidrili ( SH): catena laterale della cisteina (Cys, C). Spesso formano ponti disolfuro ( S S ). Necessario effettuare la riduzione prima del crosslinking. Carbonili ( CHO): gruppi aldeidici e chetonici; possono essere creati nelle glicoproteine ossidando gli zuccheri con meta-periodate.

10 Protein crosslinker reactive groups Functional Group Target Reactive Group Carboxyl (directly to amine) Amine Sulfhydryl Aldehyde (Carbonyls) i.e., oxidized carbohydrates Any Group (Nonselective) Hydroxyl (non-aqueous) Carbodiimide (e.g., EDC) NHS ester Imidoester PFP ester Hydroxymethyl phosphine Maleimide Haloacetyl (Bromo- or Iodo-) Pyridyldisulfide Vinyl sulfone Hydrazide Diazirine (Photo-reactive) Aryl Azide (Photo-reactive) Isocyanate

11 CARBODIIMIDI (EDC E DCC) Carbodiimidi usate come crosslinker sono: EDC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride DCC: Dicyclohexylcarbodiimide EDC è uno zero-lenght crosslinker : attiva il gruppo carbossilico permettendone il legame con un gruppo amminico. Usato in procedure di immobilizzazione (es. attacco di proteine/peptidi a superfici carbossilate) o nella preparazione di immunogeni (es. attacco di un piccolo peptide a una proteina carrier di grosse dimensioni).

12 ESTERI N-IDROSSISUCCINIMMIDI (NHS-estere) La reazione avviene in condizioni debolmente alcaline e genera legami ammidici. IMMIDOESTERI La reazione avviene in condizioni alcaline e genera legami ammidinici. Legame reversibile a ph elevato.

13 MALEIMMIDE Il crosslinking che sfrutta la presenza dei gruppi sulfidrilici è una delle procedure più usate. Le cisteine non sono mai troppo numerose. Processo selettivo e preciso. I gruppi sulfidrilici possono essere generati (es. per riduzione; aggiunta di cisteammina su gruppi fosfato o etanditiolo su doppi legami ). Il tioetere che si forma è stabile ed irreversibile. La combinazione di gruppi reattivi verso gli SH e di gruppi reattivi verso gli NH2 è tipica dei reattivi eterobifunzionali più usati.

14 IDRAZIDI Le idrazidi reagiscono anche con le ammine, ma la reazione è più lenta. I gruppi carbonilici nelle proteine non esistono, ma possono essere creati (es. carboidrati)

15 ARIL AZIDI I reattivi fotochimici sono inerti; vengono resi reattivi se esposti a luce visibile o ultravioletto. Le arilazidi sonostati i primi gruppi foto-reattivi usati per il cross-linking delle proteine. Gli agenti riducenti impediscono la fotoattivazione.

16 Photoactivatable Cross-linking Il cross linking può essere effettuato usando sostanze attivate dalla luce. Processo più controllabile Tempi di reazione più rapidi ESEMPIO: Tris(2,2 -bipyridyl) bipyridyl)-ruthenium ruthenium (II) + APS Persolfato d ammoniod Rapido (10-30 s) Alta efficienza Radiazione visibile (> 400 nm) Non introduce gruppi chimici (zero-lenhgt) Coinvolge residui di Tirosina

17 Meccanismo proposto per la reazione di photocross- linking con Tris(2,2 -bipyridyl) bipyridyl)-ruthenium ruthenium (II)

18 REATTIVI OMOBIFUNZIONALI 2 identici gruppi reattivi separati da un braccio spaziatore. Di solito: reazioni one-step e random. Esempio: aggiungendo un crosslinker ammina-vs-ammina ad un lisato cellulare si otterrà la coniugazione di tutte le proteine o peptidi le cui lisine si troveranno ad una distanza utile. Questo metodo è utile per capire la possibilità di associazione fra più molecole e non permette di selezionare le molecole da analizzare.

19 REATTIVI ETEROBIFUNZIONALI 2 gruppi reattivi diversi alle loro estremità. Le reazioni possono essere sia coniugazioni a singolo-step, che coniugazioni sequenziali (two-step). Processi di polimerizzazione e self-conjugation sono minimizzati. Nelle procedure sequenziali: 1- reagisce il gruppo del crosslinker più labile; 2- si rimuove l eccesso di crosslinker che non ha reagito; 3- la soluzione con la proteina modificata viene aggiunta ad una soluzione contenente la seconda proteina, che reagisce con il secondo gruppo reattivo.

