Spettroscopia UV-visibile. Parte I

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1 Spettroscopia UV-visibile Parte I

2 La spettroscopia Col termine di spettroscopia o spettrometria si intende lo studio si uno spettro ossia dell insieme di tutte le possibili frequenze delle radiazioni elettromagnetiche associate ad un fenomeno. La radiazione elettromagnetica è una forma d energia responsabile della propagazione nello spazio-tempo del campo elettromagnetico sottoforma di onde elettromagnetiche. I metodi spettroscopici si basano sulla misura delle variazioni di energia che si verificano a carico di nuclei, atomi o molecole in seguito ad interazione con una radiazione elettromagnetica. In base all oggetto di studio, si può paralare di: spettroscopia atomica; spettroscopia molecolare. Inoltre, in base alle condizioni operative, si distingue: spettroscopia di assorbimento: si basa sulla riduzione della intensità della radiazione elettromagnetica come conseguenza della sua interazione con l analita; spettroscopia di emissione: determinazione dell intensità della radiazione emessa quando l analita viene eccitato con energia termica elettrica o radiante.

3 La radiazione elettromagnetica La radiazione elettromagnetica può essere descritta in termini sia di onde sia di particelle. Si tratta di un fenomeno ondulatorio dato dalla propagazione in fase del campo elettrico e del campo magnetico, oscillanti in piani tra loro ortogonali e ortogonali alla direzione di propagazione. Proprietà dell onda elettromagnetica: l = lunghezza d onda, distanza che intercorre tra due creste d onda; = frequenza, è il numero di onde o oscillazioni contenuti nell unità di tempo; A = ampiezza o intensità della radiazione; E, H = vettore elettrico e magnetico (y e z) che, nel caso di una radiazione elettromagnetica, vibrano in 2 piani tra loro perpendicolari.

4 Propagazione di una radiazione elettromagnetica c νλ Nel vuoto, la luce si propaga alla massima velocità (c) che corrisponde a quella della luce pari cioè a 2, m/s. In qualsiasi altro mezzo, la velocità di propagazione è inferiore a quella della luce ed è pari a c/n, dove n è l indice di rifrazione del mezzo. Nota bene: la frequenza è una grandezza caratteristica di una vibrazione luminosa e pertanto è indipendente dal mezzo in cui avviene la propagazione. Quando la luce attraversa due mezzi con n diverso, la sua frequenza rimane invariata ma la l cambia. λ c ν

5 Energia di una radiazione elettromagnetica Dal punto di vista energetico, una radiazione elettromagnetica può essere considerata come un treno di particelle (quanti o meglio fotoni) ciascuno dei quali è dotato di una certa energia descritta dall equazione di Planck: E = h dove h è la costante di Planck pari a 6, erg/s. Dato che nel vuoto: λ c ν E hc λ Da queste equazioni si deduce che l energia di una radiazione elettromagnetica è direttamente proporzionale alla frequenza e inversamente proporzionale alla lunghezza d onda.

6 Tipi di radiazione elettromagnetica

7 Atomi/molecole e radiazione elettromagnetica

8 Transizioni molecolari Nella tabella, sono riportati i tipi di transizioni che risultano dalle interazioni della radiazione elettromagnetica con un campione.

9 Spettroscopia di assorbimento UV-VIS-IR Le interazioni delle radiazioni elettromagnetiche con le molecole possono indurre: la variazione della frequenza di rotazione della molecola intorno ad un asse (spettro rotazionali); la variazione della frequenza di vibrazione di un legame tra due atomi (spettro vibrazionali); la transizione di un elettrone di valenza nel caso di atomi o di un elettrone di un orbitale molecolare nel caso di molecole, da un livello interno ad uno più esterno (spettro elettronico). I tre tipi di spettri si ottengono con energie molto diverse; infatti una transizione elettronica può essere prodotta solo da radiazioni UV-VIS, mentre le transizioni vibrazionali e rotazionali da radiazioni IR lontano o vicino.

10 Gli orbitali atomici 1 Gli orbitali atomici interessati nelle transizioni elettroniche sono quelli di tipo s, p e d. Gli orbitali s Sono a simmetria sferica e la carica dell elettrone è distribuita in modo simmetrico rispetto al nucleo. Si possono rappresentare con una sfera entro la quale la funzione d onda è sempre positiva. Nell orbitale 1s non ci sono nodi, ossia non ci sono punti in cui la probabilità di trovare l elettrone sia nulla. Orbitale 1s

11 Gli orbitali atomici 2 Aumentando il numero quantico, si passa all orbitale a maggiore energia 2s in cui è presente un nodo. Nodo (+) Nodo (+) (-) (-) L orbitale 2p orbitale di tipo di ellissoide, con segni opposti di nei due lobi (esiste un nodo).

12 Gli orbitali atomici 3 L orbitale 3s possiede 2 nodi (N.B. aumentando il numero quantico aumenta il numero di nodi e l energia).

