DIPARTIMENTO DI SANITA E BENESSERE ANIMALE REPARTO DI BATTERIOLOGIA SPECIALIZZATA. Relazione del Dirigente Responsabile dott.

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1 DIPARTIMENTO DI SANITA E BENESSERE ANIMALE REPARTO DI BATTERIOLOGIA SPECIALIZZATA Relazione del Dirigente Responsabile dott. Silvia Tagliabue ATTIVITÀ DI SERVIZIO CENTRO DI REFERENZA NAZIONALE PER LA LEPTOSPIROSI (CRNL) (D.Lgs ) Sierodiagnosi: Sono stati esaminati mediante agglutinazione microscopica (MAT) (MP04/019) campioni provenienti dalle Sezioni Diagnostiche (SSDD) e da altri Istituti Zooprofilattici Sperimentali (IIZZSS), prevalentemente di siero di sangue, per la ricerca di Ab verso leptospire patogene, con 8 Ag costituiti da sierovarianti rappresentative dei sierogruppi prevalenti; 549 campioni di siero di cinghiale sono stati esaminati nell ambito del piano di monitoraggio fauna selvatica. I risultati sono riportati in tabella. Isolamenti e tipizzazioni: Su 128 esami colturali eseguiti da organi e fluidi biologici di varie specie animali (suino, cane, cinghiale, bovino, riccio), 15 dei quali ancora in corso, sono stati isolati 39 ceppi da reni e urina suina e identificati come Pomona. Dei 28 campioni di cinghiali afferenti al piano di monitoraggio fauna selvatica, i 19 fino ad ora esaminati sono risultati tutti negativi. Sono stati tipizzati 9 ceppi di Leptospira per controllo identità richiesto da altro IZS. PCR: E stata rilevata Leptospira spp., poi identificata come Pomona mediante PCR/RFLP, in 8 campioni su 15 esaminati da rene suino. La tecnica PCR è stata inoltre applicata a 4 campioni di bovino e a 9 di cane, con esito negativo. E stata inoltre dimostrata Leptospira spp. in 10 campioni di reni e urina di cinghiali, su 127 esaminati con finalità monitoraggio fauna selvatica. Partecipazione a ring test internazionale MAT: Il CRNL ha partecipato, insieme con altri 90 laboratori di 46 nazionalità, al Round 5 dell International Leptospirosis MAT Proficiency Testing Scheme, organizzato dal National Serology Ref. Lab. Australia, dal Leptospirosis Ref. Centre Royal Tropical Inst. The Netherlands e dal Leptospirosis Ref. Unit Public Health Lab. Service U.K., per l assicurazione di qualità ai laboratori nella diagnosi di leptospirosi. Dai risultati ottenuti viene confermata la validità delle procedure e dei controlli applicati agli Ag diagnostici presso il CRNL. Organizzazione di ring test nazionale MAT: In ottemperanza ai compiti istituzionali del CRNL (D.Lgs. 04/10/99 Art. 2 comma c) e in accordo con l Istituto Superiore di Sanità (ISS), è stato organizzato un ring test nazionale tra gli IIZZSS. E in corso l elaborazione dei risultati. Produzione e fornitura di diagnostici a IIZZSS: Il CRNL ha fornito ad altri IIZZSS 37 ceppi di leptospire in coltura e 16 sieri anti-leptospira di produzione interna in collaborazione con il Centro Allevamento e Sperimentazione Animale, da impiegarsi rispettivamente come Ag e come controllo nella metodica MAT. Fornitura terreni colturali e kit di prelievo: Al fine di favorire le attività delle SSDD sono state fornite 45 provette di terreno EMJH selettivo liquido. Sono stati inoltre forniti 20 kit per prelievo urina. LABORATORIO DI TIPIZZAZIONE MICOBATTERI STRUTTURA COLABORANTE CENTRO DI REFERENZA PER LA TUBERCOLOSI DA M.BOVIS Identificazioni: Sono stati identificati mediante prove colturali e biochimiche tradizionali 133 ceppi su 134 esaminati, isolati presso le SSDD (103) e altri IIZZSS (21). Su tutti i ceppi più altri 10 ricevuti da altri IIZZSS (5 indefiniti e 5 di origine bovina) sono inoltre state applicate tre PCR identificative: M.tuberculosis Complex (MtbC), M.avium e Mycobacterium spp. Limitatamente ai ceppi positivi al solo genere Mycobacterium ed a quelli risultati MtbC, sono state condotte prove di approfondimento per l identificazione biologico-molecolare di M.bovis presso il Reparto Biologia Molecolare (BM). Numericamente la maggior parte dei ceppi esaminati è riconducibile alla specie bovina; 78 ceppi isolati da bovino e 1 da bufalo sono stati sottoposti nel rispetto del D.M. n /12/1995 al MP 01/063 Metodo normato di prova per l identificazione presuntiva di M.avium/bovis/tuberculosis (tecnica microbiologica) : in dettaglio sono stati identificati mediante esame microbiologico 72 M.bovis (71 da bovino e 1 da bufalo), confermati come MtbC mediante PCR (e come M.bovis mediante metodi di approfondimento biologico-molecolari) e 1 M.avium Complex (M.avium C) (da bovino), confermato come M.avium in PCR; 6 isolati da bovino risultati non M.bovis né M.avium nè M.tuberculosis alla precedente prova, appartenenti al genere Mycobacterium secondo i risultati delle 3 PCR, sono stati sottoposti ad identificazione mediante metodo di prova microbiologico non codificato (MP NC) e sono stati identificati come segue: 3 M.nonchromogenicum, 1 M.kansasii, 1 M.smegmatis e 1 M.terrae C. Inoltre, 5 ceppi isolati da bovino, sottoposti esclusivamente alle 3 PCR identificative, sono risultati MtbC. 55 ceppi isolati da altre specie animali, tutti appartenenti al genere Mycobacterium secondo i risultati delle 3 PCR (tranne uno negativo da ovino), sono stati sottoposti ad identificazione mediante MP NC e sono stati 1

2 identificati come segue: 2 M.bovis e 1 M.microti da cinghiale, 6 M.bovis da ovino (2), capra (2) e suino (2) (confermati MtbC mediante PCR), 16 M.avium C da suino (15) e tacchino (1) (confermati M.avium mediante PCR), 9 ceppi M.fortuitum C, 7 M.marinum, 6 M.nonchromogenicum, 5 M.terrae C, 1 M.kansasii e 1 M.gordonae da pesce (confermati Mycobacterium spp. mediante PCR). Le prove di PCR eseguite sui 5 ceppi batterici di origine non comunicata, sono risultate positive per MtbC. E stata stesa, in collaborazione con il Reparto BM, la rev. 1 del MP 09/004 Metodo di prova interno per la caratterizzazione di isolati del genere Mycobacterium mediante amplificazione enzimatica in vitro (PCR). Collaborazione all organizzazione di ring test nazionale isolamento M.bovis prove sensibilità terreni colturali: In ottemperanza ai compiti istituzionali del CRNT (D Lgs 04/10/99 Art. 2 comma c), si è partecipato all organizzazione di un ring test nazionale tra gli IIZZSS. Produzione e fornitura micobatteri: Sono stati forniti 36 ceppi inattivati e 9 vivi in coltura agli IIZZSS per ring test sull isolamento di M.bovis. Sono inoltre stati forniti a SSDD 6 ceppi liofilizzati. LABORATORIO DI TIPIZZAZIONE SALMONELLA Tipizzazioni: Sono stati esaminati ceppi isolati presso le SSDD e presso il Rep. Microbiologia degli Alimenti (MA), di cui tipizzati sierologicamente e biochimicamente (MP01/100 ) e 28 risultati non ascrivibili al genere Salmonella (principalmente Enterobacteriaceae). I 5 sierotipi di Salmonella più frequenti sono nell ordine: Typhimurium (502, di cui 264 var. 5-), Derby (268), S.enterica subsp. enterica 4,12: i - (194), Livingstone (176), Heidelberg (152). Secondo quanto previsto dai protocolli