20 SCELTA DEI CROSSLINKER SPECIFICITÁ CHIMICA: con quale/i gruppo/i funzionale reagisce? CARATTERISTICHE DEL BRACCIO SPAZIATORE : il crosslinker è sufficientemente lungo da connettere le due molecole? Il legame può essere reversibile? Il legame può essere rotto? SOLUBILITÁ IN ACQUA E PERMEABILITÁ DELLE MEMBRANE CELLULARI: il reattivo può entrare nella cellula? Il reattivo può determinare crosslink delle proteine idrofobiche di membrana? REATTIVITÁ SPONTANEA O FOTOINDOTTA: la reazione avviene spontaneamente e rapidamente o deve essere attivata in un momento preciso?

21 FONDAMENTALE: Preservare la struttura nativa delle proteine e dei complessi; Non eccedere con il reattivo. Il rapporto molare, crosslinker-vs-proteina, ottimale dovrebbe essere sempre determinato empiricamente; Poter controllare il grado di coniugazione (es. basso se è necessario preservare l attvità biologica della proteina); Considerare sempre i gruppi funzionali presenti sulla superficie della proteina. Se questi sono molti, è necessario usare un basso rapporto crosslinker-vs-proteina, viceversa se sono pochi. Limitarsi all analisi di complessi con pochi interagenti (situazione ideale: 2).

22 TIPI DI CROSS-LINKER DISPONIBILI COMMERCIALMENTE I più comuni cross-linker formano legami fra: Lisina/Lisina Lisina/Aspartato Lisina/Glutammato Lisina/Cisteina Cisteina/Cisteina Il cross-linking può essere effettuato anche per inserire dei TAG di affinità, cromofori o fluorofori. Il cross-linking può anche NON INTRODURRE gruppi chimici Michael A. Trakselis, Stephen C. Alley, and Faoud T. Ishmael; Identification and Mapping of Protein-Protein Interactions by a Combination of Cross-Linking, Cleavage, and Proteomics; Bioconjugate Chem.; 2005; 16(4):

23 STRATEGIA GENERALE Michael A. Trakselis, Stephen C. Alley, and Faoud T. Ishmael; Identification and Mapping of Protein-Protein Interactions by a Combination of Cross-Linking, Cleavage, and Proteomics; Bioconjugate Chem.; 2005; 16(4):

24 Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Schagger H, von Jagow G., Anal Biochem Dec;199(2):223 ;199(2): LA BLUE NATIVE ELECTROPHORESIS è una tecnica sviluppata per l analisi l dei complessi proteici che formano la catena respiratoria di trasferimento elettronico di vari organismi.

25 VANTAGGI RISPETTO AD ALTRE TECNICHE SEPARATIVE DI COMPLESSI MULTIPROTEICI: Non introduce TAG o ANTICORPI che potrebbero influenzare le interazioni proteina/proteina proteina. I complessi possono anche essere analizzati in un unico immunoblot. Fornisce informazioni rapide su: numero, ampiezza, composizione e abbondanza relativa delle singole subunità presenti nei complessi.

26 Tecnica ideata per l analisi l di complessi proteici di membrana Circa il 20-30% delle proteine cellulari sono proteine integrali di membrana,, e molte proteine solubili sono associate ad esse. L analisi biochimica di proteine integrali di membrana richiede di solito l estrazione con detergenti e denaturanti che solubilizzino efficientemente le proteine idrofobiche distruzione delle interazioni proteina- proteina e possibile perdita dell attivit attività enzimatica. La native isoelectric focusing idrofobiche,, che tendono a diventare insolubili a ph precipitare al polo basico. non è adatta all analisi analisi delle proteine vicini al loro pi e a Il cross-linking chimico talvolta impedisce l identificazione l corretta di tutte le proteine presenti in un complesso; complessi multi-proteici (a molte componenti) possono generare segnali difficilmente interpretabili..

27 L analisi elettroforetica BLUE NATIVE permette la separazione ad alta risoluzione di complessi multiproteici,, in condizioni native: richiede detergenti non forti e non ionici,, come il Triton X-100, il β-d- dodecilmaltoside (DDM), e la digitonina è possibile solo in condizioni non denaturanti (in contrasto con le tecniche classiche,, quali SDS-PAGE e IEF). Applicabile solo a materiale purificato. Risoluzione superiore a quella di altre tecniche quali gel-filtrazione o ultracentrifugazione su gradiente.

28 DETERGENTI USATI PER LA PREPARAZIONE DI CAMPIONI DA SOTTOPORRE A BN-PAGE

29 Le cariche negative vengono attaccate ai complessi proteici solubilizzati,, dal legame con il colorante Coomassie Blue G250:

30 Il Coomassie non agisce come un detergente e preserva la struttura dei complessi multiproteici. Il legame del Coomassie avviene piuttosto uniformemente nel caso di proteine di membrana (Coomassie( Coomassie:proteina (W:W), 1:1). I complessi proteici (e le singole proteine) migrano all anodo anodo per l eccesso l di carica negativa e vengono separate in base alla massa molecolare apparente.

