METODI INNOVATIVI PER LA CARATTERIZZAZIONE DELL ORIGINE GEOGRAFICA DEI PRODOTTI AGRO-ALIMENTARI

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1 METODI INNOVATIVI PER LA CARATTERIZZAZIONE DELL ORIGINE GEOGRAFICA DEI PRODOTTI AGRO-ALIMENTARI ALIMENTARI ANTONIO SACCO Dipartimento di Chimica, Università di Bari A. Moro

2 1. Introduzione I numerosi attentati nei confronti della salute pubblica susseguitisi negli ultimi anni: pollame contaminato dalla diossina, encefalopatia spongiforme bovina (BSE), residui di pesticidi illegali, presenza di acrilammide, influenza aviaria, mozzarelle di bufala alla diossina, hanno accresciuto in maniera considerevole l interesse dei consumatori verso gli aspetti qualitativi dei prodotti alimentari inducendoli a mostrare una maggiore attenzione nei riguardi dei cibi che consumano.

3 Inoltre, la crescente preferenza dei consumatori nei riguardi dell origine geografica e delle pratiche di coltura (biologico o tradizionale) dei prodotti agro-alimentari, ha accresciuto la richiesta per un accurata e veritiera etichettatura degli alimenti. Purtroppo, le risorse scientifiche a disposizione degli enti preposti al controllo dei prodotti alimentari sono scarsamente utilizzate o non rispondono ancora in maniera soddisfacente alle richieste dei consumatori soprattutto in riferimento alla etichettatura degli alimenti e alla loro autenticità.

4 E sicuramente necessario mettere a punto un progetto integrato mirato allo sviluppo di un tracciabile sistema di etichettatura degli alimenti che possa promuovere una crescente fiducia nei prodotti alimentari tipici, soprattutto quelli dell area mediterranea, da parte dei consumatori nazionali ed internazionali. Inoltre, bisogna fornire alle autorità di controllo i mezzi per accertare la corretta etichettatura dei prodotti commestibili. Un simile progetto deve fornire anche una più profonda comprensione del ruolo di autenticità e come la verifica di tale autenticità possa agire da stimolo nella scelta del prodotto da parte del consumatore.

5 Gli obiettivi specifici obiettivi specifici di un tale progetto potrebbero essere così schematizzati: Correlare la morfologia geochimica e i fattori bioclimatici con la crescita dell alimento. Sviluppare metodi rapidi, accurati e convenienti per determinare l origine delle specie e la varietà del cibo. Sviluppare metodi di fingerprint, veloci ed economici, che possano caratterizzare i prodotti alimentari. Sviluppare specifiche innovative, attraverso l applicazione della analisi statistica multivariata ai dati ottenuti con tecniche d avanguardiad avanguardia, che possano essere utilizzate per etichettare e controllare le caratteristiche dell alimento prodotto.

6 Sviluppare il sistema di tracciabilità dalla fattoria alla forchetta basato sulla evidenza bio-analitica collezionata lungo la filiera, capace di verificare l etichettatura del prodotto finale rispetto alla sua origine. Sviluppare un sistema di comunicazione e diffusione tra ricerca e imprese che dovrebbe consentire di garantire l autenticità degli alimenti. Valutare le attitudini dei consumatori nei riguardi dei prodotti di origine controllata, dell autenticità del prodotto e delle frodi alimentari.

7 a) Etichettature 2. Stato dell arte Le problematiche legate alle etichettature sono di interesse crescente man mano che i consumatori selezionano con maggior cura gli alimenti che acquistano. La scarna informazione riportata sull etichetta di un alimento, nella maggior parte dei casi, è limitata alla composizione ed ai dati nutrizionali. Molte affermazioni, presenti talvolta sulle etichette, riguardanti presunti valori aggiunti dell alimento sono raramente suffragate da dati analitici, e in molti casi il controllo della veridicità delle affermazioni viene effettuata solo attraverso procedure di tipo cartaceo.

8 Questo fatto è particolarmente importante con la crescita e la promozione del valore aggiunto degli alimenti regionali così come quelli prodotti con il marchio Biologico o di Origine Controllata.

