La struttura delle proteine

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1 Chimica delle macromolecole - Unità didattica 3: La struttura delle proteine Amminocidi, peptidi e proteine: Amminoacidi e loro proprietà. Il legame peptidico. Struttura primarie delle proteine. La Struttura secondaria delle proteine. Struttura terziaria e quaternaria delle proteine. Il ripiegamento delle proteine. Esempi di strutture proteiche, proteine fibrose e globulari. Alcuni principi sul ripiegamento delle proteine. le proteine non ripiegate Autoverifica: Conosci la struttura e la nomenclatura degli amminoacidi? sai descrivere la struttura di un dipeptide? Sapresti descriverne la geometria? Come si può descrivere la geometria di un polipeptide? Quali sono gli elementi comuni di struttura secondaria? Da cosa dipende la struttura terziaria? Come si ripiegano le proteine? Tutte le proteine hanno una struttura univoca e stabile? Come si ottengono informazioni sulla struttura delle proteine?

2 Le proteine ricoprono ruoli essenziali negli organismi Tre esempi di funzione proteica Catalisi: Praticamente tutte le reazioni chimiche degli organismi viventi sono catalizzate da proteine la alcool deidrogenasi ossida gli alcoli ad aldeidi e chetoni Trasporto: Alcune proteine trasportano varie sostanze, come l ossigeno, gli ioni, ecc. L emoglobina trasporta l ossigeno trasferimento di informazioni: Per esempio, gli ormoni. L insulina controlla la quantità di zucchero nel sangue

3 Cosa è un amminoacido Una molecola che contiene entrambi i gruppi funzionali amminico e carbossilico. Gli amminoacidi più interessanti dal punto di vista della biochimica sono gli α-amminoacidi, in cui il gruppo amminico è legato al carbonio vicinale rispetto al gruppo carbossilico. carbonio α H C α R + H 3 N COO gruppo amminico catena laterale gruppo carbossilico R COO NH 3 NH 3 modello sfere e bastoncini R COO Gli amminoacidi sono strutture tetraedriche

4 Gli amminoacidi naturali Classificati secondo la catena laterale H 3 N gruppi R non polari, alifatici COO COO COO COO COO COO COO H C H H 3 N C H C H 3 N C H H 3 N C H H 3 N C H H 3 N C H H 2 N CH 2 H CH 3 C H CH 2 CH 2 CH 2 H 2 C CH 2 CH 3 CH 3 C CH NH Glicina Alanina Prolina Valina H 3 N COO COO gruppi R polari non carichi COO COO C H H 3 N C H H 3 N C H CH 2 OH H C OH C H 2 CH 3 SH Serina Treonina H 3 N H 2 N COO COO COO C H H 3 N C H C H 2 CH 2 C C H 2 O C H 2 N O Asparagina COO H 3 N C H H 3 N C H H 3 N C H CH 2 H C C H 3 C H 2 CH CH 2 CH 2 CH 3 CH 3 CH 3 S CH 3 Leucina Isoleucina Metionina Cisteina Glutammina Fenilalanina H 3 N COO C C C C C N OH Tirosina gruppi R carichi positivamente H 2 H 2 H 2 H 2 H 3 H H 3 N COO C C C C H 2 H 2 H 2 H NH C N H 2 NH 2 Triptofano H 3 N COO C C C H H 2 NH CH N Lisina Arginina Istidina gruppi R carichi negativamente H 3 N COO C H H 3 N C H C H 2 C H 2 COO gruppi R aromatici COO C H 2 COO Aspartato Glutammato CH

5 Alcune proprietà degli amminoacidi È importante sapere le abbreviazioni

6 La ionizzazione degli amminoacidi ed in più ci sono talvolta gruppi ionizzabili in catena laterale

7 La titolazione di acido glutammico e lisina

8 Il legame peptidico Gli amminoacidi possono essere legati tra loro mediante il legame peptidico, per fare i peptidi H 3 N R 1 C H C O H OH H N R 2 CH COO H 2 O H 2 O H 3 N R 1 C H C N R 2 CH COO H O