31 La ragione per cui la BN-PAGE è stata più comunemente usata per l analisi l di complessi proteici respiratori e fotosintetici è la loro abbondanza nel proteoma di mitocondri e cloroplasti. L utilizzo della tecnica BN per altri tipi di campioni può richiedere ere un pre- trattamento per l arricchimentol del complesso proteico di interesse. La BN-PAGE non è stata usata con successo per l analisi l di complessi proteici solubili,, nonostante essi siano in teoria meno problematici da analizzare e dei complessi proteici di membrana. Spesso si possono verificare problemi di allargamento e/o restringimento dell ampiezza delle bande nel gel, dovuti in parte ad una inappropriata concentrazione di sali.

32 QUINDI: Per solubilizzare complessi proteici intatti, evitando la denaturazione delle proteine è necessario usare: detergenti blandi non ionici come DDM, digitonina, Triton X-100; sali di bassa forza ionica, come acido aminocaproico o acetato di potassio. LA MOBILITA ELETTROFORETICA è DETERMINATA DALLA CARICA NEGATIVA DATA DAL LEGAME CON IL COOMASSIE BLUE G-250G E DALL AMPIEZZA AMPIEZZA E DALLA FORMA DEI COMPLESSI MULTIPROTEICI. Per ragioni sconosciute NON E E POSSIBILE SEPARARE COMPLESSI DA LISATI CELLULARI TOTALI, anche se: PARZIALE PURIFICAZIONE E/O DIALISI

33 Per l analisi l BN di complessi proteici citoplasmatici sembra essere necessario rimuovere una sostanza di passo peso molecolare mediante DIALISI. 2D BN/SDS-PAGE from WCL: PROTEIN COMPLEX FOOTPRINT Camacho-Carvajal, M. M. (2004) Mol. Cell. Proteomics 3:

34 Di solito vengono usati gel di acrilamide in gradiente: 5-14%/ 5-17% 5 estremità catodica estremità anodica

35 Nel caso più comune, alla BN-PAGE è abbinata una SDS-PAGE 1% SDS 1% β-mercaptoetanolo

36 Per una BN-SDS PAGE, la striscia del gel BN deve essere incubata prima della seconda dimensione in un tampone contenente SDS e 2-mercaptoetanolo 2 (o DTT ); questo passaggio assicura una completa denaturazione dei complessi proteici necessaria per una successiva separazione delle loro subunità. In una BN/SDS-PAGE le proteine monomeriche migrano all interno di una parabola iperbolica, mentre i complessi multiproteici (MPC) ne rimaranno al di sotto. Dopo la seconda dimensione le proteine appartenenti ad uno stesso complesso multiproteico,, si separeranno in colonne verticali

37 Visualization of MPCs on a 2D WCL BN/SDS gel and identification of MPC components by MS Quando i campioni vengono pre-trattati con SDS, si ha la scissione dei complessi nelle singole unità monomeriche.. L analisi L bidimensionale BN-PAGE/SDS PAGE/SDS-PAGE (B) mostrerà una localizzazione a forma di diagonale iperbolica. Senza pre-trattamento avremo una visualizzazione degli spot in colonne verticali (A).

38 BN/SDS PAGE BN/BN PAGE COMBINA O L USO DI DETERGENTI DIVERSI O ALTRI TRATTAMENTI DEBOLMENTE DENATURANTI QUALI TEMPERATURE ELEVATE, VARIAZIONI DI CONCENTRAZIONE SALINA, RIDUCENTI.. BN/IEF-SDS PAGE L identificazione delle singole proteine presenti nei complessi, può essere effettuata o mediante MS o mediante IMMUNORIVELAZIONE SPECIFICA.

39 LE VARIE SUBUNITÀ PROTEICHE SEPARATE MEDIANTE BN/SDS-PAGE, VENGONO IDENTIFICATE UTILIZZANDO STRATEGIE TRADIZIONALI : Peptide Mass Finger Print (MS). Sequenziamento peptidico (MS/MS MS). Western blotting. Altro.. I risultati possono comunque essere convalidati mediante riconoscimento immunospecifico (Western Blot)!

