HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)

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1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Codice GM333 Seconda edizione HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è un saggio di ibridazione in situ in fluorescenza (FISH) diretta, progettato per la determinazione quantitativa dell'amplificazione del gene HER2 in campioni tissutali di cancro mammario fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) e in campioni FFPE di pazienti con adenocarcinoma metastatico dello stomaco o della giunzione gastro-esofagea. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è destinato all'utilizzo in combinazione con HercepTest nella valutazione di pazienti che possono trarre vantaggio dalla terapia con Herceptin. Il flacone contiene una quantità di reagente sufficiente per 20 test. Reagenti accessori da utilizzare in combinazione con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Codice Nome prodotto GM300 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) GM301 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) GM302 ISH Pepsin (Dako Omnis) GM303 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) GM304 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 1/56

2 Sommario Pagina Uso previsto... 3 Principio della procedura - Mammella... 4 Reagenti - Mammella... 5 Precauzioni - Mammella... 6 Conservazione - Mammella... 7 Preparazione dei campioni - Mammella... 7 ISTRUZIONI PER L'USO - Mammella... 8 A. Preparazione dei reagenti - Mammella... 8 B. Procedura di colorazione - Mammella Controllo di qualità - Mammella Interpretazione della colorazione - Mammella Limitazioni - Mammella Caratteristiche di prestazione Mammella Risoluzione dei problemi - Mammella Appendice 1 - Mammella Appendice 2 - Mammella Cenni introduttivi - Ambito gastrico Principio della procedura - Gastrico Reagenti - Gastrico Precauzioni - Gastrico Conservazione - Gastrico Preparazione dei campioni - Gastrico ISTRUZIONI PER L'USO - Gastrico A. Preparazione dei reagenti - Gastrico B. Procedura di colorazione - Gastrico Controllo di qualità - Gastrico Interpretazione della colorazione - Gastrico Limitazioni - Gastrico Caratteristiche di prestazione - Gastrico Risoluzione dei problemi - Gastrico Appendice 3 - Gastrico Appendice 4 - Gastrico Appendice 5 - Gastrico Bibliografia Spiegazione dei simboli ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 2/56

3 Uso previsto Per uso diagnostico in vitro. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è una sonda di ibridazione per saggi di ibridazione in situ in fluorescenza diretta (FISH) automatizzati eseguiti su strumenti Dako Omnis. Questo prodotto, in combinazione con dispositivi reagenti accessori, deve essere utilizzato per la determinazione quantitativa dell'amplificazione del gene HER2 in campioni tissutali fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) di cancro mammario e in campioni FFPE di pazienti con adenocarcinoma dello stomaco, inclusa la giunzione gastro-esofagea.her2 IQFISH pharmdx è destinato all'utilizzo in combinazione con HercepTest nella valutazione di pazienti che possono trarre beneficio dalla terapia con Herceptin (trastuzumab) (vedere il foglietto informativo dell'herceptin ). Nell'ambito del cancro mammario, i risultati ottenuti con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) devono essere utilizzati come complemento alle informazioni clinicopatologiche attualmente impiegate per la valutazione della prognosi di pazienti affetti da cancro mammario allo stadio II con linfonodi positivi. Nel presente documento, l'adenocarcinoma dello stomaco o della giunzione gastro-esofagea viene anche indicato con l'espressione "cancro gastrico". Per l'applicazione nell'ambito del cancro mammario, fare riferimento alle pagine Per l'applicazione nell'ambito del cancro gastrico, fare riferimento alle pagine Importante: tenere in considerazione le differenze fra il tessuto tumorale mammario e il tessuto tumorale gastrico, in particolare, quelle riportate nelle sezioni Interpretazione della colorazione. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 3/56

4 Cancro mammario Cenni introduttivi - Mammella Il gene umano HER2 (noto anche come ERBB2 o NEU) è localizzato sul cromosoma 17 e codifica la proteina HER2 o p185 HER2. La proteina HER2 è un recettore di membrana ad attività tirosin-chinasica omologo del recettore del fattore di crescita dell'epidermide (EGFR o HER1) (1-2). Il gene HER2 è presente in due copie in tutte le cellule diploidi normali. In una percentuale dei pazienti affetti da cancro mammario, l'amplificazione del gene HER2 è parte del processo di trasformazione maligna e di progressione tumorale (3-8). L'amplificazione del gene HER2 porta generalmente all'iperespressione della proteina HER2 sulla superficie delle cellule mammarie tumorali (9). L'amplificazione del gene HER2 e/o l'iperespressione della proteina corrispondente sono state dimostrate nel 20-25% dei casi di cancro mammario (10). Tale sovraregolazione è associata a prognosi infausta, aumentato rischio di ricorrenza e ridotta sopravvivenza. Numerosi studi hanno dimostrato che lo stato di HER2 è correlato alla sensibilità o resistenza ad alcune terapie chemioterapiche (11). Il riscontro di elevati livelli di iperespressione della proteina HER2 o di amplificazione del gene HER2 è essenziale per l'avvio di una terapia a base di Herceptin, un anticorpo monoclonale diretto contro la proteina HER2. Studi clinici hanno dimostrato che i pazienti i quali beneficiano maggiormente della terapia con Herceptin sono i pazienti i cui tumori presentano livelli elevati di iperespressione della proteina HER2 e/o di amplificazione del gene HER2 (12). Questo prodotto (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) è costituito da una miscela di sonde IQISH per FISH diretta automatizzata, in grado di rilevare l'amplificazione del gene HER2. Questo prodotto deve essere utilizzato sullo strumento Dako Omnis in combinazione con i dispositivi reagenti specificati ed è ottenuto tramite il saggio di amplificazione del gene HER2, HER2 IQFISH pharmdx, codice K5731, eseguito manualmente. Principio della procedura - Mammella HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è una miscela di sonde IQISH, costituita da una miscela di sonde di DNA marcate con Texas Red che copre una regione di 218 kb, comprendente il gene HER2 sul cromosoma 17, e da una miscela di sonde di acido peptidonucleico (PNA) (13) fluoresceinate dirette contro la regione centromerica del cromosoma 17 (CEN-17). L'ibridazione specifica dei due bersagli comporta la generazione di un evidente segnale fluorescente rosso in corrispondenza di ciascun locus del gene HER2 e un evidente segnale fluorescente verde in corrispondenza del centromero di ciascun cromosoma 17. La valutazione dell'amplificazione del gene HER2 tramite HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è un metodo interamente automatizzato sullo strumento Dako Omnis. Il software della workstation Dako Link Omnis consente di selezionare tre diversi protocolli convalidati per la colorazione HER2 FISH. I protocolli differiscono solo per i tempi di digestione con pepsina, pertanto è possibile scegliere tra 10 minuti (protocollo breve), 15 minuti (protocollo medio) e 20 minuti (protocollo lungo). Ulteriori dettagli verranno forniti di seguito. Per l'analisi iniziale è consigliabile utilizzare il protocollo medio. Completata la procedura di colorazione sullo strumento Dako Omnis, i campioni vengono montati con Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e coperti con un vetrino coprioggetto. L'uso di un microscopio a fluorescenza dotato di filtri appropriati (vedere l'appendice 2) consente di localizzare le cellule tumorali e di eseguire il conteggio dei segnali rossi (HER2) e verdi (CEN-17). Successivamente, viene calcolato il rapporto HER2/CEN-17. Le cellule normali nella sezione tissutale analizzata vengono utilizzate come controllo positivo interno della colorazione. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla sezione "Interpretazione della colorazione". ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 4/56

5 Cancro mammario Consultare il Manuale utente di Dako Omnis per istruzioni dettagliate sul caricamento e lo scaricamento di vetrini, ISH Lid (Dako Omnis), reagenti, liquidi di carico e liquidi di scarico. Reagenti - Mammella HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e i reagenti accessori possono essere ordinati separatamente come singoli reagenti. Materiali forniti HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 m, pronto all'uso, miscela di sonde di DNA HER2 marcate con Texas Red e sonde di PNA CEN-17 fluoresceinate, fornite in tampone di ibridazione IQISH. Il prodotto HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) viene spedito in ghiaccio secco. Per verificare che il reagente non sia stato esposto a temperature elevate durante il trasporto, accertarsi che vi sia ancora ghiaccio secco al momento della consegna. I flaconi di reagente con contenuto scongelato devono essere sempre mantenuti e conservati in posizione verticale. Il flacone di reagente contiene una sfera di metallo rivestita in oro che consente la miscelazione del reagente tramite il Dispositivo di miscelazione Dako Omnis (vedere il Manuale utente del Dispositivo di miscelazione Dako Omnis). È importante miscelare accuratamente il reagente prima del caricamento su Dako Omnis. Materiale necessario ma non fornito Reagenti accessori Per l'esecuzione dell'analisi dell'amplificazione del gene HER2con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), è necessario che sullo strumento Dako Omnis siano caricati i reagenti seguenti: ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, nella concentrazione 20x, da diluire 1:20 in una bottiglia di carico Dako Omnis da 3,5 l (codice GC109). Il prodotto contiene un agente antimicrobico e un colorante verde inerte per una maggiore semplicità di identificazione e di utilizzo. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml di etanolo al 96% (pronto all'uso). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml, soluzione di pepsina A (pronta all'uso), ph 2,0. Contiene uno stabilizzante e un agente antimicrobico. La pepsina viene spedita in ghiaccio secco. Per verificare che il reagente non sia stato esposto a temperature elevate durante il trasporto, accertarsi che vi sia ancora ghiaccio secco al momento della consegna. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml, tampone salino di sodio citrato con concentrazione 20x, da diluire 1:20 in una bottiglia di carico Dako Omnis da 3,5 l (codice GC109). Il prodotto contiene un agente microbico, un detergente e un colorante giallo inerte per una maggiore semplicità di identificazione e di utilizzo. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml di mezzo di montaggio per fluorescenza con DAPI (pronto all'uso). Anche se non vengono forniti con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), i reagenti di cui sopra sono descritti di seguito. Per ulteriori informazioni, consultare le istruzioni per l'uso dei singoli dispositivi. Reagenti e dispositivi aggiuntivi Dako Omnis, codice GI100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), codice GC807 Clearify, codice GC810 Dispositivo di miscelazione Dako Omnis, codice GC116 ISH Lid, codice GC102 ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 5/56

6 ISH Cleaning Solution, codice GC207 Vetrino coprioggetto di vetro per il montaggio (24 mm x 50 mm) Cancro mammario Per l'uso di reagenti e dispositivi aggiuntivi, consultare i manuali utente di base e avanzato di Dako Omnis. Apparecchiatura e accessori per microscopia Filtri per microscopio a fluorescenza: filtro doppio DAPI e FITC/Texas Red oppure filtri singoli FITC e Texas Red. Per ulteriori informazioni, vedere l'appendice 2. L'uso del filtro DAPI con un ingrandimento elevato influisce negativamente sull'intensità del segnale. È consigliabile evitare tempi di esposizione prolungati. Utilizzare un microscopio a fluorescenza con lampada al mercurio da 100 watt come sorgente di luce. Si sconsiglia l'utilizzo di sorgenti di luce diverse con questi filtri. Raccoglitore per vetrini per microscopia (contenitore di cartone per 20 vetrini, con chiusura a cerniera o simile). Precauzioni - Mammella 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Per uso professionale. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) contiene 10-<25% di carbonato di etilene e 3-<5% sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è marcato come segue: H319 P280 Attenzione P264 P305 + P351 + P338 Provoca grave irritazione oculare. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. Lavarsi accuratamente le mani dopo l uso. IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Di regola, non è consentito ai minori di 18 anni di lavorare con questo prodotto. Gli utenti devono essere accuratamente informati relativamente alla procedura di lavoro adeguata, alle proprietà pericolose del prodotto e alle istruzioni di sicurezza necessarie. Fare riferimento alla scheda di sicurezza per ulteriori informazioni. 4. I campioni di tessuto, prima e dopo la fissazione, e tutti i materiali esposti ad essi devono essere manipolati come potenziali vettori di infezione e smaltiti con le opportune precauzioni (14). Non pipettare mai i reagenti con la bocca ed evitare che reagenti e campioni entrino in contatto con la cute e le membrane mucose. In caso di contatto dei reagenti con zone sensibili, lavare la zona con abbondante acqua. 5. Ridurre al minimo la contaminazione microbica del reagente per evitare risultati incorretti. 6. L'impiego di metodi di fissazione e spessori dei campioni diversi da quelli specificati potrebbe esercitare effetti negativi sulla morfologia del tessuto e/o sull'intensità del segnale. 7. Il reagente è stato diluito nel modo ottimale. L'ulteriore diluizione potrebbe comprometterne le prestazioni. 8. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la cute. Consultare la scheda di sicurezza del materiale (SDS) per ulteriori informazioni. 9. La soluzione non utilizzata deve essere smaltita in conformità alle normative locali e nazionali vigenti in materia. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 6/56

7 Cancro mammario Conservazione - Mammella Conservare HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) al buio, a un massimo di 18 C (temperatura consigliata: da -18 C a -25 C). I fl aconi di reagente scongelato devono essere sempre tenuti in posizione verticale. Il congelamento e lo scongelamento del reagente per un massimo di 10 volte non influisce sulle prestazioni. Non lasciare questo componente a temperatura ambiente. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e reagenti accessori: ISH Pepsin (Dako Omnis) e Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) possono subire alterazioni se esposti al calore. Non lasciare questi componenti a temperatura ambiente. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e il reagente accessorio Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) possono subire alterazioni se esposti a livelli di luce eccessivi. Non conservare questi componenti né eseguire l'analisi in condizioni di luce intensa, come ad esempio la luce solare diretta. Conservare i reagenti accessori ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) e Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) al buio, a una temperatura di 2-8 C. Conservare ISH Pepsin (Dako Omnis) a una temperatura di C. Durante la conservazione il tappo del reagente, incluso il tappo superiore a scatto, deve rimanere chiuso per tutti i reagenti. Le soluzioni diluite (soluzione di lavoro ISH Stringent Wash Buffer e soluzione di lavoro ISH Pre- Treatment Solution) possono essere conservate a 2-8 C per 30 giorni. Non utilizzare alcun reagente dopo la data di scadenza stampata sul relativo contenitore. Durante la conservazione il tappo del reagente, incluso il tappo superiore a scatto, deve rimanere chiuso. Se i reagenti sono conservati in condizioni diverse da quelle specificate, è necessario verificarne le prestazioni (15). Non sono stati osservati segni evidenti che suggeriscano l'instabilità di questo prodotto. Pertanto, è importante esaminare cellule normali nella sezione tissutale analizzata. Qualora si ottenga un pattern di fluorescenza inatteso e si sospetti un problema associato a HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) o ai relativi reagenti accessori, contattare l'assistenza tecnica Dako Stabilità sullo strumento Dako Omnis La stabilità di HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e quella dei reagenti accessori ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) e ISH Pepsin (Dako Omnis) sullo strumento è di 80 ore. La stabilità sullo strumento di ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) e ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) diluiti è di 7 giorni. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente. In caso di utilizzo di reagenti scaduti lo strumento Dako Omnis genera un avviso, tutti i vetrini colorati con il reagente scaduto vengono impostati sullo stato "sospetto" e nel registro vetrini sulla workstation viene indicato che è stato utilizzato un reagente scaduto. Preparazione dei campioni - Mammella I campioni ottenuti tramite biopsie, escissioni o resezioni devono essere manipolati in modo tale da preservare il tessuto per l'analisi FISH. Utilizzare per tutti i campioni i metodi standard di processazione dei tessuti per la colorazione immunocitochimica (16). Sezioni incluse in paraffina Sono idonei all'uso soltanto i tessuti conservati in formalina tamponata neutra e inclusi in paraffina. Ad esempio, i campioni devono essere bloccati in uno spessore di 3 o 4 mm e fissati per ore in formalina tamponata neutra. Successivamente, i tessuti devono essere disidratati applicando una serie ascendente di alcol e xilene, quindi infiltrati con paraffina fusa mantenuta a una temperatura massima di 60 C. Tessuti fissati e inclusi in modo corretto durano per un periodo di tempo indefinito prima del taglio e del montaggio dei vetrini se conservati in un luogo fresco (15-25 C) (16-17). Fissativi diversi non sono idonei. I campioni tissutali devono essere tagliati in sezioni di 4-6 µm. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 7/56