13 Gli orbitali molecolari 1 La combinazione di due orbitali atomici 1s può dare luogo a due diversi orbitali : uno legante ( ) e uno antilegante ( *). Nel caso specifico di una molecola biatomica come l idrogeno (H 2 ): La radiazione UV di 120 nm determina una transizione * Orbitali 2p:

14 Gli orbitali molecolari 2 Un terzo tipo di orbitale molecolare è costituito dagli orbitali non leganti (n), formati cioè dagli elettroni esterni non impegnati in un legame molecolare (es. gli elettroni non condivisi dell ossigeno dei gruppi carbonilici). Questi elettroni possono essere promossi dall orbitale non legante n stabile, ad uno antilegante: n * n *

15 Energia Tipi di transizione 1 Antilegante * Antilegante * Non legante n Legante Legante * : Perché avvenga questa transizione, l energia deve essere molto elevata e, pertanto, può essere fornita solo da radiazioni UV lontano. Un elettrone in un orbitale di legame s viene eccitato al corrispondente orbitale di non legame. Transizioni di questo tipo non sono quindi visibili con i normali spettrofotometri, ma bisogna far ricorso a tecniche in vuoto. Sono transizioni tipiche degli idrocarburi come il metano che possiede solo legami C-H, può dar luogo solo a questo tipo di transizione e mostra un massimo di assorbanza a 125 nm. n * : Consiste alla promozione di un elettrone di un orbitale di non legame ad uno di antilegame * (es. eteri, ammine, solfuri, alogenuri). Le transizioni n * possono dare luogo ad assorbimento a l diverse a seconda della natura dell eteroatomo: alcoli ed eteri assorbono nell UV lontano e sono quindi trasparenti nella zona di lunghezza d onda > 180 nm; ammine, solfuri, alogenuri assorbono nell UV vicino a causa del fatto che i loro rispettivi elettroni di non legame sono trattenuti meno stabilmente nei corrispondenti orbitali atomici di non legame.

16 Tipi di transizione 2 * : composti che contengono un solo doppio legame etilenico, triplo legame di tipo acetilenico o nitrilico danno transizioni * nell UV lontano, mentre composti contenenti gruppi carbonilici (aldeidi-chetoni), carbossilico, azo, nitro, nitroso, nitrato, nitrito danno transizioni * nell UV vicino (l > 200 nm). Le bande di assorbimento * si suddividono in: K o di coniugazione: sistemi molto delocalizzati come sistemi aromatici e coniugati: l = nm > 10 4 B benzenoide: aromatici, banda classica benzene, non permessa dalla restrizioni di simmetria e quindi poco intensa: l = 270 nm > 10 2 E etilenica: tipica di sistemi insaturi non coniugati: l = nm = = coefficiente di estinzione molare. Esprime l attitudine di un gruppo a subire una transizione elettronica ed è un valore compreso fra 0 e 10 6.

17 Esempi di transizione Gruppo Esempio l max (nm) Ossidrile Ossidrile Sulfidrile Etere Tioetere Amminico Ioduro Cloruro Bromuro Acqua Metanolo Butantiolo Dietiletere Dimetilsolfuro Metilammina Ioduro metilico Cloruro metilico Bromuro di metile

18 Gruppi cromofori e auxocromi E definito cromoforo un atomo o un gruppo di atomi responsabile dell assorbimento della radiazione elettromagnetica e quindi capace di originare una transizione elettronica. Tutti i gruppi cromofori producono uno spostamento (shift) batocromico (o shift rosso), cioè uno spostamento del massimo di assorbimento verso lunghezze d onda maggiori. Solitamente cromofori isolati danno assorbimenti di bassa intensità e a valori di l < 200 nm. Quando in una molecola sono presenti cromofori tra loro coniugati, si ottengono picchi di assorbimento intensi a l > 200 nm. La saturazione di un gruppo insaturo produce uno shift ipsocromico (o shift blu), cioè uno spostamento verso l minori. La coniugazione consente una delocalizzazione degli elettroni di legame con conseguente stabilizzazione degli orbitali di antilegame * e conseguente abbassamento del loro livello energetico. E definito auxocromo un gruppo saturo con elettroni non leganti che quando legato ad un cromoforo comporta una variazione dell intensità (e quindi una variazione del coefficiente di estinzione molare, ) e della l (per es. OH, NH 2, Cl - ). Un auxocromo presenta gruppi funzionali con doppietti elettronici non condivisi In generale, un effetto che produca una variazione di intensità di assorbimento viene definito ipercromico o ipocromico, a seconda che la variazione si positiva o negativa.