9 b) Origine Geografica. La questione della provenienza geografica, specialmente per prodotti di origine animale, ha recentemente assunto una grande importanza dovuta a situazioni del tipo BSE e afta. In particolare, l introduzione della Norma CEE 2772/1999 è il risultato della crescente richiesta dei consumatori per una etichettatura accurata dell origine della carne bovina. Bisogna, tuttavia, dire che sono quasi del tutto assenti metodi analitici per una verifica puntuale delle affermazioni contenute nell etichetta. Infatti i metodi analitici tradizionali, sinora impiegati, sono inadeguati, costosi e time consuming. Quindi, si è cercato negli ultimi anni di introdurre metodi chimico-fisici innovativi.

10 c) Metodi di produzione del prodotto. Oltre alle problematiche legate all origine geografica, i consumatori sono sempre più interessati ai metodi usati per la produzione degli alimenti. Diverse sono le ragioni di un tale interessamento: preoccupazioni riguardanti l agricoltura sostenibile; benessere degli animali; metodi di produzione eco-sensibili sensibili; rischio di esposizione a malattie come BSE. In particolare, gli alimenti biologici rappresentano una delle aree di maggior interesse da parte dei consumatori e in cui non esistono adeguati metodi analitici di indagine a sostegno dei controlli richiesti dal Regolamento CEE 2092/91.

11 3. Analisi chimico-fisiche tradizionali Come già accennato le analisi chimico-fisiche tradizionali sono adatte ad investigare un singolo problema e non permettono di avere dettagliate multiple risposte in tempi di analisi accettabili. Alcuni esempi: aggiunta fraudolenta di latte vaccino a latte bufalino per le mozzarelle di bufala (metodo elettroforetico); determinazione degli acidi grassi negli oli di oliva e oli di altra natura (metodo gas-cromatografico); analisi classiche analisi classiche nei vini: grado alcolico, acidità volatile, anidride solforosa, ecc.

12 4. Analisi chimico-fisiche innovative A causa delle limitatezze dei metodi analitici tradizionali, si è cercato negli ultimi anni di introdurre metodi chimico-fisici innovativi. Quelli che hanno riscosso maggior successo sono i metodi basati sulla spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e sulla spettroscopia di massa dei rapporti isotopici (IRMS). VANTAGGI DELL NMR E DELL IRMS In teoria, le tecniche di analisi basate sull NMR presentano un grande vantaggio nelle indagini sui prodotti alimentari. Infatti, le molecole o le strutture da indagare non necessitano di essere pre-selezionate in quanto tutti i nuclei di interesse sono eccitati dall esperimento e possono essere rilevati.

13 In realtà, l NMR è una tecnica poco sensibile in confronto ad altri metodi spettroscopici, come ad esempio la spettroscopia di massa. A dispetto di queste limitazioni di sensibilità, la capacità di investigare (in maniera non invasiva) tutte le molecole in una materia prima è la più caratteristica proprietà dell NMR. Inoltre, spesso non è necessario identificare ed assegnare tutti i segnali in quanto può essere applicata la pattern recognition, con le relative tecniche di discriminazione tra data set. Questo tipo di approccio è estremamente utile nella determinazione dell autenticità e dell origine geografica degli alimenti.

14 In genere, si applica l high resolution NMR nel caso di alimenti liquidi (olio, vino, latte, bevande, ecc.), mentre nel caso di matrici alimentari allo stato solido (farina, pane, mozzarelle, carne, ecc.), in cui la rigidità molecolare è la caratteristica principale, deve essere applicata la tecnica dell NMR dello stato solido. In questo caso, se la situazione al contorno impedisce la riorientazione isotropica delle molecole, e di conseguenza gli spettri che ottengono sono very broad e quindi di nessuna utilità diagnostica, si può utilizzare la tecnica Magic Angle Spinning per azzerare tali anisotropie e quindi evitare questo svantaggio. Questo approccio è stato molto usato negli ultimi anni a causa della comparsa in commercio di 1 H High Resolution Magic Angle Spinning (HR-MAS) probe.