Enter-net, sono stati conservati tutti i ceppi isolati. Determinazioni di antibiotico resistenza: Sono stati eseguiti 58 antibiogrammi nell ambito della Decisione UE 636/2005 Monitoraggio Salmonella nei broilers. Partecipazione a ring test nazionale: Si è partecipato al 6 ring trial tra IIZZSS organizzato dal Centro di Referenza Nazionale per le Salmonellosi in campo veterinario (CRNS). L attività di sierotipizzazione controllata nel periodo risulta soddisfacente. Partecipazione a External Quality Assurance System (EQAS) del WHO Global Salmonella Surveillance Network Serotyping and susceptibility testing of Salmonella: La prova è stata eseguita su 8 ceppi di Salmonella con 11 antibiotici su 15 consigliati ottenendo un buon livello di concordanza. Fornitura ceppi e sieri: Sono stati forniti al CRNS per l esecuzione della tipizzazione fagica 451 ceppi di Salmonella, di cui 355 Typhimurium (1 D.M. 339/2000), 31 Enteritidis (1 D.M. 339/2000 e 2 Decisione UE 636/2005), 1 ceppo per conferma diagnostica (S. Oranienburg), 1 ceppo di nostra collezione per controllo (S. Moskow) e 63 ceppi appartenenti ad altri sierotipi isolati da riproduttori avicoli e da ovaiole per la produzione di uova da consumo in ottemperanza al D.M. 339/2000 (36) e alla Decisione UE 636/2005 (27). Sono stati consegnati su richiesta al Lab. di Virologia e Tossicologia degli alimenti 418 ceppi di Salmonella per ribotipizzazione. Sono stati forniti alle SSDD 88 flaconi di sieri anti-salmonella, così ripartiti: 44 di siero poliagglutinante (attraverso il Magazzino centrale) e 44 di gruppo B (12), C (14), D (10), E (8) (direttamente). LABORATORIO DI TIPIZZAZIONE BATTERI Tipizzazioni E. coli: 595 ceppi isolati presso le SSDD e presso il Rep. MA sono stati sottoposti a prove tradizionali microbiologiche di identificazione ed a sierotipizzazione verso 37 sierogruppi O; su 292 ceppi tipizzati sono risultati più frequenti i sierogruppi O103, O139, O149, O157, O2, O15, O ceppi sono stati sottoposti a PCR di screening per la ricerca di geni codificanti per le verocitotossine, seguita, per i 33 ceppi risultati positivi, dalle 3 PCR di approfondimento VT 1, VT 2, VTe; 170 ceppi sono stati sottoposti a PCR per la ricerca dei geni di adesività (eae); sono stati evidenziati 30 ceppi suini VT e positivi e 1 VT 2 positivo, 2 ceppi bovini VT 1 positivi e 85 ceppi di origine principalmente cunicola e aviare eae positivi (vedi tabella). Sono state effettuate 2 prove di agglutinazione rapida per la ricerca di E.coli K99. Tutti i ceppi testati sono stati conservati per l allestimento di successivi controlli, ricerca e produzione di vaccini stabulogeni. Identificazioni batteriche: Sono stati identificati con tecniche microbiologiche e sierologiche 111 ceppi isolati presso SSDD e Sede su 116 ceppi esaminati, suddivisi nel settore della sanità animale (75) e alimenti uomo (36). I generi batterici più rappresentati sono nell ordine Enterobacteriaceae (14), Streptococcaceae (10), Pseudomonadaceae (8), Lieviti (8), Pasteurellaceae (7), Corynebacterium (6), Staphylococcus (6), Vibrio (6), Bacillus (5), Campylobacter (5), Listeria (5), Actinomyces (4), Aeromonas (2), Brucella (2). Inoltre, sono stati identificati con metodo sierologico 18 ceppi di Yersinia enterocolitica isolati presso SSDD e Sede, appartenenti per lo più al sierogruppo O:9 (12) e 8 ceppi di Listeria monocytogenes. L utilizzo mirato del sistema Vitek, affiancato alle gallerie identificative API, ha consentito