19 Tipologie di spostamenti (shift) Shift ipercromico Shift ipsocromico (blu shift) Shift batocromico (red shift) Shift ipocromico l

20 Transizioni energetiche A temperatura ambiente, atomi e molecole si trovano nel rispettivo stato fondamentale a cui corrisponde quello di minima energia. Quando vengono sollecitati da una opportuna radiazione elettromagnetica che trasferisce loro una certa quantità di energia, passano dallo stato fondamentale a quello eccitato a maggiore energia. Assorbimento Rilassamento E 2 + E - E E 1 Lo stato eccitato non è stabile e dura per tempi brevissimi. Gli atomi e le molecole tendono a tornare allo stato fondamentale restituendo all ambiente l energia assorbita, cedendola sotto forma di radiazione.

21 Energia interna delle molecole 1 Come nel caso degli atomi, anche le molecole hanno un energia interna dovuta a diversi contributi: E Elettronica E Rotazionale E Vibrazionale E Interna = E Elettronica + E Rotazionale + E Vibrazionale = energia elettronica. = energia associata alla rotazione della molecola su se stessa (intorno a uno o più assi). = energia associata al movimento reciproco degli atomi nella molecola. La somma di E Rotazionale con E Vibrazionale costituisce l energia cinetica della molecola che è proporzionale alla temperatura. Stiramento simmetrico Stiramento asimmetrico Vibrazioni di piegamento Vibrazioni di stiramento Wagging fuori dal piano Twisting fuori dal piano Rocking nel piano Scissoring nel piano

22 Energia interna delle molecole 2 L energia delle molecole (come quella degli atomi) è quantizzata, per cui sono permessi solo determinati livelli di energia: E Interna = E Elettronica +E Rotazionale +E vvbrazionale Stati elettronici Stati vibrazionali Stati rotazionali Rappresentazione schematica dei livelli energetici molecolari. A ogni livello elettronico sono associati diversi livelli vibrazionali e a ciascuno di questi, a sua volta, diversi livelli rotazionali.

23 Bande di assorbimento La banda di assorbimento consiste quindi di un numero molto elevato di linee, corrispondenti alle diverse transizioni vibrazionali e rotazionali. In soluzione, le specie assorbenti sono circondate dal solvente e la banda di assorbimento diventa allargata a causa delle collisioni che si verificano in soluzione e che tendono ad allargare le energie degli stati quantici. Eccitazione di un elettrone dallo stato fondamentale a quello eccitato. Spettro UV-VIS della 1,2,4,5- tetrazina.

24 Legge dell assorbimento La legge di Lambert-Beer è una legge sperimentale che descrive i fenomeni di assorbimento delle radiazioni elettromagnetiche e definisce che la quantità di radiazione attenuata (assorbita) dipende dalla concentrazione delle molecole che assorbono e dal cammino ottico nel quale avviene l assorbimento. L assorbanza (A) è data da: Definita la trasmittanza (T) come la frazione di luce incidente trasmessa dalla soluzione, ovvero il rapporto fra l intensità della radiazione in uscita (P) e quella della radiazione incidente (P 0 ): P P T T % 100 P 0 P0 Assorbanza (A) logt log P P 0

25 Determinazione sperimentale dell assorbanza 1 L assorbanza si determina sperimentalmente mediante strumenti chiamati spettrofotometri, ponendo la soluzione da esaminare in una cella (cuvetta) trasparente alla radiazione elettromagnetica e di cammino ottico noto. L assorbanza è data da: A = k. d. C dove: A = assorbanza (adimensionale) d = cammino ottico (in cm), ossia lo spessore di soluzione attraversato dal raggio. C = concentrazione della specie che assorbe (espressa in mol/l o g/l o g/100 ml). k = è una costante che dipende dalla sostanza esaminata, dal solvente, dalla lunghezza d onda. k ha valori numerici e sigle diverse a seconda delle unità di misura utilizzate per esprimere la concentrazione.

26 Determinazione sperimentale dell assorbanza 2 In particolare: quando C è espressa in moli/l, k, indicato con prende il nome di assorbività molare o coefficiente di estinzione molare. Le dimensioni di sono L.mol -1.cm -1. quando C è espressa in g/l, k, indicato con la lettera a, prende il nome di assorbività. Le dimensione di a sono L.g -1.cm -1. Questo modo di esprimere k è tipico della letteratura americana e si utilizza quando il peso molecolare dell analita non è noto. quando C è espresso in g/100 ml, k, viene indicato con A(1%, 1 cm) e prende il nome di assorbanza specifica (si trova anche espresso come E(1%, 1cm), coefficiente di estinzione specifico). La conversione da una forma all altra è possibile tramite la seguente relazione: a A( 1%, 1cm) 10 Il valore della costante k dipende dalla lunghezza d onda a cui viene effettuata la misura dell assorbanza. Per convenzione, viene riportato il valore di ( max ) misurato alla l max. ε PM

27 Assorbimento dei composti organici Composti contenenti solo elettroni Idrocarburi saturi. Dato che l energia per transizioni * è dell ordine di 185 kcal/mol, tale transizione avviene solamente nell UV lontano con l < 180 nm. Composti saturi contenenti elettroni n Composti saturi contenenti eteroatomi come ossigeno, azoto, zolfo e alogeni, posseggono elettroni non leganti (n) oltre a elettroni di tipo. La transizione n * richiede meno energia di quella * e questo consente un assorbimento con una l compresa fra 200 e 220 nm. Tuttavia, solfuri, disolfuri, tioli, ammine, bromuri e ioduri pur mostrando un assorbimento con l > 200 nm, questo è di troppo debole intensità per essere sfruttato dal punto di vista dell analisi quantitativa.