9 Diverso comportamento acido-base In un peptide, il gruppo carbossilico e quello amminico non sono più vicinali, per cui il loro comportamento acido-base può anche differire da quello dei singoli amminoacidi costituenti. I gruppi carbossilici e amminici coinvolti nei legami peptidici non possono più ionizzare. I gruppi ionizzabili nelle catene laterali possono ionizzare (le loro proprietà possono comunque subire variazioni rispetto a quelle negli amminoacidi isolati). OH CH 3 CH 3 C H CH 2 OH H H H CH 2 H CH 3 H C H 2 COO H 3 N C C N C C N C C N C C N C H O H O H O H O H terminale amminico terminale carbossilico

10 Gli amminoacidi sono molecole chirali Tutti gli amminoacidi naturali hanno chiralità L (come la L-gliceraldeide) Esistono amminoacidi nella configurazione D, ma non sono abitualmente trovati nelle proteine

11 Lunghezza e composizione dei polipeptidi in natura I polipeptidi si trovano in natura con precise dimensioni (peso molecolare) e composizione in amminoacidi. Questa evidenza storica può essere desunta anche semplicemente idrolizzando i polipeptidi con acidi, in modo da poter analizzare la miscela di amminoacidi risultante.

12 Le proteine possono essere semplici o coniugate Le proteine semplici sono costituite solo da una o più catene polipeptidiche, mentre quelle coniugate contengono anche parti non proteiche associate, necessarie per la loro funzione. Queste parti sono chiamate gruppi prostetici e le proteine coniugate possono essere catalogate sulla base dei loro gruppi prostetici.

13 Un concetto chiave: I livelli della struttura proteica Struttura primaria Lys Lys Gly Gly Leu Val Ala His Struttura secondaria Struttura terziaria Struttura quaternaria residui amminiacidici -elica catena polipeptidica subunità assemblate Struttura primaria: la descrizione di tutti i legami covalenti (la sequenza, le reticolazioni) Struttura secondaria: l organizzazione stabile degli amminoacidi in motivi strutturali ricorrenti Struttura terziaria: il ripiegamento di un polipeptide in una particolare forma tridimensionale Struttura quaternaria: la relazione strutturale delle diverse subunità (catene polipeptidiche distinte), se presenti

14 La struttura delle proteine è stabilizzata da interazioni deboli La stabilità di una proteina è la sua tendenza a mantenere una struttura precisa (detta nativa). In termini termodinamici, la stabilità delle proteine si valuta comunemente con ΔG dell ordine di kj/mole (poco!) Una lunga catena polipeptidica può essere molto disordinata ed avere molteplici diversi modi di interagire (alta entropia). Le interazioni che permettono ad una catena disordinata (unfolded) di ripiegarsi in una struttura unica (folded) sono proprio le interazioni deboli di cui si è parlato in precedenza: Legami idrogeno Interazioni ioniche Interazioni idrofobiche Tra 2 cisteine si possono instaurare legami disolfuro. Questo legame covalente è molto più forte delle interazioni deboli, ma sono effettivamente le numerosissime interazioni deboli che rendono stabile (e scelgono) una struttura proteica. Ma una delle grandi driving forces per il ripiegamento delle proteine è la possibilità dell acqua di formare più legami idrogeno se la proteina fa legami deboli con se stessa

15 Viaggio nella struttura delle proteine: La struttura secondaria La geometria del legame peptidico Il legame peptidico non è un legame covalente singolo, ma ha una certa percentuale di doppio legame, di conseguenza non c è libera rotazione tra i gruppi attaccati tramite esso.

16 Il carattere di parziale doppio legame del legame peptidico fa sì che ogni peptide può essere pensato come un piano rigido. Ogni piano può, invece, ruotare intorno ai legami dell azoto e del carbonio carbossilico con il carbonio α per dare le conformazioni del polipeptide peptide piano del legame peptidico O φ C C C N ψ H H carbonio α H N R gruppo in catena laterale C O C piano del legame peptidico φ = 180,ψ =180