8 Cancro mammario I vetrini necessari per l'analisi dell'amplificazione del gene HER2 e per la verifica della presenza del tumore devono essere preparati contemporaneamente. Si consiglia di preparare almeno due sezioni seriali, una sezione, colorata con ematossilina ed eosina (colorazione H&E), per la verifica della presenza del tumore e una sezione per l'analisi dell'amplificazione del gene HER2. Si consiglia di montare le sezioni tissutali sui vetrini Dako FLEX IHC Microscope Slides, codice K8020. In alternativa, è possibile utilizzare i vetrini (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ). Verificare che la data di scadenza dei vetrini non sia già trascorsa. I campioni devono essere analizzati entro 6 mesi dal taglio, se conservati a 2-25 C. NOTA: i campioni tissutali devono essere posizionati sul vetro, entro l'area di colorazione definita del vetrino. Per le dimensioni dell'area di colorazione del vetrino, consultare il Manuale utente di base di Dako Omnis. ISTRUZIONI PER L'USO - Mammella A. Preparazione dei reagenti - Mammella A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Il flacone per HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) contiene una sfera di metallo rivestita in oro utilizzata per la miscelazione. Prima del caricamento del flacone su Dako Omnis, il reagente deve essere scongelato e accuratamente miscelato, poiché si separa in fasi durante il congelamento. Per la miscelazione della sonda usare il Dispositivo di miscelazione Dako Omnis. Per ulteriori informazioni sulla miscelazione della sonda con il Dispositivo di miscelazione Dako Omnis, consultare il relativo Manuale utente. 1. Estrarre il flacone di HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) dal congelatore. 2. Caricare il flacone nel Dispositivo di miscelazione Dako Omnis. 3. Collegare il Dispositivo di miscelazione e verificare che la spia di stato verde sia accesa. Selezionare il programma "Scongelamento + miscelazione". Importante: i flaconi conservati a temperature inferiori a 25 C devono essere scongelati appena prima del ca ricamento nel Dispositivo di miscelazione Dako Omnis e sottoposti al programma "Miscelazione". 4. Rimuovere il flacone dal dispositivo di miscelazione. 5. Aprire il tappo superiore a scatto, ripiegarlo all'indietro e bloccarlo nell'intaglio (per ulteriori informazioni, consultare il Manuale utente di base di Dako Omnis). 6. Caricare immediatamente il flacone nel Reagent Storage Module (modulo di conservazione reagenti) sullo strumento Dako Omnis. Se durante il ciclo di colorazione si utilizza la funzione di caricamento continuo del reagente, assicurarsi che fra la miscelazione e l'aspirazione del flacone su Dako Omnis trascorrano almeno 10 minuti. La sonda HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) può essere scongelata e utilizzata ripetutamente per un massimo di 10 volte. Miscelare sempre la sonda HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) appena prima di caricarla sullo strumento. Non scuotere. La stabilità totale di ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sullo strumento è di 80 ore quando il reagente viene conservato nel Reagent Storage Module (modulo di conservazione reagenti) su Dako Omnis. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente (vedere sopra). Dopo il tempo nello strumento Dako Omnis, è necessario riportare immediatamente HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) a un massimo di 18 C (temperatura consigliata: da -18 C a -25 C). ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 8/56

9 Cancro mammario A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Preparare una soluzione di lavoro diluendo la soluzione concentrata ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20 come segue: 1. Riempire una bottiglia di carico Dako Omnis da 3,5 l, contrassegnata come tampone PT (etichetta blu), con acqua deionizzata fino alla linea di riempimento (3,325 l). Verificare che la bottiglia di carico sia posizionata su una superficie orizzontale prima del riempimento. 2. Versare nella bottiglia di carico l'intero contenuto di una bottiglia di soluzione concentrata da 175 ml di ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis). 3. Trasferire l'etichetta staccabile dalla bottiglia della soluzione concentrata alla bottiglia di carico. Chiudere il coperchio della bottiglia di carico e capovolgerla delicatamente per 2-3 volte. 4. Utilizzare lo scanner di codici a barre manuale Dako Omnis per identificare il reagente (eseguire la scansione dell'etichetta staccabile e della bottiglia di carico). 5. Caricare immediatamente la bottiglia di carico sullo strumento Dako Omnis. La soluzione diluita conservata sullo strumento Dako Omnis può essere utilizzata entro 7 giorni. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente (vedere sopra). La soluzione diluita inutilizzata può essere conservata a 2-8 C per 30 giorni. Dopo la conservazione al freddo, assicurarsi che la soluzione diluita sia in equilibrio ad almeno 18 C prima del caricamento su Dako Omnis. NOTA: eliminare la soluzione diluita se appare torbida. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Preparare una soluzione di lavoro diluendo il tampone concentrato ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20 come segue: 1. Riempire una bottiglia di carico Dako Omnis da 3,5 l, contrassegnata come tampone PT (etichetta blu), con acqua deionizzata fino alla linea di riempimento (3,325 l). Verificare che la bottiglia di carico sia posizionata su una superficie orizzontale prima del riempimento. 2. Versare l'intero contenuto di una bottiglia di soluzione concentrata da 175 ml di ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) nella bottiglia di carico. 3. Trasferire l'etichetta staccabile dalla bottiglia della soluzione concentrata alla bottiglia di carico. Chiudere il coperchio della bottiglia di carico e capovolgerla delicatamente per 2-3 volte. 4. Utilizzare lo scanner di codici a barre manuale Dako Omnis per identificare il reagente (eseguire la scansione dell'etichetta staccabile e della bottiglia di carico). 5. Caricare immediatamente la bottiglia di carico sullo strumento Dako Omnis. La soluzione diluita conservata sullo strumento Dako Omnis può essere utilizzata entro 7 giorni. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente (vedere sopra). La soluzione diluita inutilizzata può essere conservata a 2-8 C per un massimo di 30 giorni. Dopo la conservazione al freddo, assicurarsi che la soluzione diluita sia in equilibrio ad almeno 18 C prima del caricamento su Dako Omnis. NOTA: eliminare la soluzione diluita se appare torbida. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) è un reagente pronto all'uso. Prima del caricamento su Dako Omnis, aprire il tappo superiore a scatto, ripiegarlo all'indietro e bloccarlo nell'intaglio. La stabilità totale di ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) sullo strumento è di 80 ore, quando il reagente viene conservato nel Reagent Storage Module (modulo di conservazione reagenti) su Dako Omnis. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente (vedere sopra). Al termine del ciclo è possibile riportare ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) alla temperatura di conservazione (2-8 C) per risparmiare tempo di stabilità sullo strumento. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 9/56

10 Cancro mammario A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) è un reagente pronto all'uso. Prima del caricamento su Dako Omnis verificare che il reagente sia stato scongelato, quindi aprire il tappo superiore a scatto, ripiegarlo all'indietro e bloccarlo nell'intaglio. La stabilità totale di ISH Pepsin (Dako Omnis) sullo strumento è di 80 ore quando il reagente viene conservato nel Reagent Storage Module (modulo di conservazione reagenti) su Dako Omnis. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente (vedere sopra). Al termine del ciclo è possibile riportare ISH Pepsin (Dako Omnis) alla temperatura di conservazione (-18-8 C) per risparm iare tempo di stabilità sullo strumento. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) è un mezzo di montaggio pronto all'uso utilizzato al di fuori dello strumento Dako Omnis. Riportare Fluorescence Mounting Medium alla temperatura di conservazione (2-8 C) immediatament e dopo l'uso. A.7 Accessori aggiuntivi Sullo strumento Dako Omnis possono essere caricati anche i seguenti accessori: acqua deionizzata, Wash Buffer 20x (Dako Omnis, codice GC807) diluito, Clearify (codice GC810), ISH Cleaning Solution (codice GC207), e ISH Lid (Dako Omnis, codice GC102) come specificato nei Manuali utente di Dako Omnis. B. Procedura di colorazione - Mammella B.1 Note sulla procedura HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è la sonda di ibridazione per saggi di ibridazione in situ in fluorescenza diretta (FISH) automatizzati eseguiti sullo strumento Dako Omnis e, insieme ai reagenti accessori GM300, GM301, GM302, GM303 e GM304 (GM304 fuori dallo strumento), è destinata all'uso nella determinazione quantitativa dell'amplificazione del gene HER2. Prima dell'uso, l'utente deve leggere attentamente tutte le istruzioni e acquisire dimestichezza con tutti i componenti e le relative precauzioni. La procedura di colorazione FISH automatizzata su Dako Omnis include le operazioni di deparaffinazione delle sezioni tissutali, recupero del bersaglio, digestione con pepsina, ibridazione e lavaggio stringente. I vetrini vengono scaricati nella Unloading Station (stazione di scaricamento) a secco. Tutte le fasi del protocollo sono preimpostate nel software Dako Omnis. Consultare i Manuali utente di Dako Omnis per istruzioni sul caricamento di vetrini, ISH Lid, reagenti e così via. Nel software Dako Omnis sono preimpostati tre protocolli HER2 IQFISH convalidati: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium e HER2 IQFISH Pepsin Long, che differiscono solo per i tempi di digestione con pepsina e possono essere selezionati per ciascuno dei cinque vetrini nel rack dei vetrini. Ciò consente l'ottimizzazione della digestione tissutale che può variare in base alle condizioni preanalitiche. Il protocollo HER2 IQFISH Pepsin Medium è considerato il protocollo standard. I tre diversi protocolli di colorazione possono essere visualizzati sulla workstation Dako Link Omnis. B.2. Prima della procedura di colorazione 1. Tramite il software della workstation Dako Link Omnis, scegliere il protocollo HER2 IQFISH da applicare a ciascun vetrino. 2. Stampare le etichette dei vetrini e applicarle ai vetrini. 3. Collocare i vetrini nel rack dei vetrini. Per ulteriori informazioni, consultare il Manuale utente di base di Dako Omnis. Un rack dei vetrini può contenere da uno a cinque vetrini. Si consiglia di sottoporre a un ciclo di colorazione HER2 IQFISH almeno due vetrini. 4. Caricare il rack dei vetrini sullo strumento Dako Omnis. 5. Caricare il coperchio ISH Lid (uno per rack di vetrini) sullo strumento Dako Omnis. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 10/56

11 Cancro mammario 6. Verificare che le bottiglie di carico con i liquidi siano sullo strumento e siano state registrate dallo strumento Dako Omnis. Bottiglie di carico con i liquidi: Clearify (agente chiarificante), ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) diluito, ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) diluito e Wash Buffer (Dako Omnis) diluito. 7. Caricare ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) e ISH Pepsin (Dako Omnis), oltre alla sonda HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) miscelata immediatamente prima e ISH Cleaning Solution, in Reagent Storage Module (modulo di conservazione reagenti). Verificare che tutti i tappi superiori a scatto siano aperti. 8. Seguire le istruzioni sul touch screen e toccare "Done" (Fine) per avviare la procedura di colorazione. B.3. Procedura di colorazione La procedura di colorazione HER2 IQFISH sullo strumento Dako Omnis (riepilogata nella Tabella 1) può essere monitorata sulla workstation Dako Link Omnis: Tabella 1. Panoramica semplificata delle procedure dei protocolli di colorazione HER2 IQFISH. Passaggio Reagente Tempo e temperatura Sparaffinatura Recupero del bersaglio Clearify (agente chiarificante) ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) 10 minuti, 38 C 15 minuti, 97 C Lavaggio ISH Ethanol Solution, 96% 2 x 3 minuti, 32 C (Dako Omnis) Digestione* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 minuti, 15 minuti o 20 minuti Essiccazione 15 minuti, 45 C Denaturazione 10 minuti, 66 C Ibridazione HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 75 minuti, 45 C Lavaggio stringente ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 10 minuti, 61 C * Utilizzando i protocolli HER2 IQFISH indicati sopra, è possibile scegliere fra tre tempi di digestione con pepsina convalidati. Se non è necessario eseguire a breve ulteriori colorazioni ISH, riportare tutti i reagenti alle temperature di conservazione consigliate. B.4. Dopo la procedura di colorazione Scaricare i vetrini e applicare fino a 30 µl di Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) contenente DAPI sull'area bersaglio del vetrino. La sezione di tessuto deve essere completamente ricoperta da Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Applicare un vetrino coprioggetto di vetro. NOTA: è possibile eseguire una lettura dei vetrini dopo 15 minuti o entro 7 giorni dal montaggio. Tuttavia, i preparati potrebbero sbiadire se i vetrini sono esposti a luce o temperature eccessive. Per ridurre al minimo tale rischio, conservare i vetrini al buio a C. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 11/56

12 Cancro mammario Controllo di qualità - Mammella 1. I segnali devono essere intensi, netti e di facile valutazione. 2. Le cellule normali consentono un controllo interno del ciclo di colorazione. Le cellule normali devono presentare 1-2 segnali verdi chiaramente visibili, che indicano la riuscita ibridazione della sonda di PNA CEN-17 con la regione centromerica del cromosoma 17. Le cellule normali devono presentare anche 1-2 segnali rossi chiaramente visibili che indicano la riuscita ibridazione della sonda di DNA HER2 con i geni HER2. A causa del taglio tissutale, alcune cellule normali presenteranno un numero di segnali inferiore ai due previsti per ciascun colore. La mancata rilevazione di segnali nelle cellule normali indica la non riuscita del saggio: i risultati devono essere considerati non validi. 3. La morfologia nucleare deve risultare conservata all'esame con un filtro DAPI. La presenza di numerose cellule fantasma e una morfologia nucleare generale alterata indicano una digestione eccessiva del campione, con conseguente perdita o frammentazione dei segnali. I campioni di questo tipo devono essere considerati non validi. 4. Devono essere presenti almeno 20 cellule tumorali idonee alla valutazione. 5. Le differenze tra i laboratori nell'esecuzione delle procedure di fissazione, processazione e inclusione del tessuto possono determinare una variabilità nei risultati, per cui si rende necessaria la regolare valutazione dei controlli interni. Interpretazione della colorazione - Mammella Tessuti idonei alla valutazione Devono essere analizzati esclusivamente i campioni di pazienti con carcinoma invasivo. In caso di carcinoma in situ e carcinoma invasivo presenti nello stesso campione, assegnare un punteggio al solo componente invasivo. Evitare le aree di necrosi e quelle in cui i bordi nucleari risultano poco chiari. Non includere i nuclei che richiedono una valutazione soggettiva. Ignorare i nuclei con un segnale di intensità debole e un fondo non specifico o elevato. Conteggio dei segnali Collocare il tumore nel contesto del vetrino colorato con "HE" e valutare la stessa area sul vetrino colorato secondo la tecnica FISH. Considerare numerose aree di cellule tumorali in modo da tenere conto di un'eventuale eterogeneità. Selezionare un'area caratterizzata da una buona distribuzione nucleare. Cominciare l'analisi dal quadrante in alto a sinistra dell'area scelta e, proseguendo da sinistra verso destra, contare il numero di segnali all'interno del bordo nucleare di ciascun nucleo esaminato, secondo le linee guida riportate di seguito (vedere anche l'appendice 2). - Variare la profondità del fuoco per rilevare tutti i segnali nel singolo nucleo. - Conteggiare due segnali di dimensioni uguali e separati da una distanza pari o inferiore al diametro del segnale come un solo segnale - Nei nuclei con elevati livelli di amplificazione del gene HER2, i segnali HER2 possono essere posizionati molto vicini l'uno all'altro, formando un cluster di segnali. In questi casi, il numero di segnali HER2 non può essere contato ma deve essere stimato. Prestare particolare attenzione ai segnali verdi, dal momento che i cluster dei segnali HER2 possono coprire i segnali verdi rendendone impossibile la visualizzazione. In caso di dubbio, controllare i segnali verdi con un filtro FITC specifico. Non inserire nella scala di lettura nuclei privi di segnali o con segnali di un solo colore. Inserire nella scala di lettura solamente i nuclei con uno o più segnali FISH di ciascun colore. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 12/56