28 Assorbimento dei gruppi funzionali Cromoforo Esempio l max (nm) Solvente Origine >C=C< Etilene * -C C- Acetilene * -CO- Acetone esano * esano n * -CHO Acetaldeide alcool * alcool n * -COOH Acido acetico acqua n * -COOR Etilacetato acqua n * -CONH 2 Acetammide acqua n * -CN Acetonitrile NO Nitrosobutano etere n * -NO 2 -ONO Nitrometano Nitrito d'amile alcool * alcool n * etere * etere n * -N=N- Diazoetilacetato alcool * alcool n * -SO- Dimetilsolfossido alcool * -SO 2 - Dimetilsolfone < * -C 6 H 5 Benzene esano esano -

29 Cromofori etilenici Il cromoforo etilenico isolato assorbe nell UV lontano ( *). La sostituzione alchilica comporta uno shift batocromico che aumenta all aumentare del numero di sostituenti alchilici. Le caratteristiche di assorbimento dei cicloalcheni è simile a quelle dei composti aciclici. Composto Formula l max (nm) Etilene CH 2 = CH Monosostituito RCH = CH Bisostituito RCH = CHR' Trisostituito R'RCH = CHR" Tetrasostituito R'RCH = CHR"R'" Quando una molecola contiene due o più legami etilenici isolati tra loro da almeno un gruppo metilenico, la molecola assorbe alla stessa l di una molecola contenente un solo legame etilenico (l intensità è proporzionale al numero di doppi legami presenti).

30 Alcheni ciclici Questi composti presentano un comportamento analogo a quello dei composti lineari. Il cicloesene in soluzione di cicloesano assorbe a 190 nm ( max = 7.250). Nei sistemi policiclici si assiste ad uno shift batocromico tanto più marcato quanto è maggiore la sostituzione sul doppio legame. O O CH 3 l max = 193 nm ( max = ) l max = 206 nm ( max = )

31 Orbitali leganti Orbitali antileganti Sistemi dienici coniugati In un sistema dienico coniugato (es. 1,3-butadiene), quando la complanarità lo permette, si instaura una sovrapposizione degli orbitali, anche a livello degli atomi C2 e C3. In questo modo, la coniugazione comporta la creazione di due nuovi stati energetici: Min. coniug. antilegante Max. coniug. antilegante Min. coniug. legante Max. coniug. legante

32 Energia Sistemi polienici coniugati All aumentare della coniugazione, la differenza di energia tra orbitali e * diminuisce, aumentano gli orbitali per combinazione lineare dei singoli cromofori. 2 o.m. 4 o.m. 6 o.m. 8 o.m. etilene butadiene esatriene octatetraene

33 Predizione dell effetto batocromico Un metodo empirico per predire l effetto batocromico di sostituenti alchilici nell 1,3-butadiene è stato definito da Fieser e Woodward che consente di avere una buona predizione fino a quattro doppi legami: Ogni gruppo alchilico (o residuo di anello) legato al sistema dienico comporta uno shift batocromico di 5 nm. Ogni doppio legame esociclico comporta un ulteriore contributo di 5 nm. Omoanulare Eteroanulare Descrizione Contributo Valore base per dieni eteroanulari 214 Valore base per dieni omoanulari 253 Incrementi per: Doppio legame che estende la coniugazione + 30 Sostituenti alchilici o residui di anelli + 5 Doppio legame esociclico + 5 Gruppi polari: OAc + 0 O-Alchile + 6 S-Alchile + 30 Cl, Br + 5 N(Alchile) Correzione per il solvente + 0 l max = Totale

34 Esempio di predizione dell effetto batocromico 1 Doppio legame esociclico CH 3 H H H 3 C CH 3 H H diene eteroanulare 3 residui di anelli (1, 2, 3) 1 doppio legame esociclico l max calcolata CH 3 CH 3 5 Colesta-3,5-diene 2 3 l max osservata ( max = ) Descrizione Contributo Valore base per dieni eteroanulari 214 Valore base per dieni omoanulari 253 Incrementi per: Doppio legame che estende la coniugazione + 30 Sostituenti alchilici o residui di anelli + 5 Doppio legame esociclico + 5 Gruppi polari: OAc + 0 O-Alchile + 6 S-Alchile + 30 Cl, Br + 5 N(Alchile) Correzione per il solvente + 0 Doppio legame esociclico