diagnosi più approfondite ed ha favorito, con il suo database, l archiviazione dei dati. Partecipazione a ring test nazionale antibiotico resistenza su Enterobacteriaceae Salmonella spp/e.coli: Si è partecipato al 1 ring trial tra IIZZSS organizzato dal Centro di Referenza Nazionale per l antibioticoresistenza in campo veterinario dell IZS di Roma (CRNAR). L esito delle prove è risultato soddisfacente. Servizio di collezione ceppi batterici liofilizzati: Sono stati forniti alle SSDD e ad altri Reparti della Sede 223 ceppi batterici liofilizzati per controllo qualità. Sono state inoltre predisposte e controllate 12 2

3 liofilizzazioni, per il mantenimento (5) e l aggiornamento (7) della collezione di ceppi batterici liofilizzati, per un totale di 244 flaconi. Su 80 ceppi batterici liofilizzati e congelati sono stati realizzati 148 controlli microbiologici (85), sierologici (38) e PCR (21). Si è proseguito nelle operazioni di controllo, riordino e riorganizzazione della collezione dei ceppi batterici liofilizzati, con revisione e/o nuova emissione delle schede tecniche dei ceppi secondo quanto richiesto dal Sistema Qualità, usufruendo del data base del sistema identificativo Vitek. Produzione e fornitura sieri: Sono stati forniti alle SSDD 38 flaconi di sieri anti-e.coli (27 K88 e 11 K99) prodotti in collaborazione con il Centro Allevamento e Sperimentazione Animale. Servizio controllo sterilità vaccini stabulogeni: Sono stati effettuati 112 controlli. ATTIVITÀ DI RICERCA CENTRO DI REFERENZA NAZIONALE PER LA LEPTOSPIROSI Studio epidemiologico sulla leptospirosi suina nella Regione Lombardia (PRC ): Sono stati elaborati i risultati finali delle prove sierologiche. E continuato lo sviluppo di metodiche identificative biologico-molecolari finalizzate al controllo dei ceppi di Leptospira di riferimento in collaborazione con il Reparto BM. Aggiornamento e utilizzo di metodiche biomolecolari per la diagnosi di leptospirosi su ceppi isolati e su materiale patologico (PRC ): Si è proseguito nello sviluppo di protocolli per l identificazione delle diverse genospecie patogene di Leptospira mediante metodiche PCR e PCR/RFLP affiancate ad altre tecniche di approfondimento, di competenza del Reparto BM. Sono stati messi a punto ed applicati protocolli per l evidenziazione diretta di Leptospira in campioni biologici di suino, cane e cinghiale. Elaborazione dati sierologici leptospirosi: Nell ambito del 1 Workshop Nazionale di Epidemiologia Veterinaria (Perugia 12-13/6/06) si è presentato un lavoro di raccolta ed elaborazione dei dati sierologici nazionali MAT leptospirosi relativi al triennio LABORATORIO DI TIPIZZAZIONE MICOBATTERI Applicazione e validazione di una metodica di biologia molecolare per l identificazione e la tipizzazione di micobatteri tubercolari PRC In collaborazione con l IZS del Mezzogiorno: Nell ambito del progetto il CRNT ha organizzato un test interlaboratprio sulle PCR identificative descritte da Kulski per la determinazione di Mycobacterium spp., del gruppo MtbC e di M.avium. Progettazione e sviluppo di una banca dati dei profili genetici di M. bovis a supporto delle indagini epidemiologiche condotte in focolai di tubercolosi bovina PRC : Si è provveduto al mantenimento in collezione di tutti i ceppi di riferimento destinati al controllo qualità e di tutti i ceppi di M.bovis isolati nel territorio di competenza IZSLER, destinati all applicazione di metodiche di epidemiologia molecolare. Si è