15 Negli ultimi tempi, quasi sempre in aggiunta alle misure basate sulla spettroscopia NMR, sono state effettuate anche determinazioni di rapporti isotopici naturali (IRMS) basati sulla Spettroscopia di Massa. La tecnica IRMS fornisce informazioni interessanti circa l origine dei prodotti alimentari, in quanto la composizione isotopica naturale di questi dipende dalle condizioni geoclimatiche del luogo di crescita dello stesso. Il valore del rapporto isotopico 13 C/ 12 C (δ 13 C) nelle piante dipende dal particolare percorso per la fissazione della CO 2 da parte della pianta, che può essere di tipo C ( 3 ciclo di Calvin) o C (ciclo di 4 Hatch-Slack Slack).

16 Il contenuto di 15 N dell azoto disciolto nel suolo (proveniente dai nitrati e dall ammoniaca disciolti) assimilato dalle piante influenzerà il valore del rapporto 15 N/ 14 N (δ 15 N) del frutto della pianta. Inoltre, il δ 15 N dell azoto presente nel terreno dipende dalle condizioni geo-climatiche così come dai fertilizzanti utilizzati. Infine, la dipendenza del rapporto 18 O/ 16 O (δ 18 O) dalle condizioni geo-climatiche dell area di produzione è stata dimostrata nel caso di vari prodotti alimentari come, ad esempio, negli oli vegetali. Vediamo alcune significative applicazioni dell NMR e IRMS nel campo agro-alimentare.

17 Naturalmente bisogna iniziare illustrando brevemente l unico metodo NMR sinora accettato dalla Comunità Europea come metodo ufficiale per la messa in evidenza della sofisticazione dell aggiunta fraudolenta di zucchero esogeno ai mosti deboli per aumentare il grado alcolico dei vini. Il metodo va sotto il nome di SNIF-NMR NMR acronimo di Site-Specific Natural Isotope Fractionation Nuclear Magnetic Resonance. Senza entrare in molti dettagli, questo metodo si basa sulla determinazione sito specifica del deuterio nel CH e CH 3 2 della molecola di etanolo ottenuta dalla fermentazione alcolica dei mosti.

18 Naturalmente queste concentrazioni di deuterio sono diverse se l alcol etilico invece che dalla fermentazione naturale proviene dall aggiunta fraudolenta di zuccheri esogeni che nella fermentazione daranno concentrazioni diverse di deuterio nella molecola di alcol etilico.

19 PRODOTTI CARATTERISTICI DELLA PUGLIA OLIO D OLIVA FARINA, PANE E PASTA VINO LATTE E PRODOTTI CASEARI (Mozzarelle) CARNE FRUTTA

20 Protoni metilenici Protoni metilenici Protoni vinilici -CH dei gliceroli -CH 2 dei gliceroli Protone metilenico legato a C 2 Protoni diallilici Protoni allilici Protone metilenico legato a C 3 ppm Spettro 1 H-NMR di un olio extra-vergine d oliva.

21 Regione dei carboni olefinici Methylenic and methyl carbon region Regione dei carboni carbonilici glycerol carbon region Spettro 13 C-NMR di un olio extra-vergine di oliva

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23 Analisi Discriminante (DA) Area 1 Area 2 Area 3 1 Root Root 1