35 Esempio di predizione dell effetto batocromico CH 3 H H H 3 C CH 3 H H diene omoanulare 3 residui di anelli (1, 2, 3) 1 doppio legame esociclico l max calcolata CH 3 CH 3 5 Colesta-2,4-diene 2 3 l max osservata ( max = ) Descrizione Contributo Valore base per dieni eteroanulari 214 Valore base per dieni omoanulari 253 Incrementi per: Doppio legame che estende la coniugazione + 30 Sostituenti alchilici o residui di anelli + 5 Doppio legame esociclico + 5 Gruppi polari: OAc + 0 O-Alchile + 6 S-Alchile + 30 Cl, Br + 5 N(Alchile) Correzione per il solvente + 0 Doppio legame esociclico

36 Regole di Fieser e Kuhn 1 Nel caso in cui il poliene coniugato contenga più di quattro doppi legami, si utilizzano le regole di Fieser e Kuhn: l max = M + n (48,0 1,7 n) 16,6 R endo 10 R eso max = (1, ) n dove: n = numero dei doppi legami coniugati; M = numero degli alchili o dei sostituenti alchilici del sistema coniugato; R endo = numero degli anelli con doppi legami endociclici nel sistema coniugato; = numero degli anelli con doppi legami esociclici. R eso Non coniugato Non coniugato Licopene l max = (8) + 11 [48,0 1,7 (11)] 0 0 = 476,3 nm max = (1, ) 11 = 1, l max = 474 nm (osservata in esano) max = 1,

37 Regole di Fieser e Kuhn 2 b-carotene l max = (10) + 11 [48,0 1,7 (11)] 16,6 (2) 0 = 453,1 nm max = (1, ) 11 = 19, l max = 452 nm (osservata in esano) max = 15,2.10 4

38 Cromofori carbonilici A livello del doppio legame cromoforo, i composti carbonilici possiedono: una coppia di elettroni ; una coppia di elettroni ; due coppie di elettroni di non legame. Quindi le possibili transizioni sono le seguenti: * (l 150 nm) n * (l 190 nm) n * (270 < l < 300 nm (banda R), molto debole < 30)

39 Aldeidi e chetoni saturi L assorbimento n * di aldeidi e chetoni è estremamente debole (banda R). L eventuale introduzione di un alogeno in posizione ha un minimo effetto. Composto l max (nm) max Solvente Acetone Isocianato Etilmetilchetone Isocianato Diisobutilchetone Isocianato Esametilacetone Alcol Ciclopentanone Esano Cicloesanone Esano Acetaldeide Isocianato Propionaldeide Isocianato Isobutiraldeide Esano

40 Aldeidi e chetoni,b-insaturi I composti contenenti un gruppo carbonilico coniugato con un gruppo etilenico sono chiamati enoni. In generale, gli enoni sono caratterizzati da un intensa banda di assorbimento (banda K) nella regione nm ( < < ) e una banda debole dovuta alla transizione n * (banda R) a nm. Composto Banda K Banda R l max (nm) log max l max (nm) log max Solvente Metilvinilchetone 212,5 3, ,32 Etanolo Isopropenilmetilchetone 218 3, ,4 Etanolo Acroleina 210 4, ,41 Acqua Crotonaldeide 220 4, Etanolo 329 1,39 Crotonaldeide 214 4, , ,25 Isocianato

41 Acidi carbossilici, esteri e lattoni Gli acidi carbossilici saturi mostrano un debole assorbimento a circa 200 nm dovuto alla transizione n *. Gli acidi carbossilici insaturi mostrano una caratteristica e intensa banda K a circa 200 nm e Gli esteri e sali sodici di acidi carbossilici mostrano un assorbimento a lunghezze d onda e di intensità comparabile ai corrispondenti acidi. La coniugazione ha un effetto simile ai corrispondenti acidi.

42 Predizione dell assorbimento di enoni e dienoni b b Enone O d d b Dienone Nota bene: I valori tabulati sono validi per il calcolo della l max in etanolo. O Descrizione Contributo Valori base Chetoni,b-insaturi aciclici 215 Chetoni,b-insaturi ciclici a sei termini 215 Chetoni,b-insaturi ciclici a cinque termini 202 Aldeidi,b-insature 210 Acidi carbossilici ed esteri,b-insaturi 195 Incrementi per: Doppio legame che estende la coniugazione +30 Gruppo alchilico o residuo d anello in +10 b +12 o più +18 Gruppi polari: -OH +35 b +30 d +50 -OAc b d +6 -OMe +35 b d +31 -SAlchile b +85 -Cl +15 b +12 -Br +25 b +30 -NR 2 b +95

43 Esempio di predizione dell assorbimento b O CH 3 1-acetilcicloesene chetone,b-insaturo gruppo alchilico in gruppo alchilico in b l max calcolata l max osservata (in EtOH) Descrizione Contributo Valori base Chetoni,b-insaturi aciclici 215 Chetoni,b-insaturi ciclici a sei termini 215 Chetoni,b-insaturi ciclici a cinque termini 202 Aldeidi,b-insature 210 Acidi carbossilici ed esteri,b-insaturi 195 Incrementi per: Doppio legame che estende la coniugazione +30 Gruppo alchilico o residuo d anello in +10 b +12 o più +18 Gruppi polari: -OH +35 b +30 d +50 -OAc b d +6 -OMe +35 b d +31 -SAlchile b +85 -Cl +15 b +12 -Br +25 b +30 -NR 2 b +95