13 Guida al conteggio dei segnali Cancro mammario 1 Non conteggiare. I nuclei sono sovrapposti, non tutte le aree dei nuclei sono visibili. 2 Due segnali verdi, non inserire nella scala di lettura nuclei con segnali di un solo colore. 3 Conteggiare come 3 segnali verdi e 12 rossi (stima del cluster). 4 Conteggiare come 1 segnale verde e 1 segnale rosso. Due segnali di dimensioni uguali e separati da una distanza pari o inferiore al diametro di un segnale vengono conteggiati come un solo segnale. 5 Non conteggiare (nucleo iper- o ipodigerito). oppure Segnali assenti al centro del nucleo (nuclei a forma di ciambella). 6 Conteggiare come 2 segnali verdi e 3 segnali rossi. Due segnali di dimensioni uguali e separati da una distanza pari o inferiore al diametro di un segnale vengono conteggiati come un solo segnale. 7 Conteggiare come 1 segnale verde e 5 segnali rossi. 8 Conteggiare come 3 segnali verdi (1 segnale verde è sfuocato) e 3 segnali rossi 9 Cluster di segnali rossi che coprono segnali verdi; controllare i segnali verdi con un filtro FITC specifico oppure non conteggiare. Registrare i conteggi in una tabella, come riportato nell'appendice 1. Contare 20 nuclei per campione tissutale, se possibile, da aree distinte del tumore (18). Calcolare il rapporto HER2/CEN-17 dividendo il numero totale di segnali HER2 rossi per il numero totale di segnali CEN-17 verdi. I campioni con un rapporto HER2/CEN-17 superiore o pari a 2 devono essere considerati positivi per l'amplificazione del gene HER2 (3, 18-20). I risultati prossimi o uguali al valore di cut-off (1,8-2,2) devono essere interpretati con cautela. Se il rapporto è un valore limite (1,8-2,2), eseguire il conteggio di altri 20 nuclei e ricalcolare il rapporto per i 40 nuclei. In caso di dubbio, il vetrino del campione deve essere sottoposto ad una nuova lettura. Per i casi limite, si consiglia un consulto tra il patologo e il medico curante. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 13/56

14 Cancro mammario Limitazioni - Mammella 1. Solo per uso automatizzato su strumenti Dako Omnis. 2. Per la selezione e la fissazione dei tessuti, la preparazione dei vetrini e l'interpretazione della colorazione IQFISH è necessaria una formazione specialistica. L'interpretazione delle colorazioni HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) non deve essere eseguita da persone affette da deficit della visione dei colori. 3. I risultati della tecnica FISH sono strettamente correlati alle modalità di manipolazione e processazione del tessuto precedenti alla colorazione. L'incorretta esecuzione di fissazione, lavaggi, essiccazione, riscaldamento e taglio oppure la contaminazione con altri tessuti o liquidi può influenzare l'ibridazione della sonda. Risultati incoerenti possono essere dovuti anche a variazioni nei metodi di fissazione e di inclusione o da irregolarità intrinseche del tessuto. 4. Le prestazioni del saggio HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) non sono state valutate su campioni di tumore alla mammella con microcalcificazioni. Caratteristiche di prestazione Mammella Efficienza di ibridazione L'efficienza di ibridazione di HER2 IQFISH pharmdx è stata verificata utilizzando 180 sezioni tissutali incluse in paraffina e fissate in formalina, testate presso tre siti di studio. È stato possibile conteggiare tutte e 180 le sezioni tissutali seguendo le linee guida di conteggio del prodotto. L'efficienza di ibridazione è risultata pari al 100%. I rapporti HER2/CEN-17 calcolati e utilizzati negli studi sulle caratteristiche di prestazione sono basati sul conteggio dei segnali in 20 nuclei, utilizzando le linee guida di valutazione fornite nella sezione Interpretazione della colorazione delle presenti Istruzioni per l'uso. Sensibilità analitica La sensibilità analitica di HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è stata esaminata utilizzando 20 campioni tissutali di carcinoma mammario diversi (10 campioni con gene HER2 amplificato e 10 con gene non amplificato). Il rapporto tra il numero di segnali HER2 e CEN-17 è stato calcolato eseguendo il conteggio dei segnali di 20 nuclei di cellule normali nel campione tissutale. Per le cellule normali identificate nei 20 campioni tissutali di carcinoma mammario, è stato ottenuto un rapporto HER2/CEN-17 da 0,97 a 1,11. Specificità analitica Le sonde di DNA perher2 disponibili in HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sono state sequenziate e mappate per confermare una copertura totale di 218 kb comprendente il gene HER2. Le sonde di PNA per CEN-17 disponibili in HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sono state testate, singolarmente e in combinazione, tramite FISH per confermare l'ibridazione specifica alla regione centromerica del cromosoma 17. Per escludere l'ibridazione crociata a cromosomi diversi dal cromosoma 17, sono stati eseguiti studi in metafase secondo le procedure standard di controllo di qualità Dako. Sono state eseguite in totale 275 valutazioni in metafase per la ricerca dell'ibridazione specifica delle miscele di sonde di DNA per HER2 e di PNA per CEN-17. In tutti i 275 casi, l'ibridazione è risultata specifica per il cromosoma 17. In nessuno dei 275 casi è stata osservata una ibridazione crociata a loci su altri cromosomi. La specificità della sonda è risultata pertanto del 100% (275 su 275). ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 14/56

15 Cancro mammario Per misurare la capacità del saggio IQFISH di identificare esclusivamente le sostanze bersaglio HER2 e CEN-17 senza interferenze di altre sostanze, gli studi sui campioni tissutali di carcinoma mammario sono stati eseguiti omettendo le sonde per HER2 e CEN-17 dalla miscela di ibridazione e utilizzando solo il tampone di ibridazione. È stato valutato un totale 20 campioni per verificare la presenza di segnali non correlati alla miscela di sonde. In nessuno dei 20 campioni sono stati rilevati altri cromosomi bersaglio o interferenze con sostanze strettamente correlate. Studi di affidabilità L'affidabilità del saggio HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è stata testata variando la concentrazione della sonda di PNA, il tempo di recupero del bersaglio, il tempo di incubazione della pepsina, la durata della denaturazione, il tempo di ibridazione e il tempo e la temperatura di lavaggio stringente. I vari parametri sono stati testati su cinque campioni tissutali FFPE di carcinoma mammario (erano rappresentati campioni tissutali sia amplificati che non amplificati). Tutti i parametri sono stati testati al di sotto e al di sopra delle impostazioni dei protocolli standard, ad eccezione della concentrazione della sonda di PNA e della temperatura del lavaggio stringente, per cui è stata utilizzata una configurazione che includeva l'impostazione del protocollo standard. Sono stati utilizzanti i seguenti parametri di test: Concentrazione della sonda di PNA: testata al 100% e a +/-17%. Tempo di recupero del bersaglio: testato a 13 min e 45 s e a 16 min e 15 s. Tempo di incubazione della pepsina: testato a 14 min e 45 s e a 16 min e 15 s. Durata della denaturazione: testata a 9 min e 45 s e a 10 min e 45 s. Tempo di ibridazione: testato a 70 min e a 80 min. Tempo di lavaggio stringente: testato a 8 min e 45 s e a 11 min e 15 s. Temperatura di lavaggio stringente: testata a 59 C, 61 C e 63 C. Le tre concentrazioni della sonda di PNA sono state valutate in un esperimento frazionato (strumento JMP, SAS), eseguito con i 12 protocolli di colorazione diversi indicati nella Tabella 2. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 15/56

16 Tabella 2. I 12 protocolli di colorazione diversi utilizzati nello studio di affidabilità. N. protocollo di affidabilità Tempo di recipero del bersaglio (min) Tempo di incubazione della pepsina (min) Durata della denaturazione (min) Parametro di test Tempo di ibridazione (min) Tempo di lavaggio stringente (min) Cancro mammario Temperatura di lavaggio stringente ( 0 C) Conc. di PNA nella miscela di sonde 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % I cinque i campioni tissutali sono stati tutti sottoposti a colorazione utilizzando tutti e 12 i protocolli. Per lo studio di affidabilità sono state misurate l'intensità del segnale e la qualità della morfologia. Tutti i protocolli hanno determinato la colorazione di tutti i campioni tissutali (60 in tutto), con segnali intensi, chiari e facili da valutare, e pertanto adatti al conteggio. Inoltre, l'effetto dello spessore del tessuto sui risultati del saggio HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è stato testato variando lo spessore della sezione di campioni tissutali FFPE di carcinoma mammario. È stato testato un totale di cinque sezioni consecutive di campioni di carcinoma mammario umano con spessori diversi (3, 4, 5, 6 e 7 µm) con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Il coefficiente di variazione medio del rapporto HER2/CEN-17 è stato del 5,8% (con una variazione da 4,3% a 7,1%). Riproducibilità La riproducibilità intergiornaliera e interlotto all'interno del laboratorio è stata testata utilizzando HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Lo studio era uno studio interno, randomizzato e in cieco dei rapporti HER2/CEN-17, eseguito utilizzando sezioni di otto diversi campioni di cancro mammario fissati in formalina e inclusi in paraffina con livelli diversi di amplificazione del gene HER2. Gli otto campioni sono stati testati con HercepTest ed erano costituiti da due campioni con HER2 IHC 0/1+, due campioni con HER2 IHC 2+, due campioni con HER2 IHC 3+ e due campioni con rapporto HER2/CEN- 17 FISH predeterminato, compreso tra 1,5 e 2,5, ottenuto tramite HER2 IQFISH pharmdx (Code K5731). Ciascun campione è stato sottoposto a colorazione con tre diversi lotti di HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) nell'arco di cinque giorni non consecutivi. Per l'intero studio è stato elaborato un totale di 240 colorazioni di tessuto, poiché ogni combinazione è stata sottoposta a colorazione in coppie. Le variazioni dei rapporti tra giorni diversi e lotti diversi è illustrata nella Figura 1. I dati sono stati analizzati utilizzando una trasformata di Box-Cox, tramite un modello di effetto casuale, per ottenere una varianza omogenea dei dati. È stato stimato un coefficiente di variazione totale del 4,3% ed è stato determinato che le variazioni tra giorni e tra lotti hanno contribuito, rispettivamente, per l'1,5% e lo 0%. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 16/56

17 Cancro mammario Figura 1. Rapporti HER2/CEN-17 ottenuti in uno studio di riproducibilità su HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), che includeva la riproducibilità tra giorni e lotti diversi. La riproducibilità di HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tra giorni e lotti diversi è stata inoltre testata esternamente in uno studio stratificato in cieco effettuato in tre sedi (una negli Stati Uniti e due in Europa), su sezioni tissutali di 12 diversi campioni di cancro mammario fissati in formalina e inclusi in paraffina. Tre campioni erano HER2 IHC 0/1+, tre campioni erano HER2 IHC 2+, tre campioni erano HER2 IHC 3+ e gli altre tre campioni avevano un rapporto HER2/CEN-17 FISH predeterminato compreso tra 1,5 e 2,5, ottenuto tramite HercepTest e HER2 IQFISH pharmdx (Code K5731), rispettivamente. I campioni sono stati sottoposti a colorazione e analizzati presso i siti di studio. Ogni campione è stato sottoposto a colorazione per almeno cinque volte in cinque giorni non consecutivi e valutato da un osservatore presso ciascun sito. 192 sezioni sono state sottoposte a colorazione e incluse nell'analisi statistica. I dati sono stati analizzati utilizzando una trasformata Box-Cox e sono stati calcolati i componenti della varianza. Il coefficiente di variazione totale basato sul limite superiore di confidenza al 95% è stato del 15%. La variazione del rapporto HER2/CEN-17 tra giorni e siti diversi è illustrato nella Figura 2. Figura 2. Grafico di variabilità dei rapporti HER2/CEN-17 nelle unità non trasformate, ottenuti tramite studi di riproducibilità tra giorni e siti diversi per HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) su campioni tissutali di carcinoma mammario. La riproducibilità del saggio HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tra osservatori diversi è stata testata nell'ambito di uno studio di confronto tra metodi condotto internamente, utilizzando tre osservatori per testare indipendentemente i campioni ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 17/56

18 Cancro mammario colorati. La riproducibilità è stata testata su 140 campioni diversi di carcinoma mammario umano, con gene HER2 amplificato o non amplificato. I dati sono stati analizzati utilizzando una trasformata Box-Cox. Il coefficiente di variazione medio tra osservatori è risultato pari al 9%. Ripetibilità La ripetibilità di HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) all'interno del laboratorio è stata testata utilizzando sezioni consecutive di otto campioni di carcinoma mammario umano, con gene HER2 amplificato o non amplificato. I tessuti sono stati testati a coppie nell'arco di cinque giorni non consecutivi, con tre lotti diversi in un totale di 240 vetrini (120 coppie di sezioni). Il modello di effetto casuale utilizzato per l'analisi dei dati ha determinato una varianza attribuibile ai giorni e ai lotti (come indicato dallo studio di riproducibilità interno). La varianza residua è uguale alla varianza tra repliche, e questo conferma la ripetibilità. Il limite superiore di confidenza al 95% per il coefficiente di variazione della ripetibilità è stato del 4,4%. Studi di confronto dei metodi Confronto tra i risultati per HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e quelli per HER2 IQFISH pharmdx HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è stato confrontato con HER2 IQFISH pharmdx (Code K5731), in uno studio comparativo su 140 campioni tissutali di carcinoma mammario umano. I campioni erano costituiti da 77 casi con HER2 non amplificato e 63 casi con HER2 amplificato, con il punteggio HercepTest noto indicato nella Tabella 3. Tabella 3. Distribuzione dei campioni in base al punteggio HercepTest e al punteggio FISH HER2 (stato del gene HER2) ottenuto con HER2 IQFISH pharmdx (codice K5731). Punteggio di colorazione di Totale HercepTest n Stato FISH del gene HER2 Amplificato Non amplificato Totale campioni testati con FISH I risultati della tabulazione crociata dello stato del gene HER2 ottenuto tramite i due saggi, con calcolo di percentuale di concordanza totale (OPA, Overall Percent Agreement), percentuale di concordanza positiva (PPA, Positive Percent Agreement) e percentuale di concordanza negativa (NPA, Negative Percent Agreement), sono riportati nella Tabella 4. La correlazione tra i rapporti HER2/CEN-17 ottenuti utilizzando i due saggi è illustrata nella Figura 3. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 18/56

19 Cancro mammario Tabella 4. Tabulazione crociata dello stato del gene HER2 ottenuto tramite HER2 IQFISH pharmdx (Code K5731) e HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Stato del gene HER2 (K5731) Non amplificato Amplificato Totale Stato del gene HER2 Non amplificato (Dako Omnis) Amplificato Totale OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% Figura 3. Correlazione tra i rapporti HER2/CEN-17 ottenuti utilizzando HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e HER2 IQFISH pharmdx (Code K5731) su 140 campioni di cancro mammario (adattamento lineare: y = 0,11 + 0,95*x; R2 = 0,97. Ponderato con varianza inversa per consentire l'adattamento lineare). Ai fini dell'analisi, sono stati utilizzati i rapporti HER2/CEN-17 in forma logaritmica. L'intervallo di confidenza al 95% per la differenza media tra i due metodi di colorazione per il rapporto HER2/CEN-17 = 2 è risultato pari a [0,002-0,031]. Questo significa che non si prevedono differenze superiori al 3% con una confidenza del 95%. È stato calcolato un errore quadratico medio (RMSE, Root Mean Square Error) del 9%, che indica il livello medio di fluttuazione attorno alla media. Confronto tra i risultati per HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e quelli per il kit PathVysion HER-2 DNA Probe HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è stato confrontato con il kit PathVysion HER-2 DNA Probe in uno studio comparativo su 140 campioni tissutali di carcinoma mammario umano. I campioni erano costituiti da 80 casi con HER2 non amplificato e 80 casi con HER2 amplificato, con il punteggio HercepTest noto indicato nella Tabella 5. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 19/56