24 DOP DEGLI OLI DI OLIVA EXTRA-VERGINE IN PUGLIA

25 2,5 Foggia Bari Taranto 1,5 0,5 PC2-0,5-1,5-2, PC1

26 PROGETTO INTERREG IIIA GRECIA-ITALIA ITALIA

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28 OLIO ITALIANO No. provenienza cultivar δ 13 C 1 MONOPOLI CORATINA -30,077 2 BITONTO CORATINA -30,232 3 MONOPOLI CIMA DI MOLA -30,148 4 BARI OGLIAROLA -30,200 5 MONOPOLI OLIVASTRO -30,413 6 SANNICANDRO CORATINA -30,599 7 CASTELLANA OLIVASTRO -30,424 8 CASTELLANA OLIVASTRO -30,413 9 CASTELLANA OGLIAROLA PIZZUTELLA -30, OSTUNI OGLIAROLA -30, MONTALBANO CIMA DI MELFI -30, MONTALBANO FRANTOIO -30, PALO DEL COLLE CORATINA -30, FOGGIA OGLIAROLA GARGANICA -30, FOGGIA PENDOLINO -30, TARANTO CORATINA -30, TARANTO OGLIAROLA -30, TARANTO FRANTOIO -30, BARLETTA CORATINA -30, S. SEVERO PERANZANA -30,230 OLIO GRECO No. provenienza δ 13 C 1 ZAK Nat/low -27,742 2 ZAK Nat/s -28,553 3 ZAK Nat/high -27,003 4 ZAK Nat/low -28,506 5 ZAK Nat/low -28,105 6 ZAK Nat/low -27,782 7 ZAK Kor/low -27,603 8 ZAK Kor/low -27,259 9 ZAK Kor/high -27, ZAK Kor/high -27, ZAK Kor/low -27, ZAK Kor/low -27, ZAK Kor/high -28, ZAK Kor/high -28, ZAK Kor/low -27, ZAK Kor/high -27, ZAK Kor/low -27, ZAK Kor/high -28, KORF Lian/high -28, MES Naf/low -28,406

29 VINO

30 L=Lisina Bg= Butilenglicole Et=Etanolo T=Treonina LA= Lactic Ac. A= Alanina I=Istidina P=Prolina AA= Acetic Ac. V=Valina SA=Succinico Ac. Spettro 1 H-NMR (500 MHz) di un campione di vino liofilizzato

31 4,5 3,5 Centre South North 2,5 1,5 PC2 0,5-0,5-1,5-2,5-3,5-2,5-1,5-0,5 0,5 1,5 2,5 PC1 Scatter plot degli scores delle prime due componenti principali PC1 e PC2 ottenute usando i dati NMR.

32 Centre South North Validation set 1 Root Root 1 Plot di campioni di vino provenienti da tre diverse zone geografiche, sulle prime due funzioni discriminanti, ottenuto dai dati NMR.

33 CONCLUSIONI L'elaborazione statistica ha permesso la discriminazione dei vini Pugliesi in base alla loro origine geografica. Gli Amminoacidi sembrano avere un ruolo importante nella discriminazione di vini. Le indagini NMR indagini NMR offrono diversi vantaggi come rapidità di analisi e la capacità di individuare simultaneamente un gran numero di componenti.

34 INDAGINI SU FARINE DI GRANO DURO PROVENIENTI DA ALCUNE ZONE DELL ITALIA MERIDIONALE Il primo esperimento che abbiamo eseguito ha interessato campioni di semole appartenenti a due differenti cultivars, (Ofanto e Fortore) provenienti da alcune zone caratteristiche del Sud Italia. Un tipico spettro 1 H-HR HR MAS NMR di un campione di semola è mostrato nella seguente figura.

35 Polisaccaridi Lipidi Spettro 1 H HR-MAS NMR di un campione di semola ppm

36 SPETTRO TOCSY 1 H HR-MAS

37 SPETTRO 1 H- 13 C HMQC

38 SPETTRO 1 H J-RESOLVEDJ

39 1 H AND 13 C CHEMICAL SHIFT ASSIGNMENT OF LIPIDIC MOIETY

40 NMR DATA OF SACCHARIDE MOIETIES

41 CONCLUSIONI Il metodo 1 H HR-MAS NMR è molto utile perché non richiede alcun pre-trattamento del campione. Il tempo della misura è molto breve. Attraverso una singola veloce misura si ottengono tutte le informazioni necessarie per l'analisi statistica multivariata e, inoltre, informazioni sulla composizione dei lipidi e degli zuccheri.

42 CARATTERIZZAZIONE DI SEMOLE ATTRAVERSO DETERMINAZIONI SPETTROSCOPICHE Lo scopo di questa indagine è stato quello di caratterizzare l'origine geografica e la varietà di diversi campioni di semole provenienti da diverse zone d Italia (settentrionale, centrale e meridionale) usando l 1 H HR-MAS NMR e l IRMS. Utilizzando l insieme di questi parametri, abbiamo ottenuto i seguenti risultati applicando sia l Analisi delle Componenti Principali (PCA) che l Analisi Discriminante (DA).