17 Angoli diedri importanti

18 La forma geometrica della catena polipeptidica dipende da tutti gli angoli Ф e ψ che si susseguono lungo la catena Ma non tutte le combinazioni sono possibili, a causa dell impedimento sterico (un gruppo che dovrebbe occupare lo spazio di un altro) C α C α raggio di contatto per atomi non legati O C α O C C α C N N C α H H R H C α raggio di contatto per atomi non legati H N H C N ON C C α φ = 60,ψ = 180 C α C α O C α un altra rotazione di 120 diφ φ = 0,ψ = 180 φ = 180,ψ = 0 muove il carbonile ingombrante il più lontano possibile dalla catena laterale H R H O C α O O C C N H N C α H R H O O C α C N H C O α C N H C α φ = 0,ψ = 0 H R

19 Ramachandran e collaboratori hanno pensato di diagrammare gli angoli φ e ψ delle proteine note e hanno verificato la presenza di zone consentite e zone non consentite del piano φψ. Tra le zone si trovano motivi strutturali caratteristici. Questo grafico, ora noto come diagramma di Ramachandran, mostra le conformazioni popolate degli angoli di torsione e le zone proibite che sono poco popolate. α-elica foglietto β parallelo tripla elica del levogira foglietto β antiparallelo collagene 180 ψ(gradi) 90 0 II 2 C α α L n = π φ(gra d i) +3 α-elica destrogira anello chiuso

20 Diagramma di Ramachandran ideale e reale (da dati strutturali) Ideal Real (a kinase) Ramachandran Plots

21 Il legame idrogeno nelle proteine Dalla discussione fatta in precedenza risulta che il gruppo carbonilico delle proteine contiene un ossigeno che può accettare un legame idrogeno, mentre all azoto ammidico è legato un idrogeno che può fungere da donatore di legame idrogeno. Questi legami idrogeno possono avvenire con molecole di acqua o, convenientemente, tra parti diverse di una proteine (l idrogeno di un azoto ammidico con un ossigeno carbonilico sulla stessa catena o su altre catene polipeptidiche). Spesso in una proteina molti legami idrogeno si formano allo stesso tempo Un legame idrogeno tra gruppi di due catene polinucleotidiche

22 L α-elica È uno dei motivi strutturali più diffusi (e prima scoperti). Grazie a legami idrogeno, gli amminoacidi si organizzano un un elica DESTROGIRA che compie un giro completo ogni 3.6 ammminoacidi (residui), equivalente a 13 atomi (si dice anche elica ). Ogni amminoacido si estende per 1.5 Å lungo la catena (ogni giro è quindi 1.5 x 3.6 = 5.4 Å, il passo dell elica). Diverse rappresentazioni dell α-elica.

23 L α-elica L elica (senza considerare le catene laterali, che puntano verso l esterno) ha un diametro di 6 Å. Il carbonile di CIASCUN peptide forma un legame idrogeno con l N-H che sta 4 residui più in alto lungo la catena. I legami idrogeno sono nella direzione dell asse dell elica, tutti i carbonili puntano verso una direzione (l alto) mentre tutti I legami N-H puntano nella direzione opposta. Gli angoli di torsione per ottenere un elica di questo tipo sono φ=-60 e ψ tra -45 e -50. Il numero di residui coinvolto in un elica può variare. La subunità β dell emoglobina

24 Un modello ideale di α-elica (poly-ala)

25 Solo n-4 legami ad idrogeno intra-α-elica si possono formare in un elica lunga n, mentre i primi 4 ossigeni carbonilici e gli ultimi 4 idrogeni ammidici alle estremità dell elica possono formarli con altri gruppi non parte dell elica (capping dell elica) Dallo studio dei poliamminoacidi (polipeptidi fatti da un tipo di amminoacido) si vede che non tutti gli amminoacidi hanno la stessa propensione a formare α-eliche: è particolarmente frequente trovare residui con gruppi R poco ingombranti (Ala) mentre si trovano a fatica gruppi carichi, la cui repulsione disordina l elica. Si vede, ad esempio, che a valori di ph in cui i gruppi carichi si scaricano (protonazione dei carbossili, deprotonazione degli ammoni) la propensione a formare la doppia elica di tali amminoacidi aumenta. La prolina deforma (o interrompe) l α-elica.