44 Esempio di predizione dell assorbimento 2 Enolo del 1,2-ciclopendandienone HO O b chetone,b-insaturo anello a 5 gruppo alchilico in b gruppo OH in l max calcolata l max osservata (in EtOH) Descrizione Contributo Valori base Chetoni,b-insaturi aciclici 215 Chetoni,b-insaturi ciclici a sei termini 215 Chetoni,b-insaturi ciclici a cinque termini 202 Aldeidi,b-insature 210 Acidi carbossilici ed esteri,b-insaturi 195 Incrementi per: Doppio legame che estende la coniugazione +30 Gruppo alchilico o residuo d anello in +10 b +12 o più +18 Gruppi polari: -OH +35 b +30 d +50 -OAc b d +6 -OMe +35 b d +31 -SAlchile b +85 -Cl +15 b +12 -Br +25 b +30 -NR 2 b +95

45 Esempio di predizione dell assorbimento b OH chetone,b-insaturo anello a 6 2 gruppi alchilici in b gruppo OH in l max calcolata l max osservata (in EtOH) O Descrizione Contributo Valori base Chetoni,b-insaturi aciclici 215 Chetoni,b-insaturi ciclici a sei termini 215 Chetoni,b-insaturi ciclici a cinque termini 202 Aldeidi,b-insature 210 Acidi carbossilici ed esteri,b-insaturi 195 Incrementi per: Doppio legame che estende la coniugazione +30 Gruppo alchilico o residuo d anello in +10 b +12 o più +18 Gruppi polari: -OH +35 b +30 d +50 -OAc b d +6 -OMe +35 b d +31 -SAlchile b +85 -Cl +15 b +12 -Br +25 b +30 -NR 2 b +95

46 Effetto del solvente sugli enoni Dato che i composti carbonilici sono polari, risentono dell effetto solvente e, in particolare, la banda R risente dell effetto ipsocromico associato all aumentata polarità del solvente. Solvente Correzione Etanolo 0 Metanolo 0 Diossano +5 Cloroformio +1 Etere +7 Acqua -8 Esano +11 Cicloesano +11 Per esempio, se si volesse predire la l max in un solvente diverso dall etanolo, come ad esempio il cicloesano, bisognerebbe sommare +11 al valore calcolato.

47 Lo spettrofotometro Bianco Cella Rivelatore Chopper Monocromatore Sorgente luminosa UV-visibile Campione sorgente: lampada che emette radiazioni nell intervallo spettrale di misura; monocromatore: sistema che permette di selezionare radiazioni elettromagnetiche monocromatiche; cella: sede dove è collocato il campione; rivelatore: dispositivo che misura intensità della radiazione.

48 La sorgente La sorgente è costituita da lampade che emettono radiazioni nell intervallo spettrale di misura, che può variare dall UV al visibile. regione del visibile: si usano lampade a incandescenza come quelle a filamento di tungsteno. Coprono l intervallo di lunghezza d onda da 930 a 330 nm. regione dell UV: si usano lampade al deuterio. Si tratta di lampade a scarica in gas, in cui il bulbo di quarzo è riempito di deuterio che, eccitato, emette uno spettro continuo di radiazioni al di sotto di 400 nm. Spettro di una lampada al tungsteno Lampada al deuterio e relativo spettro

49 Il monocromatore 1 Le lampade emettono radiazioni in tutte le direzioni dello spazio e quindi per ottenere un fascio di luce sottile e ben focalizzato, è necessario un sistema ottico costituito da lenti, specchi e fenditure. Tale fascio viene quindi inviato sul monocromatore che scompone la radiazione policromatica in bande il più possibile monocromatiche. La precisione dell analisi dipende dal fatto che la radiazione incidente sul campione sia monocromatica. Esistono due tipi di monocromatori: filtri che assorbono una parte delle componenti spettrali della radiazione incidente e ne trasmettono una gamma più o meno ampia; prismi o reticoli che diffrangono la luce policromatica separandola nelle diverse componenti monocromatiche.

50 Intensità della radiazione Il monocromatore 2 La qualità di un monocromatore è definita da due parametri: l ampiezza della banda passante e il potere risolvente. Ampiezza della banda passante E l intervallo di lunghezze d onda del fascio che emerge dalla fenditura con un energia superiore al 50% dell energia della radiazione nominale (espressa in nm). 1 0,5 l max ½ l max Una radiazione di 580 nm (nominale) di un monocromatore con banda passante di 20 nm, comprende anche le radiazioni fra 570 nm e 590 nm, con intensità pari alla metà (0,5 l max ) di quella nominale l (nm)

51 Il monocromatore 3 Potere risolvente (o risoluzione spettrale) E la capacità del monocromatore di separare fra loro due diverse lunghezze d onda ed è definita da: R Δλ Δl dove: l = differenza fra le due lunghezze d onda; l = distanza misurata sul piano della fenditura di uscita del monocromatore (mm).