20 Cancro mammario Tabella 5. Distribuzione dei campioni in base al punteggio HercepTest e al punteggio FISH di HER2 (stato del gene HER2) ottenuto con HER2 IQFISH pharmdx (codice K5731). Punteggio di colorazione HercepTest Totale n Stato FISH del gene HER2 Amplificato Non amplificato Totale campioni testati con FISH I risultati della tabulazione crociata dello stato del gene HER2 ottenuto tramite i due saggi, con calcolo di percentuale di concordanza totale (OPA, Overall Percent Agreement), percentuale di concordanza positiva (PPA, Positive Percent Agreement) e percentuale di concordanza negativa (NPA, Negative Percent Agreement), sono riportati nella Tabella 6. La correlazione tra i rapporti HER2/CEN-17 ottenuti utilizzando i due saggi è illustrata nella Figura 4. Tabella 6. Tabulazione crociata dello stato del gene HER2 ottenuto tramite il kit PathVysion HER-2 DNA Probe e HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Stato del gene HER2 (PathVysion) Non amplificato Amplificato Totale Stato del gene HER2 Non amplificato (Dako Omnis) Amplificato Totale OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% Figura 4. Correlazione tra i rapporti HER2/CEN-17 ottenuti utilizzando HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e PathVysion su 140 campioni di cancro mammario (adattamento lineare: y = 0,01 + 0,98*x; R 2 = 0,96. Ponderato con varianza inversa per consentire l'adattamento lineare). Ai fini dell'analisi, sono stati utilizzati i rapporti HER2/CEN-17 in forma logaritmica. L'intervallo di confidenza al 95% per la differenza media tra i due metodi di colorazione per il rapporto HER2/CEN-17 = 2 è risultato pari a [0,001-0,031]. Questo significa che non si prevedono differenze superiori al 3% con una confidenza del 95%. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 20/56

21 Cancro mammario È stato calcolato un errore quadratico medio (RMSE, Root Mean Square Error) del 10%, che indica il livello medio di fluttuazione attorno alla media. Utilità clinica nella selezione dei pazienti per il trattamento con Herceptin (trastuzumab) Il kit HER2 FISH pharmdx è stato esaminato in studi comparativi eseguiti sia con il kit PathVysion HER-2 DNA Probe, sia con Dako HercepTest. Sono disponibili i risultati del test FISH per il gene HER2 per un totale di 940 campioni di cancro mammario. Confronto tra i risultati dei test per il kit HER2 FISH pharmdx e quelli per il kit PathVysion HER- 2 DNA Probe Sono stati eseguiti tre studi che confrontano i risultati dei test per il kit HER2 FISH pharmdx Kit con quelli del kit PathVysion HER-2 DNA Probe (vedere la Tabella 7). Gli studi sono stati eseguiti in sedi geograficamente separate e non c'è stata sovrapposizione nell'utilizzo dei campioni. Sono stati testati 328 campioni in tutto. Tabella 7. Dati di riepilogo degli studi di confronto dei metodi FISH. Designazione dello studio Studio sulla concordanza (campioni danesi, N=190) 93,68% (90,22% - 97,14%) Studio sulla concordanza (campioni giapponesi, N=52) Studio sulla concordanza (campioni francesi, N=86) (21)* Concordanza (intervallo di confidenza al 95%) 96,15% Concordanza percentuale 86% positiva (intervallo di (77,34% - 95,08%) confidenza al 95%) 97% Concordanza percentuale 97% negativa (intervallo di (94,05% - 99,89%) confidenza al 95%) 96% * I dati del confronto erano disponibili nell'articolo, ma il saggio HER2 FISH non è stato identificato. Fra i test per il kit HER2 FISH pharmdx e quelli per il kit PathVysion HER-2 DNA Probe sui campioni clinici danesi sono stati rilevati 12 risultati discordanti in tutto (vedere la Tabella 8). Tabella 8. Riepilogo dei dati per i 12 risultati discordanti. HER2 FISH (positivo)/pathvysion (negativo) ID Rapporto HER2 FISH 160 2,10* (1,82-2,51) 208 3,61 (2,95-4,73) 306 2,20* (1,79-2,24) 846 2,58 (2,06-3,50) Rapporto PathVysion 1,51 (1,39-1,68) 1,62 (1,51-1,82) 1,33 (1,18-1,44) 1,51 (1,42-1,76) Punteggio HercepTest ID Rapporto HER2 FISH ,68 (1,38-1,83) ,44 (1,07-1,83) ,7 (1,52-1,95) ,44 (1,16-1,83) 735 1,68 (1,40-1,99) 746 1,05 (0,96-1,18) 837 1,52 (1,48-1,79) 881 1,83* (1,15-2,69) HER2 FISH (negativo)/pathvysion (positivo) Rapporto PathVysion 2,02* (1,84-2,29) 2,21* (1,94-2,64) 2,15 (2,02-2,45) 2,55 (2,38-3,26) 2,03* (1,89-2,19) 4,53 (4,27-5,17) 2,15 (2,10-2,67) 2,68 (2,39-3,14) Punteggio HercepTest 2+ * IC dei rapporti logaritmici medi, incluso il valore 2,0. I numeri tra parentesi corrispondono all'ic al 95% ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 21/56

22 Cancro mammario Per questa analisi delle discrepanze sono stati utilizzati i rapporti logaritmici. È stato calcolato l'intervallo di confidenza al 95% per i 60 rapporti logaritmici dei nuclei utilizzati per calcolare il rapporto per il kit PathVysion HER-2 DNA Probe. Nei quattro casi in cui il kit HER2 FISH pharmdx è risultato positivo e il kit PathVysion HER-2 DNA Probe è risultato negativo, nessun intervallo includeva il valore critico 2. Negli otto casi in cui il kit HER2 FISH pharmdx è risultato negativo e il kit PathVysion HER-2 DNA Probe è risultato positivo, l'ic al 95% pari a 3 (234, 284 e 735) includeva il valore critico 2. Analogamente, è stato calcolato l'intervallo di confidenza al 95% per i rapporti logaritmici dei nuclei utilizzati per calcolare il rapporto HER2 FISH pharm Dx Kit. Dei quattro casi in cui il kit HER2 FISH pharmdx è risultato positivo e il kit PathVysion HER-2 DNA Probe è risultato negativo, due (160 e 306) includevano il valore critico 2. Negli otto casi in cui il kit HER2 FISH pharmdx è risultato negativo e il kit PathVysion HER-2 DNA Probe è risultato positivo, l'ic al 95% pari a 1 (881) includeva il valore critico 2. Confronto dei risultati per il kit HER2 FISH pharmdx e i risultati HercepTest Sono stati condotti quattro studi di confronto dei risultati del kit HER2 FISH pharmdx con i risultati HercepTest. Sono stati confrontati 940 campioni in tutto, utilizzando il punteggio di colorazione 3+ come risultato IHC positivo nel saggio HercepTest (vedere la Tabella 9). Tabella 9. Riepilogo degli studi di confronto tra HER2 FISH pharmdx Kit e IHC (HercepTest ). Designazione dello studio Concordanza (intervallo di confidenza al 95%) Concordanza percentuale positiva (intervallo di confidenza al 95%) Concordanza percentuale negativa (intervallo di confidenza al 95%) Campioni clinici danesi (N=682) 93,11% (91,21% - 95,01%) 91% (87,39% - 94,57%) 94% (92,12% - 96,46%) Campioni giapponesi (N=52) Studio francese (N=86) (31) Studio pilota danese (N=120) (22) 96,15% 87,21% 93,33% 96% 87% 84% 96% 87% 97% La distribuzione dei dati dei risultati dei test HercepTest e HER2 FISH per i campioni clinici danesi è riportata nella Tabella 10. Tabella 10. Distribuzione dello stato di HER2 per HercepTest e kit HER2 FISH pharmdx. Punteggio di colorazione Totale HercepTest n % % Stato FISH del gene HER2 Amplificato Non amplificato Totale campioni testati con FISH ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 22/56

23 Cancro mammario Risoluzione dei problemi - Mammella Problema Possibile causa Intervento consigliato 1. Segnali deboli o assenti 1a. I reagenti sono stati esposti a temperature elevate durante il trasporto o la conservazione. 1a. Controllare le condizioni di conservazione. Assicurarsi che il ghiaccio secco fosse presente al momento della spedizione della miscela di sonde IQISH e della pepsina. Verificare che i reagenti siano stati conservati come specificato. 1b. Il microscopio non funziona correttamente - Il filtro impostato non è adatto - La lampada non è adatta - La lampada al mercurio è datata - Le lenti del collettore sono sporche e/o graffiate - L'olio di immersione non è adatto 1b. Controllare lo stato del microscopio e verificare che i filtri impiegati siano idonei all'uso con i fluorocromi della miscela di sonde e che la lampada a mercurio sia corretta e non utilizzata oltre la durata consigliata (vedi Appendice 2). In caso di dubbi, contattare il fornitore del microscopio. 1c. Segnali indeboliti 1c. Evitare lunghe analisi al microscopio e ridurre al minimo l'esposizione a fonti di luce intensa. 2. Aree prive di segnali 3. Colorazione eccessiva del 1d. Identificazione errata dei tamponi 2. Bolle d'aria intrappolate durante il montaggio 3a. Metodo di fissazione dei tessuti inadeguato 1d. Sostituire i tamponi di carico e verificare che la registrazione (nella workstation) e l'identificazione (sul touch screen) dei tamponi di carico siano state eseguite correttamente. Per ulteriori informazioni, consultare il Manuale utente di base di Dako Omnis. Nota: la soluzione ISH Pre- Treatment Solution è verde e la soluzione ISH Stringent Wash Buffer è gialla. 2. Evitare l'intrappolamento di bolle d'aria. Eliminare eventuali bolle d'aria presenti picchiettando delicatamente con le pinzette. 3a. Assicurarsi che vengano utilizzate esclusivamente ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 23/56

24 Cancro mammario Problema Possibile causa Intervento consigliato fondo sezioni tissutali fissate in formalina, incluse in paraffina. 4. Morfologia del tessuto alterata 5. Livelli elevati di autofluorescenza sul vetrino, incluse aree prive di tessuto FFPE 3b. Esposizione prolungata della sezione ibridata a luce intensa 4a. Incorretto trattamento con pepsina 4b. Un trattamento con Pepsin di durata eccessiva, o uno spessore delle sezioni troppo ridotto, può causare la comparsa di cellule fantasma o di cellule "donut" (a ciambella). 5. Utilizzo di vetrini scaduti o non inclusi tra quelli consigliati 3b. Evitare lunghe analisi al microscopio e ridurre al minimo l'esposizione a fonti di luce intensa. 4a. Passare a uno degli altri protocolli di colorazione disponibili. Verificare che il prodotto Pepsin (Dako Omnis) venga conservato alla temperatura corretta. 4b. Provare a utilizzare un protocollo di colorazione con tempo di incubazione della pepsina inferiore. Assicurarsi che lo spessore delle sezioni sia di 4-6 µm. 5. Utilizzare solo i vetrini specificati. Verificare che la data di scadenza dei vetrini non sia già trascorsa. NOTA: se il problema non è imputabile a nessuna delle cause sopracitate o se l'intervento correttivo consigliato non si rivela efficace, contattare l'assistenza tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 24/56

25 Cancro mammario Appendice 1 - Mammella HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), codice GM333 Schema di lettura Data di esecuzione: ID scheda del ciclo di colorazione: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Lotto: ID campione: Nucleo n. Punteggio HER2 (rosso) Contare i segnali in 20 nuclei Punteggio CEN-17 (verde) Nucleo n Totale (1-10) Totale (11-20) Punteggi o HER2 (rosso) Punteggi o CEN-17 (verde) Per la determinazione del rapporto HER2/CEN-17, contare il numero di segnali HER2 e il numero di segnali CEN-17 negli stessi 20 nuclei e dividere il numero totale dei segnali HER2 per il numero totale dei segnali CEN-17. Se il rapporto HER2/CEN-17 è un valore limite (1,8-2,2), eseguire il conteggio di altri 20 nuclei e ricalcolare il rapporto per i 40 nuclei. Valori del rapporto prossimi o pari al valore di cut-off (1,8-2,2) devono essere interpretati con cautela (vedere la guida al conteggio). Punteggio totale (1-20) HER2 CEN-17 Rapporto HER2/CEN-17 ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 25/56

26 Cancro mammario Contare i segnali nei 20 nuclei aggiuntivi Nucleo n. Punteggio HER2 (rosso) Punteggio CEN-17 (verde) Nucleo n Totale (21-30) Totale (31-40) Punteggi o HER2 (rosso) Punteggi o CEN-17 (verde) Calcolare il rapporto HER2/CEN-17 in base ai 40 nuclei conteggiati Punteggio totale (1-40) HER2 CEN-17 Rapporto HER2/CEN-17 Rapporto < 2: amplificazione del gene HER2 non riscontrata Rapporto 2: amplificazione del gene HER2 riscontrata Data e firma, nome del tecnico: Data e firma, nome del patologo: Per le linee guida relative all'attribuzione del punteggio vedere la sezione "Interpretazione della colorazione". ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 26/56

27 Cancro mammario Appendice 2 - Mammella HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), codice GM333 Specifiche per il microscopio a fluorescenza In combinazione con HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333, Dako consiglia di utilizzare l'apparecchiatura seguente: 1. Tipo di microscopio Microscopio ad epifluorescenza 2. Lampada Lampada al mercurio da 100 watt (prendere nota dei tempi d'impiego) 3. Obiettivi Per l'esame del tessuto, è possibile utilizzare obiettivi a immersione in olio 16x o 20x Per un ingrandimento elevato e per il conteggio dei segnali, utilizzare solo obiettivi a immersione in olio, in particolare 100x. 4. Filtri I filtri sono progettati in modo specifico per singoli fluorocromi e devono essere scelti di conseguenza. Dako consiglia l'uso di un filtro DAPI specifico in combinazione con un doppio filtro Texas Red/FITC di alta qualità. Filtro DAPI, ad esempio filtro Chroma n Filtro doppio Texas Red/FITC, ad esempio filtro Omega Optical n. XF53 o filtro Chroma n È possibile utilizzare filtri singoli Texas Red e FITC per la conferma e il conteggio Fluorocromo Lunghezza d'onda di eccitazione Lunghezza d'onda di emissione FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm I filtri sono specifici per ogni tipo di microscopio, pertanto, l'uso dei filtri adatti è fondamentale per una corretta interpretazione. Per ulteriori informazioni, contattare il fornitore del microscopio oppure il rappresentante Dako di zona. 5. Olio Olio non fluorescente Precauzioni Si sconsiglia l'uso di una lampada al mercurio da 50 watt Non è possibile utilizzare filtri per rodamina Si sconsiglia l'uso di filtri tripli L'uso di un microscopio non ottimizzato potrebbe causare problemi durante la lettura dei segnali fluorescenti. È importante che la sorgente di luce non venga utilizzata oltre la data di scadenza e che sia allineata in modo corretto e a fuoco. È compito del cliente controllare e seguire le raccomandazioni del produttore per la lampada al mercurio. Il microscopio deve essere sottoposto a manutenzione e la lampada al mercurio deve essere allineata correttamente prima dell'interpretazione dei risultati. È necessario assicurarsi che il campione sia esposto alla luce di eccitazione per il minor tempo possibile, in modo da ridurre al minimo la perdita di intensità della fluorescenza. Per l'impostazione del microscopio in uso, si consiglia di consultare il produttore prima di iniziare la procedura di ibridazione in situ in fluorescenza oppure fare riferimento alla letteratura. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 27/56