26 Le proteine fibrose e le α-eliche Le proteine possono essere distinte, sulla base della loro solubilità, in proteine fibrose, globulari e di membrana. Nelle proteine fibrose, le catene polipeptidiche sono allungate e allineate parallelamente alla direzione della fibra. Sono proteine spesso insolubili e con grande resistenza meccanica, che ricoprono ruoli strutturali in natura. L α-cheratina ad esempio (unghie, capelli ) è costituita di catene con una porzione centrale di residui in α-elica, e porzioni N- e C- terminali non a elica. α-elica Coiled coil di due α-eliche Protofilamento (copia di coiled coil) Filamento (quattro protofibrille ritorte in senso destrogiro I residui idrofobici sono nelle parti affacciate delle eliche. La torsione delle eliche serve a nascondere i tratti di residui idrofobici all acqua (facendoli interagire tra loro sulle due eliche). È una perdita di energia compensata dall esclusone dell acqua. Legami disolfuro possono tenere rigidamente insieme le catene.

27 Eliche alternative Esistono anche altri tipi di eliche nelle proteine, stabilizzate da legami idrogeno. L elica 3 10 contiene 3 residui per giro (con 10 atomi per giro, facendo legami idrogeno tra carbonili e idrogeni ammidici residui distanti 3 residui lungo la catena detto i+3). Normalmente queste eliche sono meno frequenti e/o più corte dell α-elica. Altre strutture ad elica sono il nastro 2 7 (legami idrogeno tra carbonile e azoto ammidico a i+2) e l elica π, che ha 4.4 residui per giro (e 16 atomi) per cui è anche detta elica (legami H a i+5.) Esempio di Ala 8 in elica 3 10

28 Esistono anche eliche levogire: l esempio del collagene Le catene del collagene hanno una composizione molto particolare (principalmente glicina, prolina ed idrossiprolina una modifica dell amminoacido prolina). Questi residui non si ripiegano facilmente in una delle forme più canoniche ma assumono una forma elicoidale molto più estesa dell α-elica. Le tre eliche che compongono il tropocollagene (la fibrilla base a tripla elica) hanno un passo di 2.9 Å (rispetto agli 1.5 Å dell α-elica) e 3.3 residui per giro di elica. Ogni elica ha geometria locale LEVOGIRA, mentre la superelica risultante è destrogira. Ogni 3 residui, un amminoacido di ogni elica si trova affacciato all interno della tripla elica, in una regione di grande ingombro sterico: solo la Gly (o Ala), che ha gruppo R molto poco ingombrante può occupare questa posizione (per cui in ogni catena, un amminoacido ogni 3 è Gly). Le tre catene sono legate da ponti idrogeno (l N-H delle Gly lega un C=O della Pro o Hyp adiacente) e da altri legami idrogeno. La fibra è quindi legata fortemente. Esistono diversi tipi di collagene: il TIpo I in ossa, tendini e pelle (fatto da due catene uguali ed una diversa), il Tipo II nella cartilagine ed il Tipo III nei vasi sanguigni fatti di 3 catene uguali amino acidi di lunghezza, circa 300 nm per 1.4 nm di diametro tropocollagene

29 In una fibra di collagene, tante triple eliche lunghe 300 nm sono sfasate e tenute insieme tra loro da legami deboli. Al microscopio elettronico queste hanno una apparenza a bande, risultante dalla presenza di interruzioni (buchi) tra le catene. La presenza di questi buchi sembra legata alla presenza di zuccheri legati covalentemente alle idrossiproline in questa posizione. Questi potrebbero avere utilità nel controllare l organizzazione della struttura o nel servire da punto di nucleazione per la crescita di cristalli di idrossiapatite che formano le ossa (ove questi cristalli sono, appunto immersi in una matrice di collagene.