52 I filtri I filtri più comuni sono i filtri di assorbimento, sono simili a quelli usati in fotografia e vengono utilizzati nei colorimetri più economici. I colorimetri sono spettrofotometri semplificati operanti nell intervallo di lunghezza d onda da 400 a 700 nm. I filtri sono in vetro a cui sono stati aggiunti dei pigmenti inorganici o organici e non possono essere utilizzati per analisi nell UV, in quanto opachi a queste lunghezze d onda. La banda passante è solitamente elevata.

53 Il prisma ottico Il prisma ottico è in grado di scomporre la luce policromatica nelle sue componenti monocromatiche. La selezione della radiazione monocromatica viene effettuata mediante una fenditura.

54 Il reticolo di diffrazione 1 Il reticolo di diffrazione (da 3 a 10 cm) è costituito da una serie di solchi paralleli (da 200 a 3000 solchi/mm) tracciati sopra una superficie riflettente piana o concava di resina ricoperta da alluminio, oro o platino. La distanza dei solchi deve essere confrontabile con la lunghezza d onda della radiazione incidente. I reticoli a diffrazione possono agire sia per trasmissione, sia per riflessione della luce incidente a seconda che la dispersione della luce avvenga sullo stesso lato o dal lato opposto della sorgente luminosa.

55 Il reticolo di diffrazione 2 La luce con una lunghezza d'onda più grande viene deviata con un angolo più grande rispetto alla direzione incidente (angolo di diffrazione). Reticolo ottico a gradini

56 Cellette o cuvette Servono per contenere il campione e sono costruite in un materiale che sia trasparente alla regione spettrale d interesse: vetro o di polistirene (monouso) per il visibile; quarzo per l UV. Il cammino ottico può variare a seconda dell impiego (solitamente 1 cm). Inoltre, si distinguono dalla forma e dal volume (es. 1 ml, 3 ml, ecc). Solitamente le cuvette sono caratterizzate da due facce ottiche (attraverso le quali passa la radiazione) e da due facce opache che servono per maneggiarle. Le facce ottiche devono essere perfettamente pulite ed asciutte.

57 Il rivelatore 1 Il rivelatore è quella parte dello spettrofotometro che trasforma l energia radiante in un segnale elettrico proporzionale all energia che lo investe. Ne esistono di diversi tipi: 1. Celle fotovoltaiche Si basano sulle proprietà dei semiconduttori (silicio, selenio) i cui elettroni più esterni possono essere eccitati con relativa facilità. Le radiazioni UV/visibile hanno sufficiente energia per promuovere queste transizioni elettroniche che a loro volta generano una corrente elettrica (proporzionale al numero di fotoni che raggiunge il rivelatore). Hanno le seguenti caratteristiche: intervallo ristretto di lunghezze d onda rilevabili ( nm); bassa sensibilità; tendenza all affaticamento; robusti; costi contenuti.

58 Il rivelatore 2 2. Fototubi La risposta di un fototubo è basato sull effetto fotoelettrico e cioè sull emissione di elettroni dalla superficie di alcuni materiali a cui è stata applicata una differenza di potenziale, qualora colpiti da una radiazione luminosa. Un fototubo consiste in un catodo semicilindrico e un anodo a filamento inseriti in un tubo di vetro o quarzo sottovuoto. Il catodo supporta un materiale fotoemissivo (metallo alcalino) che emette elettroni quando irradiato con radiazioni di opportuna energia. I fotoelettroni emessi sono quindi attratti dall anodo. Le caratteristiche principali sono: intervallo ampio di lunghezze d onda rilevabili ( nm); migliori prestazioni rispetto alle celle fotovoltaiche; tendenza all affaticamento; costo medio. Catodo Involucro in vetro o quarzo Anodo a filamento Fascio di fotoni Elettroni 90 V DC Amplificatore e visualizzatore

59 Il rivelatore 3 3. Fotomoltiplicatori Sono una variante dei fototubi caratterizzata da una sensibilità superiore. Gli elettroni emessi dal catodo vengono accelerati da un campo elettrico acquisendo energia. Quando colpiscono una seconda superficie fotoemissiva, liberano un numero di elettroni superiore che a loro volta colpiscono gli elementi successivi in modo da amplificare il segnale. Il rapporto di amplificazione (guadagno) può arrivare fino a 10 9 e per ogni fotone incidente. Le caratteristiche principali sono: elevata sensibilità; elevato costo.