28 Cancro gastrico Cenni introduttivi - Ambito gastrico Il gene umano HER2 (noto anche come ERBB2 o NEU) è localizzato sul cromosoma 17 e codifica la proteina HER2 o p185 HER2. La proteina HER2 è un recettore di membrana ad attività tirosin-chinasica omologo del recettore del fattore di crescita dell'epidermide (EGFR o HER1) (1-2). Il gene HER2 è presente in due copie in tutte le cellule diploidi normali. L'iperespressione della proteina HER2 e l'amplificazione del gene HER2 nel cancro gastrico sono stati dimostrati in molti studi, presentati nella review (23). La positività per HER2 può essere rilevata in circa il 20% dei pazienti tramite IHC o FISH (23). Studi preclinici in vitro e in vivo hanno dimostrato che il trastuzumab (Herceptin ) è efficace in diversi modelli di cancro gastrico, portando così all'avvio di diversi studi clinici (23-27). Tutti i pazienti dello studio di fase III BO18255 (ToGA "An open-label, randomized, multicenter, phase III study of traustuzumab in combination with a fluoropyrimidine and cisplatin versus chemotherapy alone as first-line therapy in patients with HER2 positive advanced gastric cancer") sponsorizzato da Hoffmann-La Roche sono stati selezionati utilizzando Dako HercepTest (IHC) e Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) con positività per HER2 definita come IHC 3+ o FISH+ (HER2/CEN-17 2,0). Lo studio ha dimostrato l'utilità clinica di HercepTest (IHC) e HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) per la valutazione dello stato di HER2 nei pazienti con adenocarcinoma avanzato dello stomaco o della giunzione gastro-esofagea che possono trarre beneficio dalla terapia con trastuzumab(28). Non è stato incluso alcun paziente affetto da tumore che non presentasse amplificazione del gene e che tuttavia mostrasse un'iperespressione della proteina HER2 da moderata a elevata [FISH(-)/IHC 2+]. Non è pertanto chiaro se i pazienti affetti da un tumore che non presenta amplificazione del gene, ma mostra un'iperespressione della proteina HER2 [ovvero FISH(-), IHC 2+ o 3+], possano trarre beneficio dalla terapia con Herceptin. Nello studio è stato inoltre dimostrato che l'amplificazione del gene (FISH) e l'iperespressione della proteina (IHC) non sono strettamente correlate come per il cancro mammario, pertanto per la determinazione dello stato di HER2, non è possibile utilizzare uno solo dei due metodi. Questo prodotto (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è costituito da una miscela di sonde IQISH per FISH diretta automatizzata in grado di rilevare l'amplificazione del gene HER2. Questo prodotto deve essere utilizzato sullo strumento Dako Omnis in combinazione con i dispositivi reagenti specificati ed è ottenuto tramite il saggio di amplificazione del gene HER2, HER2 IQFISH pharmdx, codice K5731, eseguito manualmente. Principio della procedura - Gastrico HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è una sonda IQISH costituita da una miscela di sonde di DNA marcate con Texas Red, che coprono una regione di 218 kb comprendente il gene HER2sul cromosoma 17, e da una miscela di sonde di acido peptidonucleico (PNA) (13) fluoresceinate dirette contro la regione centromerica del cromosoma 17 (CEN-17). L'ibridazione specifica dei due bersagli comporta la generazione di un evidente segnale fluorescente rosso in corrispondenza di ciascun locus del gene HER2 e un evidente segnale fluorescente verde in corrispondenza del centromero di ciascun cromosoma 17. La valutazione dell'amplificazione del gene HER2 tramite HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è un metodo interamente automatizzato sullo strumento Dako Omnis. Il software della workstation Dako Link Omnis consente di selezionare tre diversi protocolli convalidati per la colorazione HER2 FISH. I protocolli differiscono solo per i tempi di digestione con pepsina, pertanto è possibile scegliere tra 10 minuti (protocollo breve), 15 minuti (protocollo medio) e 20 minuti (protocollo lungo). Ulteriori dettagli verranno forniti di seguito. Per l'analisi iniziale è consigliabile utilizzare il protocollo medio. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 28/56

29 Cancro gastrico Completata la procedura di colorazione sullo strumento Dako Omnis, i campioni vengono montati con Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e coperti con un vetrino coprioggetto. L'uso di un microscopio a fluorescenza dotato di filtri appropriati (vedere l'appendice 5) consente di localizzare le cellule tumorali e di eseguire il conteggio dei segnali rossi (HER2) e verdi (CEN-17). Successivamente, viene calcolato il rapporto HER2/CEN-17. Le cellule normali nella sezione tissutale analizzata vengono utilizzate come controllo positivo interno dell'efficacia del pretrattamento e dell'efficienza di ibridazione. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla sezione "Interpretazione della colorazione". Consultare il Manuale utente di Dako Omnis per istruzioni dettagliate sul caricamento e lo scaricamento di vetrini, ISH Lid (Dako Omnis), codice GC102, reagenti, liquidi di carico e liquidi di scarico. Reagenti - Gastrico HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e i reagenti accessori possono essere ordinati separatamente come singoli reagenti. Materiali forniti HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 m, pronto all'uso, miscela di sonde di DNA HER2 marcate con Texas Red e sonde di PNA CEN-17 fluoresceinate, fornite in tampone di ibridazione IQISH. Il prodotto HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) viene spedito in ghiaccio secco. Per verificare che il reagente non sia stato esposto a temperature elevate durante il trasporto, accertarsi che vi sia ancora ghiaccio secco al momento della consegna. I flaconi di reagente con contenuto scongelato devono essere sempre mantenuti e conservati in posizione verticale. Il flacone di reagente contiene una sfera di metallo rivestita in oro che consente la miscelazione del reagente tramite il Dispositivo di miscelazione Dako Omnis (vedere il Manuale utente del Dispositivo di miscelazione Dako Omnis). È importante miscelare accuratamente il reagente prima del caricamento su Dako Omnis. Materiale necessario ma non fornito Reagenti accessori Per l'esecuzione dell'analisi dell'amplificazione del gene HER2con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), è necessario che sullo strumento Dako Omnis siano caricati i reagenti seguenti: ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, nella concentrazione 20x, da diluire 1:20 in una bottiglia di carico Dako Omnis da 3,5 l (codice GC109). Il prodotto contiene un agente antimicrobico e un colorante verde inerte per una maggiore semplicità di identificazione e di utilizzo. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml di etanolo al 96% (pronto all'uso). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml, soluzione di pepsina A (pronta all'uso), ph 2,0. Contiene uno stabilizzante e un agente antimicrobico. La pepsina viene spedita in ghiaccio secco. Per verificare che il reagente non sia stato esposto a temperature elevate durante il trasporto, accertarsi che vi sia ancora ghiaccio secco al momento della consegna. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml, tampone salino di sodio citrato con concentrazione 20x, da diluire 1:20 in una bottiglia di carico Dako Omnis da 3,5 l (CG109). Il prodotto contiene un agente microbico, un detergente e un colorante giallo inerte per una maggiore semplicità di identificazione e di utilizzo. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml di mezzo di montaggio per fluorescenza con DAPI (pronto all'uso). ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 29/56

30 Cancro gastrico Anche se non vengono forniti con HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), i reagenti di cui sopra sono descritti di seguito. Per ulteriori informazioni, consultare le istruzioni per l'uso dei singoli dispositivi. Reagenti e dispositivi aggiuntivi Dako Omnis, codice Gl100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), codice GC807 Clearify TM, codice GC810 Dispositivo di miscelazione Dako Omnis, codice GC116 ISH Lid, codice GC102 ISH Cleaning Solution, codice GC207 Vetrino coprioggetto di vetro per il montaggio (24 mm x 50 mm) Per l'uso di reagenti e dispositivi aggiuntivi, consultare i manuali utente di base e avanzato di Dako Omnis. Apparecchiatura e accessori per microscopia Filtri per microscopio a fluorescenza: DAPI e doppio filtro FITC/Texas Red oppure filtri singoli FITC e Texas Red. Per ulteriori informazioni, vedere l'appendice 2. L'uso del filtro DAPI con un ingrandimento elevato influisce negativamente sull'intensità del segnale. È consigliabile evitare tempi di esposizione prolungati. Utilizzare un microscopio a fluorescenza con lampada al mercurio da 100 watt come sorgente di luce. Si sconsiglia l'utilizzo di sorgenti di luce diverse con questi filtri. Raccoglitore per vetrini per microscopia (contenitore di cartone per 20 vetrini, con chiusura a cerniera o simile). Precauzioni - Gastrico 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Per uso professionale. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) contiene 10-<25% di carbonato di etilene e 3-<5% sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è marcato come segue: H319 P280 Attenzione P264 P305 + P351 + P338 Provoca grave irritazione oculare. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. Lavarsi accuratamente le mani dopo l uso. IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Di regola, non è consentito ai minori di 18 anni di lavorare con questo prodotto. Gli utenti devono essere accuratamente informati relativamente alla procedura di lavoro adeguata, alle proprietà pericolose del prodotto e alle istruzioni di sicurezza necessarie. Fare riferimento alla scheda di sicurezza per ulteriori informazioni. 4. I campioni di tessuto, prima e dopo la fissazione, e tutti i materiali esposti ad essi devono essere manipolati come potenziali vettori di infezione e smaltiti con le opportune precauzioni ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 30/56

31 Cancro gastrico (14). Non pipettare mai i reagenti con la bocca ed evitare che reagenti e campioni entrino in contatto con la cute e le membrane mucose. In caso di contatto dei reagenti con zone sensibili, lavare la zona con abbondante acqua. 5. Ridurre al minimo la contaminazione microbica del reagente per evitare risultati incorretti. 6. L'impiego di metodi di fissazione e spessori dei campioni diversi da quelli specificati potrebbe esercitare effetti negativi sulla morfologia del tessuto e/o sull'intensità del segnale. 7. Il reagente è stato diluito nel modo ottimale. L'ulteriore diluizione potrebbe comprometterne le prestazioni. 8. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la cute. Fare riferimento alla scheda di sicurezza del materiale (SDS) per ulteriori informazioni. 9. La soluzione non utilizzata deve essere smaltita in conformità alle normative locali e nazionali vigenti in materia. 10. A causa della natura eterogenea dei campioni di cancro gastrico, prima di selezionare l'area per il conteggio dei segnali, è importante scorrere accuratamente tutto il campione per valutare la distribuzione del segnale. 11. Si sconsiglia di valutare campioni molto piccoli (i campioni devono avere una morfologia conservata e una quantità di nuclei sufficiente per il conteggio). 12. Se si esegue l'analisi HER2 FISH su un campione bioptico, è necessario analizzare più (7-8) biopsie adatte alla valutazione provenienti da differenti regioni del tumore, al fine di garantire una determinazione dello stato di HER2 affidabile. 13. Per l'identificazione di tutti i prelievi tissutali di un campione bioptico, è importante ispezionare il vetrino colorato con HE. 14. Nel cancro gastrico, l'amplificazione del gene HER2 e l'iperespressione della proteina HER2 non sono strettamente correlate come per il cancro mammario, pertanto lo stato di HER2 non può essere determinato utilizzando un singolo metodo. Conservazione - Gastrico Conservare HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) al buio, a un massimo di 18 C (temperatura consigliata: da -18 C a -25 C). I fl aconi di reagente scongelato devono essere sempre tenuti in posizione verticale. Il congelamento e lo scongelamento del reagente per un massimo di 10 volte non influisce sulle prestazioni. Non lasciare questo componente a temperatura ambiente. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e i reagenti accessori, ISH Pepsin (Dako Omnis) e Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), possono subire alterazioni se esposti al calore. Non lasciare questi componenti a temperatura ambiente. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e i reagenti accessori, Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), possono subire alterazioni se esposti a livelli di luce eccessivi. Non conservare questi componenti né eseguire l'analisi in condizioni di luce intensa, come ad esempio la luce solare diretta. Conservare i reagenti accessori ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) e Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) al buio, a una temperatura di 2-8 C. Conservare ISH Pepsin (Dako Omnis) a una temperatura di C. Durante la conservazione il tappo del reagente, incluso il tappo superiore a scatto, deve rimanere chiuso per tutti i reagenti. Le soluzioni diluite (soluzione di lavoro ISH Stringent Wash Buffer e soluzione di lavoro ISH Pre- Treatment Solution) possono essere conservate a 2-8 C per 30 giorni. Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza stampata sul relativo contenitore. Durante la conservazione il tappo, incluso il tappo superiore a scatto, deve rimanere chiuso. Se i reagenti sono conservati in condizioni diverse da quelle specificate, è necessario verificarne le prestazioni (15). ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 31/56

32 Cancro gastrico Non sono stati osservati segni evidenti che suggeriscano l'instabilità di questo prodotto. Pertanto, è importante esaminare cellule normali nella sezione tissutale analizzata. Qualora si ottenga un pattern di fluorescenza inatteso e si sospetti un problema associato a HER2 IQFISH pharmdx contattare l'assistenza tecnica Dako. Stabilità sullo strumento Dako Omnis La stabilità di HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e quella dei reagenti accessori ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) e ISH Pepsin (Dako Omnis) sullo strumento è di 80 ore. La stabilità sullo strumento di ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) e ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) diluiti è di 7 giorni. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente. In caso di utilizzo di reagenti scaduti lo strumento Dako Omnis genera un avviso, tutti i vetrini colorati con il reagente scaduto vengono impostati sullo stato "sospetto" e nel registro vetrini sulla workstation viene indicato che è stato utilizzato un reagente scaduto. Preparazione dei campioni - Gastrico I campioni di adenocarcinoma dello stomaco o della giunzione gastro-esofagea ottenuti tramite biopsie, escissioni o resezioni devono essere manipolati in modo tale da preservare il tessuto per l'analisi FISH. Utilizzare per tutti i campioni i metodi standard di processazione dei tessuti per la colorazione immunoistochimica (16). Durante l'analisi di piccoli campioni bioptici, verificare che la morfologia del tumore sia integra e che siano presenti nuclei sufficienti per il conteggio. Se si esegue l'analisi HER2 FISH su un campione bioptico, è necessario analizzare più (7-8) biopsie adatte alla valutazione provenienti da differenti regioni del tumore, al fine di garantire una determinazione dello stato di HER2 affidabile. Sezioni incluse in paraffina Sono idonei all'uso soltanto i tessuti conservati in formalina tamponata neutra e inclusi in paraffina. Ad esempio, i campioni devono essere bloccati in uno spessore di 3 o 4 mm e fissati per ore in formalina tamponata neutra. Nello studio clinico ToGA, i campioni bioptici sono stati fissati per 6-8 ore (per consultare lo studio, fare riferimento a (28)). Successivamente, i tessuti devono essere disidratati applicando una serie ascendente di alcol e xilene, quindi infiltrati con paraffina fusa mantenuta a una temperatura massima di 60 C. Tessuti fissati e inclusi in modo corretto durano per un periodo di tempo indefinito prima del taglio e del montaggio dei vetrini se conservati in un luogo fresco (15-25 C) (16-17). Fissativi diversi non sono idonei. I campioni tissutali devono essere tagliati in sezioni di 3-6 µm. I vetrini necessari per l'analisi dell'amplificazione del gene HER2 e per la verifica della presenza del tumore devono essere preparati contemporaneamente. Si consiglia di preparare almeno due sezioni seriali, una sezione, colorata con ematossilina ed eosina (colorazione H&E), per la verifica della presenza del tumore e una sezione per l'analisi dell'amplificazione del gene HER2. Si consiglia di montare le sezioni tissutali sui vetrini Dako FLEX IHC Microscope Slides, codice K8020. In alternativa, è possibile utilizzare i vetrini (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ). Verificare che la data di scadenza dei vetrini non sia già trascorsa. I campioni devono essere analizzati entro 6 mesi dal taglio, se conservati a 2-25 C. NOTA: campioni tissutali devono essere posizionati sul vetro, entro l'area di colorazione definita del vetrino. Per le dimensioni dell'area di colorazione del vetrino, consultare il Manuale utente di base di Dako Omnis. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 32/56