40 Two-dimensional Blue Native/SDS Gel Electrophoresis of Multi-Protein Complexes from Whole Cellular Lysates: A PROTEOMICS APPROACH Margarita M. Camacho-Carvajal Carvajal, Bernd Wollscheid, Ruedi Aebersold, Viktor Steimle,and Wolfgang W. A. Schamel MOLECULAR AND CELLULAR PROTEOMICS (2004), 3: ANALISI DEI COMPLESSI PROTEASOMICI IN SISTEMI EUCARIOTICI E LORO DINAMICA

41 Identification of MPCs by immunoblotting L analisi è stata estesa a molte proteine cellulari note, per verificare la loro appartenenza a MPC. Importin-β e Importin-α: : implicate nel trasporto verso il nucleo, non sempre appartengono a stessi MPC. P53 appartiene almeno a tre distinti MPC (quello di 200 kda è presumibilmente un omotetramero).. Alcune delle proteine analizzate, migrano come componenti monomeriche all interno della diagonale iperbolica Camacho-Carvajal, M. M. (2004) Mol. Cell. Proteomics 3: Copyright 2004 American Society for Biochemistry and Molecular Biology

42 L identificazione di proteine incognite presenti in MPC è stata effettuata mediante PEPTIDE MASS FINGER PRINT e/o SEQUENZIAMENTO DIRETTO (LC-MS/MS)

43 Cosa succede se due MPCs (multi-protein complexes) hanno la stessa mobilità elettroforetica? Dopo la BN i due MPCs sono sovrapposti. Dopo la successiva SDS-PAGE le singole componenti di entrambi si separano ma come si attribuiscono gli spots??? Antibody-based based gel shift assay

44 Antibody-based based gel shift assay La posizione di due spot in una colonna verticale dopo BN/SDS-PAGE può indicare: Due proteine appartenenti ad uno stesso MPC. Due proteine appartenenti a due MPC con uguale mobilità elettroforetica. Incubando il lisato cellulare totale con un anticorpo diretto verso una delle proteine presenti in uno dei MPC, prima della BN/SDS-PAGE, si genererà un complesso addizionato della massa dell anticorpo: SHIFT vs TOP (Higher molecular mass) SPOSTAMENTO SOLO DELLE PROTEINE APPARTENENTI AD UNO STESSO COMPLESSO

45 Identification and analysis of distinct proteasomes by WCL 2D BN/SDS-PAGE RICONOSCIMENTO IMMUNOSPECIFICO (WB) Subunità proteiche del complesso 20S: Mcp21 e β2 Subunità proteiche del complesso 19S cap del proteasoma 26S: S4 ATPase Subunità proteica di PA28: PA28α IN D: Antibody-based based gel shift assay Subunità dell immuno- proteasoma indotto dal trattamento con IFN-γ: LMP2

46 In-gel activity staining of oxidized nicotinamide adenine dinucleotide kinase by blue native polyacrylamide gel electrophoresis Ryan J. Mailloux, Ranji Singh, Vasu D. Appanna, Analytical Biochemistry 359 (2006) La NADK è un importante enzima metabolico che permette agli organismi viventi di modulare la concentrazione intracellulare di NAD + e NADP +. Fondamentale per la generazione di un ambiente riducente in grado o di contrastare la generazione/esposizione di/ai ROS (Reactive( Species). Oxygen Messa a punto di una tecnica Blue Native-PAGE per valutare l attività e l espressionel della NADK

47 REAZIONE CATALIZZATA DALLA NADK: NADK NAD + + ATP NADP + + ADP L attività viene monitorata direttamente su gel, in presenza di un enzima NADP + - dipendente (Glucosio-6-fosfato deidrogenasi, G6PDH o isocitrato deidrogenasi, ICDH). Il NADPH che si forma, interagisce con CLORURO DI IODONITROTETRAZOLIO (INT) generando un precipitato bruno, che si deposita nel sito dove è l enzima NADK. PROCEDURA: Lisi in 50 mm Bis-Tris, 500 mm six-amino hexanoic acid (ph( 7.0) Aggiunta di Coomassie G % (presente anche nel tampone catodico) Elettroforesi in condizioni native (20-80 µg g proteine) Equilibrazione in 25 mm Tris, 5 mm MgCl2 (ph( 7.4) presente Aggiunta di NAD+ 0.5 mm,, ATP 3 mm,, Glucosio-6-fosfato 5 mm o isocitrato 5 mm, G6PDH o ICDH 5 unità,, INT 0.4 mg/ml, PMS 0.2 mg/ml Controlli negativi: incubazione senza substrato (ATP o NADH) o aggiunta di iodoacetato e CTP

48 Blue Native Electrophoresis 1 a dimensione Una volta individuata la banda attiva, essa viene: Ritagliata Equilibrata in 24 mm Tris, 191 mm Glicina,, 1% SDS (W/v), 1% mercaptoetanolo (v/v) SDS-PAGE 2 a dimensione

49 ANALISI COMPLETA: (BN (zimogramma( zimogramma)/sds-page)