60 Strato P Il rivelatore 4 4. Fotodiodi Il silicio cristallino è un semiconduttore (conducibilità elettrica intermedia tra quella di un metallo e di un isolante) con 4 elettroni di valenza e, conseguentemente, la possibilità di formare 4 legami covalenti. A temperatura ambiente, l energia è sufficiente a liberare un elettrone dallo stato di legame (formazione carica positiva o buca). La conduzione comporta lo spostamento di elettroni e buche in direzioni opposte. La conducibilità è aumentata per aggiunta di piccole quantità di un elemento del V gruppo (Arsenico, 5 elettroni di valenza) o del III gruppo (Gallio, 3 elettroni di valenza). In questo caso si parlerà di drogaggio del semiconduttore. Giunzione P-N Strato N Elettrone in meno Elettrone in più

61 La giunzione P-N Giunzione P-N Contatto metallico Buca Elettrone Strato P Strato N Conduttore Diodo P-N Strato di deplezione Polarizzazione diretta Gli elettroni e le buche si muovono verso la giunzione dove si annullano. Il terminale negativo induce nuovi elettroni, che continuano il processo di conduzione. Il terminale positivo estrae elettroni creando nuove buche. Polarizzazione indiretta In questo caso si instaura uno strato di deplezione. La luce incidente comporta la formazione di coppie elettroni/buche che aumentano la conducibilità del diodo che viene registrata.

62 Rivelatore a serie di diodi E possibile affiancare su un singolo chip più di diodi di silicio (larghezza di un diodo ~0,02 mm), realizzando quello che prende il nome di rivelatore a serie di diodi o DAD (Diode Array Detector). In questo rivelatore, i diodi organizzati su una piastra sono posti sul piano focale del monocromatore in modo che ogni radiazione a diversa lunghezza d onda colpisca un singolo diodo. In questo modo, si ottiene la registrazione contemporanea di tutte le assorbanze alle diverse lunghezze d onda con il conseguente vantaggio di una simultanea acquisizione dello spettro. Rivelatore a serie di diodi Specchio ellittico Campione Specchio Sorgente Monocromatore a reticolo

63 Perdite di segnale dovute alla cuvetta L intensità della radiazione incidente la cuvetta subisce attenuazione a seguito di fenomeni ottici parassiti quali la riflessione e la dispersione: Per questo motivo, lo spettrofotometro deve essere azzerato, ovverosia è necessario misurare l assorbanza del un bianco in modo da sottrarne il valore quando si farà la determinazione del campione. Ovviamente le cuvette utilizzate per le due misure dovranno essere identiche. Le operazioni da eseguire per l azzeramento sono differenti a seconda che si tratti di uno spettrofotometro a: singolo raggio; doppio raggio.

64 Spettrofotometro a singolo raggio Lo spettrofotometro a singolo raggio è usato prevalentemente in analisi qualitativa e deve essere azzerato prima di ogni serie di misure per eliminare l assorbimento, anche se minimo, dovuto alla cuvetta, al solvente e alla matrice in cui l analita è disperso. Per fare ciò occorre registrare prima lo spettro del bianco e poi lo spettro del campione ed infine sottrarre al secondo il primo.

65 Spettrofotometro a doppio raggio 1 Lo spettrofotometro a doppio raggio è costituto da un sistema che invia due raggi, identici per lunghezza d onda ed intensità, uno attraverso il campione e l'altro attraverso il bianco. In questo modo, ha un confronto continuo tra l'assorbanza del campione e quella del bianco, permettendo di effettuare misure direttamente a qualsiasi l senza ripetere ogni volta la procedura di azzeramento.

66 Spettrofotometro a doppio raggio2

67 Spettrofotometro a serie di diodi Lo spettrofotometro a serie di diodi registra simultaneamente tutto lo spettro in tempi molto brevi (~ 1/10 di secondo) grazie al fatto che non ci sono parti meccaniche in movimento. Ciò rende questo strumento adatto ad essere collegato all'uscita di strumenti di separazione di miscele (es. HPLC) in modo da registrare in tempo reale l'intero spettro della miscela in uscita. Serie di fotodiodi Specchio Reticolo di diffrazione Fenditura Cella Specchio Otturatore Sorgente

68 Assorbanza Taratura della scala di assorbanza La farmacopea britannica (BP) usa una soluzione di bicromato di potassio (0,0065% p/v) in soluzione di H 2 SO 4 0,005M per calibrare la scala di assorbanza di uno spettrofotometro (i valori sono espressi in A(1%,1cm)). l nm l (nm) A(1%, 1cm) ,9 126, ,4 145, ,0 50, ,9 108,2

69 Assorbanza Taratura della scala della lunghezza d onda Solitamente lo strumento si calibra secondo le linee spettrali della lampada a scarica di deuterio. In alternativa, si può procedere con una verifica utilizzando come standard una soluzione al 5% p/v di perclorato di olmio, Ho(ClO 4 ) 3. l nm Le tolleranze stabilite dalla Farmacopea Europea sono: 241,15 1 nm 287,15 1 nm 361,50 1 nm