33 ISTRUZIONI PER L'USO - Gastrico Cancro gastrico A. Preparazione dei reagenti - Gastrico A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Il flacone per HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) contiene una sfera di metallo rivestita in oro utilizzata per la miscelazione. Prima del caricamento del flacone su Dako Omnis, il reagente deve essere scongelato e accuratamente miscelato, poiché si separa in fasi durante il congelamento. Per la miscelazione della sonda usare il Dispositivo di miscelazione Dako Omnis. Per ulteriori informazioni sulla miscelazione della sonda con il Dispositivo di miscelazione Dako Omnis, consultare il relativo Manuale utente. 1. Estrarre il flacone di HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) dal congelatore. 2. Caricare il flacone nel Dispositivo di miscelazione Dako Omnis. 3. Collegare il Dispositivo di miscelazione e verificare che la spia di stato verde sia accesa. 4. Selezionare il programma "Scongelamento + miscelazione". Importante: i flaconi conservati a temperature inferiori a 25 C devono essere scongelati appena prima del ca ricamento nel Dispositivo di miscelazione Dako Omnis e sottoposti al programma "Miscelazione". 5. Rimuovere il flacone dal dispositivo di miscelazione. 6. Aprire il tappo superiore a scatto, ripiegarlo all'indietro e bloccarlo nell'intaglio (per ulteriori informazioni, consultare il Manuale utente di base di Dako Omnis). 7. Caricare immediatamente il flacone nel Reagent Storage Module (modulo di conservazione reagenti) sullo strumento Dako Omnis. Se durante il ciclo di colorazione si utilizza la funzione di caricamento continuo del reagente, assicurarsi che fra la miscelazione e l'aspirazione del flacone su Dako Omnis trascorrano almeno 10 minuti. La sonda HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) può essere scongelata e utilizzata ripetutamente per un massimo di 10 volte. Miscelare sempre la sonda HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) appena prima di caricarla sullo strumento. Non scuotere. La stabilità totale di ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sullo strumento è di 80 ore quando il reagente viene conservato nel Reagent Storage Module (modulo di conservazione reagenti) su Dako Omnis. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente (vedere sopra). Dopo il tempo nello strumento Dako Omnis, è necessario riportare immediatamente HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) a un massimo di 18 C (temperatura consigliata: da -18 C a -25 C). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Preparare una soluzione di lavoro diluendo la soluzione concentrata ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20 come segue: 1. Riempire una bottiglia di carico Dako Omnis da 3,5 l, contrassegnata come tampone PT (etichetta blu), con acqua deionizzata fino alla linea di riempimento (3,325 l). Verificare che la bottiglia di carico sia posizionata su una superficie orizzontale prima del riempimento. 2. Versare nella bottiglia di carico l'intero contenuto di una bottiglia di soluzione concentrata da 175 ml di ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis). 3. Trasferire l'etichetta staccabile dalla bottiglia della soluzione concentrata alla bottiglia di carico. Chiudere il coperchio della bottiglia di carico e capovolgerla delicatamente per 2-3 volte. 4. Utilizzare lo scanner di codici a barre manuale Dako Omnis per identificare il reagente (eseguire la scansione dell'etichetta staccabile e della bottiglia di carico). 5. Caricare immediatamente la bottiglia di carico sullo strumento Dako Omnis. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 33/56

34 Cancro gastrico La soluzione diluita conservata sullo strumento Dako Omnis può essere utilizzata entro 7 giorni. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente (vedere sopra). La soluzione diluita inutilizzata può essere conservata a 2-8 C per 30 giorni. Dopo la conservazione al freddo, assicurarsi che la soluzione diluita sia in equilibrio ad almeno 18 C prima del caricamento su Dako Omnis. NOTA: eliminare la soluzione diluita se appare torbida. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Preparare una soluzione di lavoro diluendo il tampone concentrato ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20 come segue: 1. Riempire una bottiglia di carico Dako Omnis da 3,5 l, contrassegnata come tampone PT (etichetta blu), con acqua deionizzata fino alla linea di riempimento (3,325 l). Verificare che la bottiglia di carico sia posizionata su una superficie orizzontale prima del riempimento. 2. Versare l'intero contenuto di una bottiglia di soluzione concentrata da 175 ml di ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) nella bottiglia di carico. 3. Trasferire l'etichetta staccabile dalla bottiglia della soluzione concentrata alla bottiglia di carico. Chiudere il coperchio della bottiglia di carico e capovolgerla delicatamente per 2-3 volte. 4. Utilizzare lo scanner di codici a barre manuale Dako Omnis per identificare il reagente (eseguire la scansione dell'etichetta staccabile e della bottiglia di carico). 5. Caricare immediatamente la bottiglia di carico sullo strumento Dako Omnis. La soluzione diluita conservata sullo strumento Dako Omnis può essere utilizzata entro 7 giorni. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente (vedere sopra). La soluzione diluita inutilizzata può essere conservata a 2-8 C per un massimo di 30 giorni. Dopo la conserv azione al freddo, assicurarsi che la soluzione diluita sia in equilibrio ad almeno 18 C prima del caricamento su Dako Omnis. NOTA: eliminare la soluzione diluita se appare torbida. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) è un reagente pronto all'uso. Prima del caricamento su Dako Omnis, aprire il tappo superiore a scatto, ripiegarlo all'indietro e bloccarlo nell'intaglio. La stabilità totale di ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) sullo strumento è di 80 ore, quando il reagente viene conservato nel Reagent Storage Module (modulo di conservazione reagenti) su Dako Omnis. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente (vedere sopra). Al termine del ciclo è possibile riportare ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) alla temperatura di conservazione (2-8 C) per risparmiare tempo di stabilità sullo strumento. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) è un reagente pronto all'uso. Prima del caricamento su Dako Omnis verificare che il reagente sia stato scongelato, quindi aprire il tappo superiore a scatto, ripiegarlo all'indietro e bloccarlo nell'intaglio. La stabilità totale di ISH Pepsin (Dako Omnis) sullo strumento è di 80 ore quando il reagente viene conservato nel Reagent Storage Module (modulo di conservazione reagenti) su Dako Omnis. Il software Dako Omnis tiene traccia del tempo di stabilità sullo strumento rimanente (vedere sopra). Al termine del ciclo è possibile riportare ISH Pepsin (Dako Omnis) alla temperatura di conservazione (-18-8 C) per risparm iare tempo di stabilità sullo strumento. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) è un mezzo di montaggio pronto all'uso utilizzato al di fuori dello strumento Dako Omnis. Riportare Fluorescence Mounting Medium alla temperatura di conservazione (2-8 C) immediatament e dopo l'uso. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 34/56

35 Cancro gastrico A.7 Accessori aggiuntivi Sullo strumento Dako Omnis possono essere caricati anche i seguenti accessori: acqua deionizzata, Wash Buffer 20x (Dako Omnis, codice GC807) diluito, Clearify (Dako Omnis, codice GC810), ISH Cleaning Solution (Dako Omnis, codice GC207) e ISH Lid (Dako Omnis, codice GC102) come specificato nei Manuali utente di Dako Omnis. B. Procedura di colorazione - Gastrico B.1 Note sulla procedura HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è la sonda di ibridazione per saggi di ibridazione in situ in fluorescenza diretta (FISH) automatizzati eseguiti sullo strumento Dako Omnis e, insieme ai reagenti accessori GM300, GM301, GM302, GM303 e GM304 (GM304 fuori dallo strumento), è destinata all'uso nella determinazione quantitativa dell'amplificazione del gene HER2. Prima dell'uso, l'utente deve leggere attentamente tutte le istruzioni e acquisire dimestichezza con tutti i componenti e le relative precauzioni. La procedura automatizzata su Dako Omnis include le operazioni di deparaffinazione delle sezioni tissutali, recupero del bersaglio, digestione con pepsina, ibridazione e lavaggio stringente. I vetrini vengono scaricati nella Unloading Station (stazione di scaricamento) a secco. Tutte le fasi del protocollo sono preimpostate nel software Dako Omnis. Consultare il Manuale utente di Dako Omnis per istruzioni dettagliate sul caricamento di vetrini, ISH Lid reagenti e così via. Nel software Dako Omnis sono preimpostati tre protocolli HER2 IQFISH convalidati: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium e HER2 IQFISH Pepsin Long, che differiscono solo per i tempi di digestione con pepsina e possono essere selezionati per ciascuno dei cinque vetrini nel rack dei vetrini. Ciò consente l'ottimizzazione della digestione tissutale che può variare in base alle condizioni preanalitiche. Il protocollo HER2 IQFISH Pepsin Medium è considerato il protocollo standard. I tre diversi protocolli di colorazione possono essere visualizzati sulla workstation Dako Link Omnis. B.2. Prima della procedura di colorazione 1. Tramite il software della workstation Dako Link Omnis, scegliere il protocollo HER2 IQFISH da applicare a ciascun vetrino. 2. Stampare le etichette dei vetrini e applicarle ai vetrini. 3. Collocare i vetrini nel rack dei vetrini. Per ulteriori informazioni, consultare il Manuale utente di base di Dako Omnis. Un rack dei vetrini può contenere da uno a cinque vetrini. Si consiglia di sottoporre a un ciclo di colorazione HER2 IQFISH almeno due vetrini. 4. Caricare il rack dei vetrini sullo strumento Dako Omnis. 5. Caricare il coperchio ISH Lid (uno per rack di vetrini) sullo strumento Dako Omnis. 6. Verificare che le bottiglie di carico con i liquidi siano sullo strumento e siano state registrate dallo strumento Dako Omnis. Bottiglie di carico con i liquidi: Clearify (agente chiarificante), ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) diluito, ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) diluito e Wash Buffer (Dako Omnis) diluito. 7. Caricare ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) e ISH Pepsin (Dako Omnis), oltre alla sonda HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) miscelata immediatamente prima e ISH Cleaning Solution, in Reagent Storage Module (modulo di conservazione reagenti). Verificare che tutti i tappi superiori a scatto siano aperti. 8. Seguire le istruzioni sul touch screen e toccare "Done" (Fine) per avviare la procedura di colorazione. B.3. Procedura di colorazione La procedura di colorazione HER2 IQFISH sullo strumento Dako Omnis (riepilogata nella Tabella 11) può essere monitorata sulla workstation Dako Link Omnis: ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 35/56

36 Cancro gastrico Tabella 11. Panoramica semplificata delle procedure dei protocolli di colorazione HER2 IQFISH. Passaggio Reagente Tempo e temperatura Sparaffinatura Clearify (agente chiarificante) 10 minuti, 38 C Recupero del ISH Pre-Treatment Solution 15 minuti, 97 C bersaglio (Dako Omnis) Lavaggio ISH Ethanol Solution, 96% 2 x 3 minuti, 32 C (Dako Omnis) Digestione* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 minuti, 15 minuti o 20 minuti Essiccazione 15 minuti, 45 C Denaturazione 10 minuti, 66 C Ibridazione HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 75 minuti, 45 C Lavaggio ISH Stringent Wash Buffer stringente (Dako Omnis) 10 minuti, 61 C * Utilizzando i protocolli HER2 IQFISH indicati sopra, è possibile scegliere fra tre tempi di digestione con pepsina convalidati. Se non è necessario eseguire a breve ulteriori colorazioni ISH, riportare tutti i reagenti alle temperature di conservazione consigliate. B.4. Dopo la procedura di colorazione Scaricare i vetrini e applicare fino a 30 µl di Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) contenente DAPI sull'area bersaglio del vetrino. La sezione di tessuto deve essere completamente ricoperta da Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Applicare un vetrino coprioggetto di vetro. NOTA: è possibile eseguire una lettura dei vetrini dopo 15 minuti o entro 7 giorni dal montaggio. Tuttavia, i preparati potrebbero sbiadire se i vetrini sono esposti a luce o temperature eccessive. Per ridurre al minimo tale rischio, conservare i vetrini al buio a C. Controllo di qualità - Gastrico 1. I segnali devono essere intensi, netti e di facile valutazione. 2. Le cellule normali consentono un controllo interno del ciclo di colorazione. Le cellule normali devono presentare 1-2 segnali verdi chiaramente visibili, che indicano la riuscita ibridazione della sonda di PNA CEN-17 con la regione centromerica del cromosoma 17. Le cellule normali devono presentare anche 1-2 segnali rossi chiaramente visibili che indicano la riuscita ibridazione della sonda di DNA HER2 con i geni HER2. A causa del taglio dei tessuti, alcune cellule normali presenteranno un numero di segnali inferiore ai due previsti per ciascun colore. La mancata rilevazione dei segnali nelle cellule normali indica la non riuscita del saggio: i risultati devono essere considerati non validi. 3. La morfologia nucleare deve risultare conservata all'esame con un filtro DAPI. La presenza di numerose cellule fantasma e una morfologia nucleare generale alterata indicano una digestione eccessiva del campione, con conseguente perdita o frammentazione dei segnali. I campioni di questo tipo devono essere considerati non validi. 4. Devono essere presenti almeno 20 cellule tumorali idonee alla valutazione. 5. Le differenze tra i laboratori nell'esecuzione delle procedure di fissazione, processazione e inclusione del tessuto possono determinare una variabilità nei risultati, per cui si rende necessaria la regolare valutazione dei controlli interni. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 36/56

37 Interpretazione della colorazione - Gastrico Cancro gastrico Tessuti idonei alla valutazione Collocare il tumore nel contesto del vetrino colorato con "HE" e valutare la stessa area sul vetrino colorato con la tecnica FISH (nel filtro DAPI). Devono essere analizzati esclusivamente i campioni di pazienti affetti da adenocarcinoma dello stomaco o della giunzione gastro-esofagea. In caso di metaplasia intestinale e adenocarcinoma presenti nello stesso campione, assegnare un punteggio al solo componente dell'adenocarcinoma. Evitare le aree che presentano forte infiammazione, le aree di necrosi e quelle in cui i bordi nucleari risultano poco chiari. Non includere i nuclei che richiedono una valutazione soggettiva. Non includere i nuclei con segnali di intensità debole e un fondo non specifico o elevato. Iniziare con una valutazione al microscopio rispettivamente dell'intera sezione colorata tramite FISH e dell'area assegnata sulla sezione H&E. Prima di iniziare il conteggio sulla sezione con colorazione FISH, annotare la distribuzione complessiva del segnale (omogeneo o eterogeneo) sul foglio per il conteggio dei segnali. In caso di distribuzione eterogenea, annotare l'eventuale presenza di amplificazione focale o amplificazione a singole cellule (a mosaico). 1) Distribuzione omogenea del segnale Nel caso in cui la distribuzione del segnale sia omogenea, conteggiare il numero di centromeri dei cromosomi (segnali verdi) e il numero di geni HER2 (segnali rossi), da 20 cellule in 1-2 aree tumorali rappresentative. 2) Distribuzione eterogenea del segnale In caso di distribuzione del segnale eterogenea, eseguire il conteggio su un totale di 20 cellule da aree selezionate secondo i seguenti criteri: A) In caso di amplificazione focale, selezionare le aree con cellule che presentano amplificazione. B) In caso di distribuzione a mosaico o se sono presenti cellule con amplificazione disomiche e polisomiche, selezionare le aree con cellule che presentano amplificazione. In tali aree, oltre alle cellule con amplificazione si devono conteggiare anche le cellule adiacenti prive di amplificazione, per un totale di 20 cellule. Se possibile, non selezionare aree sovrapposte. Ignorare la colorazione di DNA batterico Alcune cellule specializzate (mastociti e macrofagi) presenti nel tessuto gastrico mostrano un livello elevato di colorazione con la sonda HER2 a causa della presenza di DNA batterico. Questo causa la visualizzazione di cellule rosse fortemente fluorescenti, chiaramente diverse dalle cellule tumorali con amplificazione elevata del gene HER2. Conteggio dei segnali Una volta selezionata un'area per la valutazione dei segnali, iniziare l'analisi in uno dei 20 nuclei adiacenti selezionati e contare cellula per cellula ignorando solo i nuclei che non soddisfano i criteri di qualità. Collocare il tumore nel contesto del vetrino colorato con "HE" e valutare la stessa area sul vetrino colorato secondo la tecnica FISH. Esaminare l'intero vetrino colorato per tenere conto di un'eventuale eterogeneità. Selezionare un'area caratterizzata da una buona distribuzione nucleare. Cominciare l'analisi dal quadrante in alto a sinistra dell'area scelta e, proseguendo da sinistra verso destra, contare il numero di segnali all'interno del bordo nucleare di ciascun nucleo esaminato secondo le linee guida riportate di seguito (vedere anche l'appendice 5). - Variare la profondità del fuoco per rilevare tutti i segnali nel singolo nucleo. - Conteggiare due segnali di dimensioni uguali e separati da una distanza pari o inferiore al diametro del segnale come un solo segnale. La distanza deve essere almeno uguale al diametro di un segnale di dimensioni normali per poter conteggiare due segnali separati. Quando la distanza tra due segnali è inferiore al diametro di un segnale, i due segnali devono essere conteggiati come un unico segnale. - Nei nuclei con elevati livelli di amplificazione del gene HER2, i segnali HER2 possono essere posizionati molto vicini l'uno all'altro, formando un cluster di segnali. In questi casi, il numero di ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 37/56