43 2,5 1,5 Northern Italy Central Italy Southern Italy 0,5 PC2-0,5-1,5-2, PC1

44 5 4 3 Northern Italy Central Italy Southern Italy Test set 2 1 Root Root 1

45 2,0 1,5 Colosseo Simeto 1,0 0,5 PC3 0,0-0,5-1,0-1,5-2, PC1

46 ANALISI IRMS SUI CAMPIONI DI FARINA I valori dei δ 13 C e δ 18 O per lo studio dei campioni di farina sono riportati in tabella. Sample δ O δ 13 1M M M L L L A A A V V V MSA MSA MSA MSA C

47 -24,2-24,6-25,0-25,4 13C/12C -25,8-26,2-26,6-27,0 25,5 26,5 27,5 28,5 29,5 30,5 18O/16O M L A V MSA

48 CONCLUSIONI SUI RISULTATI IRMS L'IRMS permette di differenziare la farina di grano duro da quella di grano tenero e può essere utilizzato per individuare mescolanze tra le due. Questo è un risultato importante che può essere usato per individuare frodi consistenti nell'aggiunta di farina di grano tenero (meno costoso) nella produzione della pasta.

49 CARATTERIZZAZIONE DELLA QUALITA E DELL ORIGINE GEOGRAFICA DI LATTE ITALIANO ED ESTERO Per proteggere l autenticità delle mozzarelle pugliesi è necessario determinare l origine geografica del latte utilizzato. Attraverso diverse analisi chimico-fisiche basate su metodi classici e soprattutto innovativi (NMR e IRMS) e successiva elaborazione chemometrica abbiamo cercato di differenziare il latte di provenienza autoctona (prevalentemente della zona murgiana) da quello estero (generalmente dell Europa dell Est e dell Europa Centrale)

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51 FATTORI CHE CHE INFLUENZANO I RAPPORTI ISOTOPICI DEI DEI PRODOTTI ANIMALI I rapporti isotopici dei prodotti animali dipendono dal tipo di alimentazione e dall origine dell acqua

52 rapporti isotopici 10,00 5,00 0,00-5,00-10,00-15,00-20,00-25,00 δ 13 C/ 12 C δ 15 N/ 14 N italiani -23,61 5,34 esteri -21,77 5,43 Degno di nota il δ 13 C/ 12 C. Questo è correlato alla tipologia botanica del foraggio. Infatti, erba e fieno (piante a ciclo fotosintetico C3) tendono ad aumentare il δ fino a valori compresi tra -28 e -23. Al contrario la presenza di mais, che è il maggior componente dei mangimi, può indurre una riduzione del δ fino a valori di -18.

53 LATTE ESTERO LATTE ITALIANO Confronto di spettri 1 H-NMR di un estratto acquoso di un campione di latte estero ed italiano

54 Spettro NMR (H-H-COSY) di un estratto acquoso

55 δ 1 H COSY δ 13 C Attribuzione 1,32 d 4,11 20,82 CH 3 acido lattico 2,11 s 2,35 CH glutammato 2,52 d 2,70 45,45 CH 2 acido citrico 2,70 d 2,52 45,45 CH 2 acido citrico 3,27 t 4,65 74,65 CH β-glucosio 3,65 m 3,77 73,51 CH β-galattosio 3,76 m 72,80 CH glicerolo 3,77 m 3,65 63,26 CH β-galattosio 3,91 m 3,65 69,36 CH β-galattosio 3,95 m 3,80 70,88 CH α-galattosio 4,07 t 3,71-3,95 71,22 CH α-galattosio 4,11 q 1,32 69,31 CH acido lattico 4,56 d 3,47 97,22 CH β-galattosio 4,65 d 3,27 96,65 CH β-glucosio 5,21 d 3,58 92,51 CH α-glucosio 5,24 d 3,70-3,95-4,07 93,09 CH α-galattosio