inoltre provveduto alla fornitura al Reparto BM di ceppi inattivati. Monitoraggio della presenza di tubercolosi e leptospirosi nel cinghiale e tubercolosi nei cervidi PRC : Sono stati isolati e tipizzati mediante l applicazione di tecniche microbiologiche e biologicomolecolari 1 ceppo di M.microti e 2 ceppi di M.bovis. LABORATORIO DI TIPIZZAZIONE SALMONELLA Invio dati sierotipizzazioni Salmonella: In qualità di Centro di Riferimento biregionale per la veterinaria afferente alla rete Enter-Vet Italia, tutti i dati sono stati sistematicamente inviati al CRNS. LABORATORIO DI TIPIZZAZIONE BATTERI Tipizzazione E.coli: Il laboratorio Tipizzazioni E. coli IZSLER è stato riconosciuto quale Centro di Riferimento biregionale per la veterinaria, afferente al laboratorio di referenza per E.coli nella Comunità Europea, attivato presso l ISS. L attività di ricerca ha visto il consolidarsi del rapporto di collaborazione con l Università di Bari e l attivazione di nuovi filoni di ricerca con l Università di Milano e di Napoli, sviluppati su ceppi isolati da: coniglio selvatico, coniglio in allevamento intensivo, tacchini, galline ovaiole e gabbiano corso. Si sono applicate tecniche di sieroagglutinazione lenta per la determinazione dell antigene somatico O, prove biochimiche in macrometodo per la determinazione del biotipo e PCR per la ricerca di geni di patogenicità (gene eae).sono stati ricevuti e tipizzati sierologicamente 320 ceppi. 91 di questi sono stati sottoposti a PCR per la ricerca del gene eae e 35 alla determinazione del biotipo. Sono stati inviati all UniBA 99 ceppi di E.coli da noi isolati da coniglio e 56 ceppi di coniglio selvatico di proprietà UniMI da noi tipizzati, per le prove di competenza (geni di patogenicità AF/R1, AF/R2). Tipizzazione Yersinia enterocolitica: Nell ambito di una ricerca mirata di Yersinia enterocolitica sono stati tipizzati a livello di biotipo 38 ceppi, appartenenti principalmente al biovar 3. Studio delle reattività aspecifiche nella diagnosi della brucellosi bovina PRC : Si sta procedendo alla produzione e purificazione dei seguenti antigeni: 1) Ag Brucella S-LPS, 2) Ag Brucella R- LPS, 3) Ag Yersinia enterocolitica S-LPS ed al loro successivo utilizzo per l allestimento di prove sierologiche ELISA. 3

4 Specie animale campioni esaminati CENTRO DI REFERENZA NAZIONALE PER LA LEPTOSPIROSI AB RISULTATI SIERODIAGNOSI LEPTOSPIROSI 2006 BB CC GG IC PP SH TT Totale positività Anatra Bovino Bufalo Camoscio Cane Capra Capriolo Cavallo Cervo Cinghiale Faina Gatto Indefinita Lepre Lupo Orso Ovino Ratto Scoiattolo Suino Tasso Topo Uomo Volpe TOTALE I campioni sono stati analizzati con 8 sierovarianti (AB= Bratislava sierogruppo Australis, BB= Ballum sierogruppo Ballum, CC= Canicola. sierogruppo Canicola, GG= Grippotyphosa. sierogruppo Grippotyphosa, IC= Copenhageni sierogruppo Icterohaemmorrhagiae, PP= Pomona. sierogruppo Pomona, SH= Hardjo sierogruppo Sejroe, TT= Tarassovi sierogruppo Tarassovi) per un totale di MAT/screening. 4

5 LABORATORIO DI TIPIZZAZIONE E. COLI RISULTATI TIPIZZAZIONI E. COLI 2006 isolamento C. esam. C. tipizz. Sierotipizzazione VT eae O 103 O 139 O 149 O 157 O 2 O 15 O 141 Altri O *C. esam VT 1 VT 2 VT e Bovino Bufalo Cane Capriolo Cervo Cigno Coniglio Coniglio selv Gabbiano corso Gallo Gatto Indefinita Lepre Pernice Pollo Ovino Suino Tacchino TOTALE C. esam: ceppi esaminati C. tipizz.: ceppi tipizzati VT *C. esam: ceppi esaminati mediante PCR VT screening C. esam pos 5