38 Cancro gastrico segnali HER2 non può essere contato ma deve essere stimato. Prestare particolare attenzione ai segnali verdi, dal momento che i cluster dei segnali HER2 rossi possono coprire i segnali verdi rendendone impossibile la visualizzazione. Se si è in dubbio, controllare i segnali verdi con un filtro FITC specifico. Non inserire nella scala di lettura nuclei privi di segnali o con segnali di un solo colore. Inserire nella scala di lettura solamente i nuclei con uno o più segnali FISH di ciascun colore. Guida al conteggio dei segnali 1 Non conteggiare. I nuclei sono sovrapposti, non tutte le aree dei nuclei sono visibili. 2 Due segnali verdi, non inserire nella scala di lettura nuclei con segnali di un solo colore. 3 Conteggiare come 3 segnali verdi e 12 rossi (stima del cluster) 4 Conteggiare come 1 segnale verde e 1 segnale rosso. Due segnali di dimensioni uguali e separati da una distanza pari o inferiore al diametro di un segnale vengono conteggiati come un solo segnale. 5 Non conteggiare (nucleo iper- o ipodigerito). oppure Segnali assenti al centro del nucleo (nuclei a forma di ciambella). 6 Conteggiare come 2 segnali verdi e 3 segnali rossi. Due segnali di dimensioni uguali e separati da una distanza pari o inferiore al diametro di un segnale vengono conteggiati come un solo segnale. 7 Conteggiare come 1 segnale verde e 5 segnali rossi. 8 Conteggiare come 3 segnali verdi (1 segnale verde è sfuocato) e 3 segnali rossi. 9 Cluster di segnali rossi che coprono segnali verdi; controllare i segnali verdi con un filtro FITC specifico oppure non conteggiare. Registrare i conteggi in una tabella, come riportato nell'appendice 3 e 4. Contare 20 nuclei per campione tissutale, se possibile, da aree distinte del tumore. Calcolare il rapporto HER2/CEN-17 dividendo il numero totale di segnali HER2 rossi per il numero totale di segnali CEN-17 verdi. I campioni con un rapporto HER2/CEN-17 superiore o pari a 2 devono essere considerati positivi per l'amplificazione del gene HER2 (29). I risultati prossimi o uguali al valore di cut-off (1,8-2,2) devono essere interpretati con cautela. Se il rapporto è un valore limite (1,8-2.2), eseguire il conteggio di 40 nuclei diversi e ricalcolare il rapporto per i 40 nuclei. Se il conteggio continua a essere un valore limite, considerare come valido il risultato della seconda valutazione. Se disponibile, includere ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 38/56

39 Cancro gastrico la colorazione immunoistochimica di HER2 per un orientamento migliore durante il secondo conteggio. In caso di dubbio, il vetrino del campione deve essere sottoposto ad una nuova lettura. Per i casi limite, si consiglia un consulto tra il patologo e il medico curante. Limitazioni - Gastrico 1. Solo per uso automatizzato su strumenti Dako Omnis. 2. Per la preparazione di tessuti e vetrini e per l'interpretazione della colorazione IQFISH è necessaria una formazione specialistica. L'interpretazione delle colorazioni HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) non deve essere eseguita da persone affette da deficit della visione dei colori. 3. I risultati della tecnica FISH sono strettamente correlati alle modalità di manipolazione e processazione del tessuto precedenti alla colorazione. L'incorretta esecuzione di fissazione, lavaggi, essiccazione, riscaldamento e taglio oppure la contaminazione con altri tessuti o liquidi può influenzare l'ibridazione della sonda. Risultati incoerenti possono essere dovuti anche a variazioni nei metodi di fissazione e di inclusione o da irregolarità intrinseche del tessuto. Caratteristiche di prestazione - Gastrico Efficienza di ibridazione L'efficienza di ibridazione di HER2 IQFISH pharmdx è stata verificata utilizzando 180 sezioni tissutali incluse in paraffina e fissate in formalina, testate presso tre siti di studio. È stato possibile conteggiare tutte e 180 le sezioni tissutali seguendo le linee guida di conteggio del prodotto. L'efficienza di ibridazione è risultata pari al 100%. I rapporti HER2/CEN-17 calcolati e utilizzati negli studi sulle caratteristiche di prestazione sono basati sul conteggio dei segnali in 20 nuclei, utilizzando le linee guida di valutazione fornite nella sezione Interpretazione della colorazione delle presenti Istruzioni per l'uso. Sensibilità analitica La sensibilità analitica di HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è stata esaminata utilizzando 20 campioni diversi di adenocarcinoma gastrico (10 con gene HER2 amplificato e 10 con gene non amplificato). Il rapporto tra il numero di segnali HER2 e CEN-17 è stato calcolato eseguendo il conteggio dei segnali in 20 nuclei di cellule normali all'interno del campione tissutale. Per i 20 campioni tissutali di adenocarcinoma gastrico è stato ottenuto un rapporto HER2/CEN-17 da 0,94 a 1,19. Specificità analitica Le sonde di DNA perher2 disponibili in HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sono state sequenziate e mappate per confermare una copertura totale di 218 kb comprendente il gene HER2. Le sonde di PNA per CEN-17 PNA nel kit HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sono state esaminate, singolarmente e in combinazione, per confermare l'ibridazione specifica alla regione centromerica del cromosoma 17. Per escludere l'ibridazione crociata a cromosomi diversi dal cromosoma 17, sono stati eseguiti studi in metafase secondo le procedure standard di controllo di qualità Dako. Sono state eseguite in totale 275 valutazioni in metafase per la ricerca dell'ibridazione specifica delle miscele di sonde di DNA per HER2 e di PNA per CEN-17. In tutti i 275 casi, l'ibridazione è risultata specifica per il cromosoma 17. In nessuno dei 275 casi ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 39/56

40 Cancro gastrico è stata osservata una ibridazione crociata a loci su altri cromosomi. La specificità della sonda è risultata pertanto del 100% (275 su 275). Per misurare la capacità del saggio IQFISH di identificare esclusivamente le sostanze bersaglio HER2 e CEN-17 senza interferenze di altre sostanze, gli studi sono stati eseguiti su campioni di adenocarcinoma gastrico, omettendo le sonde per HER2 e CEN-17 dalla miscela di ibridazione e utilizzando solo il tampone di ibridazione. È stato valutato un totale 20 campioni per verificare la presenza di segnali non correlati alla miscela di sonde. In nessuno dei 20 campioni sono stati rilevati altri cromosomi bersaglio o interferenze con sostanze strettamente correlate. Studi di affidabilità L'affidabilità del saggio HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è stata testata variando la concentrazione della sonda di PNA, il tempo di recupero del bersaglio, il tempo di incubazione della pepsina, la durata della denaturazione, il tempo di ibridazione e il tempo e la temperatura di lavaggio stringente. Sono stati testati tre parametri diversi su tre diversi campioni tissutali FFPE di adenocarcinoma gastrico e due campioni tissutali FFPE della giunzione gastro-esofagea (per ogni gruppo erano rappresentati campioni tissutali amplificati e non amplificati). Tutti i parametri sono stati testati al di sotto e al di sopra delle impostazioni dei protocolli standard, ad eccezione della concentrazione della sonda di PNA e della temperatura del lavaggio stringente, per cui è stata utilizzata una configurazione che includeva l'impostazione del protocollo standard. Sono stati utilizzanti i seguenti parametri di test: Concentrazione della sonda di PNA: testata al 100% e a +/-17%. Tempo di recupero del bersaglio: testato a 13 min e 45 s e a 16 min e 15 s. Tempo di incubazione della pepsina: testato a 14 min e 45 s e a 16 min e 15 s. Durata della denaturazione: testata a 9 min e 45 s e a 10 min e 45 s. Tempo di ibridazione: testato a 70 min e a 80 min. Tempo di lavaggio stringente: testato a 8 min e 45 s e a 11 min e 15 s. Temperatura di lavaggio stringente: testata a 59 C, 61 C e 63 C. Le tre concentrazioni della sonda di PNA sono state valutate in un esperimento frazionato (strumento JMP, SAS), eseguito con i 12 protocolli di colorazione diversi indicati nella Tabella 12. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 40/56

41 Tabella 12. I 12 protocolli di colorazione diversi utilizzati nello studio di affidabilità. N. protocollo di affidabilità Tempo di recupero del bersaglio (min) Tempo di incubazione della pepsina (min) Durata della denaturazione (min) Parametro di test Tempo di ibridazione (min) Tempo di lavaggio stringente (min) Cancro gastrico Temperatura di lavaggio stringente ( 0 C) Conc. di PNA nella miscela di sonde 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % I cinque i campioni tissutali sono stati tutti sottoposti a colorazione utilizzando tutti e 12 i protocolli. Per lo studio di affidabilità sono state misurate l'intensità del segnale e la qualità della morfologia. Tutti i protocolli hanno determinato la colorazione di tutti i campioni tissutali (60 in tutto), con segnali intensi, chiari e facili da valutare, e pertanto adatti al conteggio. Inoltre, l'effetto dello spessore del tessuto sui risultati del saggio HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) è stato testato variando lo spessore della sezione di campioni tissutali FFPE di cancro gastrico. È stato testato un totale di cinque sezioni consecutive di campioni di adenocarcinoma gastrico con spessori diversi (3, 4, 5, 6 e 7 µm) tramite HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Il coefficiente di variazione medio del rapporto HER2/CEN-17 è risultato pari a 3,9% (con una variazione da 3,2% a 5,0%). Riproducibilità La riproducibilità intergiornaliera e interlotto all'interno del laboratorio è stata testata utilizzando HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Lo studio era uno studio interno, randomizzato e in cieco dei rapporti HER2/CEN-17, eseguito utilizzando sezioni di otto diversi campioni di cancro gastrico, inclusa la giunzione gastro-esofagea, fissati in formalina e inclusi in paraffina con livelli diversi di amplificazione del gene HER2. Gli otto campioni sono stati testati con HercepTest ed erano costituiti da due campioni con HER2 IHC 0/1+, due campioni con HER2 IHC 2+, due campioni con HER2 IHC 3+ e due campioni con rapporto HER2/CEN-17 FISH predeterminato, compreso tra 1,5 e 2,5, ottenuto tramite HER2 IQFISH pharmdx (Code K5731). Ciascun campione è stato sottoposto a colorazione con tre diversi lotti di HER2 IQFISH pharmdx TM (Dako Omnis) nell'arco di cinque giorni non consecutivi. Per l'intero studio è stato elaborato un totale di 240 colorazioni di tessuto, poiché ogni combinazione è stata sottoposta a colorazione in coppie. Le variazioni dei rapporti tra giorni diversi e lotti diversi è illustrata nella Figura 8. I dati sono stati analizzati utilizzando una trasformata di Box-Cox, tramite un modello di effetto casuale, per ottenere una varianza omogenea dei dati. È stato stimato un coefficiente di variazione totale del 6,5% ed è stato determinato che le variazioni tra giorni e tra lotti hanno contribuito, rispettivamente, per l'0,7% e lo 0,8%. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 41/56

42 Cancro gastrico Figura 8. Rapporti HER2/CEN-17 ottenuti in uno studio di riproducibilità su HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), che includeva la riproducibilità tra giorni e lotti diversi. Il valore medio di ogni campione tissutale è mostrato con una linea orizzontale. La riproducibilità di HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tra giorni e lotti diversi è stata inoltre testata esternamente in uno studio stratificato in cieco effettuato in tre sedi (una negli Stati Uniti e due in Europa), su sezioni tissutali di 12 diversi campioni di adenocarcinoma gastrico, inclusa la giunzione gastro-esofagea, fissati in formalina e inclusi in paraffina. Tre campioni erano HER2 IHC 0/1+, tre campioni erano HER2 IHC 2+, tre campioni erano HER2 IHC 3+ e gli altre tre campioni avevano un rapporto HER2/CEN-17 FISH predeterminato compreso tra 1,5 e 2,5, ottenuto tramite HercepTest TM e HER2 IQFISH pharmdx (Code K5731), rispettivamente. I campioni sono stati sottoposti a colorazione e analizzati presso i siti di studio. Ogni campione è stato sottoposto a colorazione per almeno sette volte in sette giorni non consecutivi e valutato da un osservatore presso ciascun sito. 314 sezioni sono state sottoposte a colorazione e incluse nell'analisi statistica. I dati sono stati analizzati utilizzando una trasformata Box-Cox e sono stati calcolati i componenti della varianza. Il coefficiente di variazione totale basato sul limite superiore di confidenza al 95% è stato del 24%. La variazione del rapporto HER2/CEN-17 tra giorni e siti diversi è illustrato nella Figura 9. Figura 9. Grafico di variabilità dei rapporti HER2/CEN-17 nelle unità non trasformate, ottenuti tramite studi di riproducibilità tra giorni e siti diversi per HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) su campioni tissutali di cancro gastrico. La riproducibilità del saggio HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tra osservatori diversi è stata testata nell'ambito di uno studio di confronto tra metodi condotto internamente, utilizzando tre osservatori per testare indipendentemente i campioni ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 42/56

43 Cancro gastrico colorati. La riproducibilità è stata testata su 139 campioni diversi di adenocarcinoma gastrico, con gene HER2 amplificato o non amplificato. I dati sono stati analizzati utilizzando una trasformata Box-Cox. Il coefficiente di variazione medio tra osservatori è risultato pari al 18%. I campioni di adenocarcinoma gastrico erano costituiti da resezioni chirurgiche (96,4%) e biopsie (5,6%). L'81,3% dei campioni è stato ottenuto dallo stomaco e il 18,7% dalla giunzione gastro-esofagea. Ripetibilità La ripetibilità di HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) all'interno del laboratorio è stata testata utilizzando sezioni consecutive di otto campioni di adenocarcinoma gastrico con gene HER2 amplificato o non amplificato. I tessuti sono stati testati a coppie nell'arco di cinque giorni non consecutivi, con tre lotti diversi in un totale di 240 vetrini (120 coppie di sezioni). Per l'analisi dei dati è stato utilizzato il modello di effetto casuale, che ha determinato una varianza attribuibile ai giorni e ai lotti (vedere sopra i risultati dello studio di riproducibilità interno). La varianza residua spiega la varianza tra repliche, e questo conferma la ripetibilità. Il limite superiore di confidenza al 95% per il coefficiente di variazione della ripetibilità è stato del 7,1%. Studi di confronto dei metodi Confronto tra HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e HER2 IQFISH pharmdx (K5731) Lo studio includeva 140 campioni di cancro gastrico, costituiti da diversi tipi di tessuto di adenocarcinoma gastrico, ovvero stomaco e giunzione gastro-esofagea, e da resezioni chirurgiche e biopsie, con distribuzioni di segnale omogenee o eterogenee (focale o a mosaico), come mostrato nella Tabella 13. Tabella 13. Distribuzione dei campioni per tipi di cancro gastrico (stomaco o giunzione gastroesofagea), categoria di distribuzione del segnale (omogenea o eterogenea) e tipo di tessuto (resezione chirurgica o biopsia). Tipo di cancro gastrico Numero di campioni Distribuzione del segnale Numero di campioni Stomaco 113 Omogenea 58 Giunzione gastroesofagea 27 Eterogenea - Focale Eterogenea - A mosaico Tipo di tessuto Resezione chirurgica Numero di campioni 134 Biopsia 6 Totale 140 Totale 140 Totale 140 I campioni erano costituiti da 76 casi con HER2 non amplificato e 64 casi con HER2 amplificato, con il punteggio HercepTest noto indicato nella Tabella 14. Tabella 14. Distribuzione dei campioni in base al punteggio HercepTest e al punteggio HER2 FISH ottenuto con il kit HER2 FISH pharmdx (K5731). Punteggio di colorazione Totale HercepTest n Stato FISH del gene HER2 Amplificato Non amplificato Totale campioni testati con FISH ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 43/56