56 analisi classiche e innovative 2,5 1,5 0,5 pc2-0,5-1,5-2,5-2,0-1,5-1,0-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 italiani esteri pc1 Score plot dei campioni, codificati in base alla provenienza, sulle prime due componenti principali (analisi classiche e spettroscopiche)

57 CONCLUSIONI Discriminazione geografica tra latte italiano ed estero (legare le caratteristiche chimico-fisiche all area di produzione) Valutare come tali differenze si ripercuotano sul prodotto finale

58 NMR IMAGING (MRI) They can "see" see" " the taste of the fish Criteri definitivi sulla qualità dei prodotti ittici, basati sulle misure chimico-fisiche sono just around the corner. L NMR IMAGING permette di definire con esattezza il concetto di qualità attraverso una mappatura dei processi implicati.

59 Sulla base della consistenza, colore, lucentezza ed odore, un esperto compratore di pesce può decidere della qualità del pesce, ma è possibile identificare un set di parametri, da determinare sperimentalmente, che possa fornire una stima altrettanto affidabile della qualità? Questo è possibile eseguendo l MRI del pesce durante la crescita e sui tessuti dello stesso dopo la morte.

60 STUDIO SULLA MATURAZIONE DELL OLIVA BELLA DELLA DAUNIA ATTRAVERSO MRI Poiché il frutto dell oliva ha un alto contenuto in olio, che risuona a circa 3.5 ppm di distanza dall acqua, è stato possibile effettuare esperimenti MRI di chemical shift selettivo per identificare separatamente la distribuzione, nell interno del frutto, dell olio e dell acqua e stimare la loro variazione durante il processo di maturazione. Per una maggiore comprensione delle immagini NMR che mostrerò bisogna precisare che le immagini selettive sono come foto: le zone più chiare indicano una maggiore concentrazione del tipo di protone indagato.

61 L intensità del colore nelle immagini, tuttavia, dipende dalla sensibilità della ricevente, parametro strumentale settato al momento di ogni acquisizione, quindi differente nelle singole immagini Pertanto non è possibile effettuare analisi semi-quantitative per confronto delle differenze di intensità di colore nelle immagini ottenute. ACQUISIZIONE DEI CAMPIONI DI OLIVE Da uno stesso albero, messo a nostra disposizione dal consorzio di tutela della Bella della Daunia, sono state raccolte olive in tempi successivi come riportato nella tabella seguente.

62 Tabella 1. Elenco dei campioni analizzati CAMPIONE DATA DI RACCOLTA 1 30/10/ /11/ /11/ /12/ /01/03 6 Olive verdi in salamoia 7 Olive nere in salamoia

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64 CAMPIONE 2 ( ). a) immagine selettiva per i protoni dell acqua CAMPIONE 2 ( ). b) immagine selettiva per i protoni dei grassi CAMPIONE 3 ( ). c) immagine selettiva per i protoni dell acqua CAMPIONE 3 ( ) d) Immagine selettiva per i protoni dei grassi CAMPIONE 5 ( ) e) Immagine selettiva per i protoni dell acqua CAMPIONE 5 ( ) f) Immagine selettiva per i protoni dei grassi

65 IMMAGINI DI OLIVE PROCESSATE CAMPIONE 6 (verdi) a) immagine selettiva per i protoni dell acqua CAMPIONE 6 (verdi) b) immagine selettiva per i protoni dei grassi CAMPIONE 7 (nere) c) immagine selettiva per i protoni dell acqua CAMPIONE 7 (nere) d) immagine selettiva per i protoni dei grassi

66 Dr. Maria Antonietta Brescia, Ph.D. Dr. Vincenzo Caldarola Dr. Grazia Casiello (1 anno Ph.D.) Dr. Stefania Della Gatta (1 anno Ph.D.) Dr. Giuliano De Martino Dr. Vincenzo De Martino Dr. Maria Monfreda Dr. Tonietta Pugliese Dr. Angela Sgaramella Dr. Daniela Sacco, Ph.D. RINGRAZIAMENTI

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69 Fauhl C., Reniero F. e Guillou C. Magnetic Resonance in Chemistry Magnetic Resonance in Chemistry, 38, , (2000).

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72 a b g h c d i l e f

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