44 Cancro gastrico I risultati della tabulazione crociata dello stato del gene HER2 ottenuto tramite i due saggi, con calcolo di percentuale di concordanza totale (OPA, Overall Percent Agreement), percentuale di concordanza positiva (PPA, Positive Percent Agreement) e percentuale di concordanza negativa (NPA, Negative Percent Agreement), sono riportati nella Tabella Tabella 15. La correlazione tra i rapporti HER2/CEN-17 ottenuti utilizzando i due saggi è illustrata nella Figura 10. Tabella 15. Tabulazione crociata dello stato del gene HER2 ottenuta tramite HER2 IQFISH pharmdx (K5731) e HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Stato del gene HER2 (Dako Omnis) Non amplificato Stato del gene HER2 (K5731) Non amplificato Amplificato Totale Amplificato Totale OPA: 99,3% PPA: 98,4% NPA: 100% Figura 10. Correlazione tra i rapporti HER2/CEN-17 ottenuti utilizzando HER2 FISH pharmdx (Dako Omnis) e HER2 IQFISH pharmdx (Code K5731) su 140 campioni di cancro gastrico (adattamento lineare: y = 0,06 + 0,97*x; R 2 = 0,97. Ponderato con varianza inversa per consentire l'adattamento lineare). L'intervallo di confidenza al 95% per la differenza media tra i due metodi di colorazione per il rapporto HER2/CEN-17 = 2 è risultato pari a [0,007-0,022]. Questo significa che non si prevedono differenze superiori al 2%. Dati clinici La sicurezza e l'efficacia di trastuzumab (Herceptin ) sono state dimostrate nello studio BO18255 (studio ToGA "An open-label, randomized, multicenter, phase III study of trastuzumab in combination with cisplatin and a fluoropyrimidine (capecitabine or 5- Fluorouracil) (FC+H) versus chemotherapy (FC) alone as first-line therapy in patients with HER2 positive advanced gastric cancer") (28). Lo studio è uno studio di fase III ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 44/56

45 Cancro gastrico multicentrico, randomizzato e in aperto, con pazienti positivi all'her2 con adenocarcinoma gastrico o della giunzione gastro-esofagea in stadio avanzato. Nell studio BO18255 la positività per HER2 è stata definita come positività all'ihc (3+) tramite HercepTest (Dako) e/o positività FISH (HER2/CEN-17 2,0) tramite il kit HER2 FISH pharmdx (Dako). Dopo l'inclusione nello studio, i pazienti sono stati sottoposti in maniera randomizzata a chemioterapia (5-FU o capecitabina e cisplatina) o chemioterapia più trastuzumab. La misura principale dell'efficacia è data dalla sopravvivenza totale (OS, Overall Survival), analizzata tramite test di classificazione logaritmico stratificato. L'analisi finale della sopravvivenza totale basata su 351 decessi è stata statisticamente significativa (livello di significatività nominale dello 0,0193). A un anno di distanza dall'analisi finale è stato condotto uno studio aggiornato della sopravvivenza totale. Il valore mediano di 13,5 mesi per la sopravvivenza totale per il trattamento con Herceptin nel braccio chemioterapia è risultata notevolmente più lunga, rispetto al valore mediano di 11,0 mesi del solo braccio chemioterapia. I risultati sull'efficacia ottenuti negli studi finale e aggiornato sono riepilogati nella Tabella 16 e nella Figura 11. Tabella 16. Sopravvivenza totale nella popolazione ITT (Intention to Treat). Sopravvivenza totale finale n. Decessi (%) Valore mediano IC 95% (mesi) Rapporto di pericolo IC 95% Valore p*, due lati Sopravvivenza totale aggiornata n. Decessi (%) Valore mediano IC 95% (mesi) Rapporto di pericolo IC 95% Braccio FC N= (62,2%) 11,0 (9,4, 12,5) 227 (76,7%) 11,7 (10,3, 13,0) *Confronto con il livello di significatività nominale pari a 0,0193 0,73 (0,60, 0,91) 0,0038* 0,80 (0,67, 0,97) Braccio FC + H N= (56,0%) 13,5 (11,7, 15,7) 221 (74,2%) 13,1 (11,9, 15,1) ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 45/56

46 Cancro gastrico Figura 11. Sopravvivenza totale aggiornata nei pazienti con cancro gastrico metastatico Nella Tabella 17 è riepilogata l'analisi esplorativa della sopravvivenza totale basata sull'amplificazione del gene (FISH) e sul test di iperespressione della proteina (IHC). Tabella 17. Risultati dell'analisi esplorativa della sopravvivenza totale aggiornata in base allo stato del gene HER2. Sottogruppo FISH+ / IHC 0, 1+ (N=133) n. Decessi / n (%) Valore mediano della sopravvivenza totale (mesi) 95% CI (mesi) FC FC+H N=296 a N=298 b 57/71 (80,3%) 8,8 (6,4, 11,7) Rapporto di pericolo (IC 95%) 1,33 (0,92, 1,92) Sottogruppo FISH+ / IHC2+ (N=160) n. Decessi / n (%) 65/80 (81%) Valore mediano della sopravvivenza totale 10,8 (mesi) (6,8, 12,8) 95% CI (mesi) Rapporto di pericolo (IC 95%) 0,78 (0,55, 1,10) Sottogruppo FISH+ o FISH-/IHC3+ c (N=294) n. Decessi / n (%) 104/143 (73%) Valore mediano della sopravvivenza totale 13,2 (mesi) (11,5, 15,2) 95% CI (mesi) Rapporto di pericolo (IC 95%) 0,66 (0,5, 0,87) 56/62 (90,3%) 8,3 (6,2, 10,7) 64/80 (80%) 12,3 (9,5, 15,7) 96/151 (64%) 18,0 (15,5, 21,2) Valore mediano della sopravvivenza stimato dalle curve di Kaplan-Meier. a Due pazienti del braccio FC che risultavano FISH+ ma avevano stato IHC sconosciuto sono stati esclusi dalle analisi. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 46/56

47 Cancro gastrico b Cinque pazienti del braccio Herceptin che risultavano FISH+ ma avevano stato IHC sconosciuto sono stati esclusi dalle analisi. c Include sei pazienti del braccio chemioterapia, 10 pazienti del braccio Herceptin con FISH-, IHC3+ e 8 pazienti del braccio chemioterapia, 8 pazienti del braccio Herceptin con stato FISH sconosciuto, IHC3+. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 47/56

48 Cancro gastrico Risoluzione dei problemi - Gastrico Problema Possibile causa Intervento consigliato 1. Segnali deboli o assenti 1a. I reagenti sono stati esposti a temperature elevate durante il trasporto o la conservazione. 1b. Il microscopio non funziona correttamente - Il filtro impostato non è adatto - La lampada non è adatta - La lampada al mercurio è datata - Le lenti del collettore sono sporche e/o graffiate - L'olio di immersione non è adatto 1a. Controllare le condizioni di conservazione. Assicurarsi che il ghiaccio secco fosse presente al momento della spedizione della miscela di sonde IQISH e della pepsina. Verificare che i reagenti siano stati conservati come specificato. 1b. Controllare lo stato del microscopio e verificare che i filtri impiegati siano idonei all'uso con i fluorocromi della miscela di sonde e che la lampada a mercurio sia corretta e non utilizzata oltre la durata consigliata (vedi Appendice 5). In caso di dubbi, contattare il fornitore del microscopio. 1c. Segnali indeboliti 1c. Evitare lunghe analisi al microscopio e ridurre al minimo l'esposizione a fonti di luce intensa. 2. Aree prive di segnali 1d. Identificazione errata dei tamponi 2. Bolle d'aria intrappolate durante il montaggio 1d. Sostituire i tamponi di carico e verificare che la registrazione (nella workstation) e l'identificazione (sul touch screen) dei tamponi di carico siano state eseguite correttamente. Per ulteriori informazioni, consultare il Manuale utente di base di Dako Omnis. Nota: la soluzione ISH Pre- Treatment Solution è verde e la soluzione ISH Stringent Wash Buffer è gialla. 2. Evitare l'intrappolamento di bolle d'aria. Eliminare eventuali bolle d'aria presenti picchiettando delicatamente con le pinzette. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 48/56

49 Cancro gastrico Problema Possibile causa Intervento consigliato 3. Colorazione eccessiva del fondo 3a. Metodo di fissazione dei tessuti inadeguato 3b. Prolungata esposizione della sezione ibridata a luce intensa 3a Assicurarsi che siano utilizzate esclusivamente sezioni tissutali fissate in formalina, incluse in paraffina. 3b. Evitare lunghe analisi al microscopio e ridurre al minimo l'esposizione a fonti di luce intensa. 4. Morfologia del tessuto alterata 5. Livelli elevati di autofluorescenza sul vetrino, incluse aree prive di tessuto FFPE 4a. Incorretto trattamento con pepsina 4b. Un trattamento con Pepsin di durata eccessiva o uno spessore delle sezioni troppo ridotto può causare la comparsa di cellule fantasma o di cellule "donut" (a ciambella). 5. Utilizzo di vetrini scaduti o non inclusi tra quelli consigliati. 4a. Passare a uno degli altri protocolli di colorazione disponibili. Verificare che il prodotto ISH Pepsin venga conservato alla temperatura corretta. 4b. Provare a utilizzare un protocollo di colorazione con tempo di incubazione della pepsina inferiore. Assicurarsi che lo spessore delle sezioni sia di 3-6 µm. 5. Utilizzare solo i vetrini specificati. Verificare che la data di scadenza dei vetrini non sia già trascorsa. NOTA: se il problema non è imputabile a nessuna delle cause sopracitate o se l'intervento correttivo consigliato non si rivela efficace, contattare l'assistenza tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 49/56

50 Cancro gastrico Appendice 3 - Gastrico HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), codice GM333 Schema di lettura Data di esecuzione: ID scheda del ciclo di colorazione: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Lotto: ID campione: Caratterizzazione della distribuzione dei segnali nel tessuto: Omogenea: Eterogenea Focale: oppure Eterogenea A mosaico: Contare i segnali in 20 nuclei Nucleo n. Punteggio HER2 (rosso) Punteggio CEN-17 (verde) Nucleo n. Punteggio HER2 (rosso) Punteggio CEN-17 (verde) Totale (1-10) Totale (11-20) Per la determinazione del rapporto HER2/CEN-17, contare il numero di segnali HER2 e il numero di segnali CEN-17 negli stessi 20 nuclei e dividere il numero totale dei segnali HER2 per il numero totale dei segnali CEN-17. Se il rapporto HER2/CEN-17 è un valore limite (1,8-2,2), eseguire il conteggio di 40 nuclei diversi e ricalcolare il rapporto per i 40 nuclei (fare riferimento allo schema di lettura del ricalcolo nell'appendice 4). Valori del rapporto prossimi o pari al valore di cut-off (1,8-2,2) devono essere interpretati con cautela (vedere la guida al conteggio). ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 50/56

51 Cancro gastrico HER2 CEN-17 Rapporto HER2/CEN- 17 Punteggio totale (1-20) Rapporto < 2: amplificazione del gene HER2 non riscontrata Rapporto 2: amplificazione del gene HER2 riscontrata Data e firma, nome del tecnico: Data e firma, nome del patologo: Per le linee guida relative all'attribuzione del punteggio vedere la sezione "Interpretazione della colorazione". ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 51/56

52 Cancro gastrico Appendice 4 - Gastrico HER2 IQFISH pharmdx, codice GM333 Schema di lettura ricalcolo Data di esecuzione: ID scheda del ciclo di colorazione: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Lotto: ID campione: Segnali nei 40 nuclei aggiuntivi (1-40) Nucleo n. HER2 (rosso) CEN17 (verde) Nucleo n. HER2 (rosso) CEN-17 (verde) Nucleo n. HER2 (rosso) CEN-17 (verde) Nucleo n. HER2 (rosso) CEN-17 (verde) Totale Totale Totale Totale (1-10) (11-20) (21-30) (31-40) Per la determinazione del rapporto HER2/CEN-17, contare il numero di segnali HER2 e il numero di segnali CEN-17 negli stessi 40 nuclei e dividere il numero totale dei segnali HER2 per il numero totale dei segnali CEN-17. Registrare il punteggio totale relativo ai nuclei 1-40 nella tabella riportata di seguito. Punteggio totale (1-40) HER2 CEN-17 Rapporto HER2/CEN- 17 Rapporto < 2: amplificazione del gene HER2 non riscontrata Rapporto 2: amplificazione del gene HER2 riscontrata Data e firma, nome del tecnico: Data e firma, nome del patologo: Per le linee guida relative all'attribuzione del punteggio vedere la sezione "Interpretazione della colorazione". ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 52/56

53 Cancro gastrico Appendice 5 - Gastrico HER2 IQFISH pharmdx, codice GM333 Specifiche per il microscopio a fluorescenza In combinazione con HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333, Dako consiglia di utilizzare l'apparecchiatura seguente: 1. Tipo di microscopio Microscopio ad epifluorescenza 2. Lampada Lampada al mercurio da 100 watt (prendere nota dei tempi d'impiego) 3. Obiettivi Per l'esame del tessuto, è possibile utilizzare obiettivi a immersione in olio 16X o 20X Per un ingrandimento elevato e per il conteggio dei segnali, utilizzare solo obiettivi a immersione in olio, in particolare 100x. 4. Filtri I filtri sono progettati in modo specifico per singoli fluorocromi e devono essere scelti di conseguenza. Dako consiglia l'uso di un filtro DAPI specifico in combinazione con un doppio filtro Texas Red/FITC di alta qualità. Filtro DAPI, ad esempio filtro Chroma n Filtro doppio Texas Red/FITC, ad esempio filtro Omega Optical n. XF53 o filtro Chroma n È possibile utilizzare filtri singoli Texas Red e FITC per la conferma e il conteggio Fluorocromo Lunghezza d'onda di eccitazione Lunghezza d'onda di emissione FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm I filtri sono specifici per ogni tipo di microscopio, pertanto, l'uso dei filtri adatti è fondamentale per una corretta interpretazione. Per ulteriori informazioni, contattare il fornitore del microscopio oppure il rappresentante Dako di zona. 5. Olio Olio non fluorescente Precauzioni Si sconsiglia l'uso di una lampada al mercurio da 50 watt Non è possibile utilizzare filtri per rodamina Si sconsiglia l'uso di filtri tripli L'uso di un microscopio non ottimizzato potrebbe causare problemi durante la lettura dei segnali fluorescenti. È importante che la sorgente di luce non venga utilizzata oltre la data di scadenza e che sia allineata in modo corretto e a fuoco. È compito del cliente controllare e seguire le raccomandazioni del produttore per la lampada al mercurio. Il microscopio deve essere sottoposto a manutenzione e la lampada al mercurio deve essere allineata correttamente prima dell'interpretazione dei risultati. È necessario assicurarsi che il campione sia esposto alla luce di eccitazione per il minor tempo possibile, in modo da ridurre al minimo la perdita di intensità della fluorescenza. Per l'impostazione del microscopio in uso, si consiglia di consultare il produttore prima di iniziare la procedura di ibridazione in situ in fluorescenza oppure fare riferimento alla letteratura. ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 53/56

54 Bibliografia 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985;230: Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76: Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science. 1985;229: Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci. 2000;30: Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res. 2001;61: Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol. 1999;9: Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235: Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res. 1990;50: Ross JS, Slodkowska EA, Symmans WF et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-her-2 therapy and personalized medicine. Oncologist 2009;14: Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci. 2002;32: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16: Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 54/56

55 18. Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer. 2001;92: Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol. 2000;53: Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology. 2001;61 Suppl 2: Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adelaide J, Chaffanet M, et al. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer. J Pathol. 2004;202(3): Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Baslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol. 2004;59: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology. 2010;78: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol. 2007;59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol. 2008;32: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol. 2005;27: Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 2005;16: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52: ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 55/56

56 Spiegazione dei simboli Numero di catalogo Limiti di temperatura Data di scadenza Dispositivo medico diagnostico in vitro Non esporre alla luce del sole (consultare la sezione sulla conservazione) Produttore Consultare le istruzioni per l'uso Codice lotto Pittogramma GHS (consultare la sezione sulle precauzioni) Prodotto da: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel Fax Distribuito negli Stati Uniti da: Dako North America Inc Via Real Carpinteria, CA 93013, USA Tel. 805/ Numero verde: 800/ Informazioni sugli ordini: Tel. 800/ Fax: 805/ Tel. Assistenza tecnica: 800/ ( ) P04125IT_01_GM333/ p. 56/56