30 I foglietti beta È un altra struttura secondaria stabile e molto diffusa delle proteine, stabilizzata dalla formazione cooperativa di un grande numero di legami idrogeno. È detta foglietto ripiegato β o struttura β. Nella struttura, i carboni α stanno nelle pieghe delle strisce, i C=O puntano in una direzione e gli N-H che li legano nella direzione opposta. Tutti i gruppi formano legami H. Antiparallel β-sheet

31 Foglietti β paralleli o antiparalleli Ogni catena del foglietto può essere pensata come un elica con passo 2 (2 residui ogni giro). Poiché il carbonio α è tetraedrico, ogni piano del legame peptidico è piegato rispetto a quello successivo (ed il foglietto risulta piegato). I legami idrogeno in questa struttura sono essenzialmente inter-strand. La catena polipeptidica è nella conformazione più estesa possibile (detta talvolta conformazione ε). Il foglietto antiparallelo è un po più esteso di quello parallelo (che è più piegato, per formare i legami H, che sono piegati). I residui sono distanti nm nel foglietto antiparallelo (0.325 nm in quello parallelo). I gruppi R si estendono perpendicolarmente rispetto al piano del foglietto.

32 In genere si trovano foglietti paralleli in strutture grandi (almeno 5 catene per foglietto) mentre foglietti antiparalleli possono anche essere costituiti di 2 catene. Ci sono proteine costituite prevalentemente di α-eliche, altre di β-sheets, mentre altre hanno presentano entrambe le strutture in una stessa catena polipeptidica. Nella seta, ad esempio, le catene polipeptidiche sono organizzate principalmente in foglietti β antiparalleli orientati nella direzione dell asse della fibra. La conformazione già molto estesa del foglietto motiva la scarsa estensibilità della fibra, che però è molto flessibile. La seta del ragno è, effettivamente, un materiale dalle proprietà meccaniche ragguardevoli: si potesse fare una corda di seta di ragno dello spessore di una matita, sarebbe sufficientemente resistente per fermare un Boeing 747 in volo! α-eliche e zone disordinate danno flessibilità La struttura nanotecnologica della seta Domini microcristallini di β-sheets danno resistenza

33 La fibroina (della seta) o la β-cheratina (piume degli uccelli) Sono proteine fatte di foglietti β antiparalleli ricchi di Gly e Ala (o Ser) alternati, in modo che da un lato del foglietto possano essere tutte le Gly e dall altra tutte le Ala/Ser. In questo modo più foglietti possono impilarsi facendo combaciare perfettamente le catene laterali. Le proprietà meccaniche delle fibre dipendono dalla struttura: fibre flessibili ma non estensibili.

34 Il β-turn Le catene polipeptidiche devono anche fare inversioni di direzione ad esempio nelle proteine globulari. I β-turn sono ripiegamenti stretti, detti anche ripiegamenti inversi. Nel β-turn, il carbonile di un residuo fa legame idrogeno con l idrogeno ammidico 3 residui oltre. Questo legame H stabilizza il ripiegamento. Certi amminoacidi, come la Pro o la Gly compaiono spesso nei β-turn e la conformazione del ripiegamento dipende dalla sua composizione amminoacidica. Gly ha la catena laterale più piccola per cui si può adattare alle richieste strutturali degli altri amminoacidi, mentre Pro ha l angolo Ф fissato dalla struttura ciclica che promuove il ripiegamento. I β-turn facilitano la formazione di foglietti β antiparalleli. O e R3 da parti opposte O e R3 dalla stessa parte: ingombro, ok se R3=H

35 Altre irregolarità nella formazione di legami idrogeno tra le catene di foglietti β antiparalleli portano a distorsioni della geometria: sono detti ripiegamenti β. Coinvolge 2 residui su una catena (che si piega e deforma il foglietto) ed uno sulla catena adiacente legata alla prima. ripiegamento classico ripiegamento G1 ripiegamento largo

36 A causa della stabilizzazione energetica conferita dai legami H, è difficile che una proteina non contenga nessun elemento di struttura (secondaria). La struttura terziaria è il ripiegamento di una singola catena polipeptidica nello spazio. Le informazioni che portano ad una struttura spaziale precisa di una proteina sono tutte contenute nella struttura primaria, anche se seguendo regole che non sono totalmente note, finora. Le eliche e i foglietti (struttura secondaria) si forma, a causa della stabilizzazione impartita dai legami H. In seguito, questi si associano in una struttura compatta: si vede che nessuna proteina è stabile come un singolo strato di polipeptide. Ci sono modi comuni per ottenere questo impacchettamento. Come conseguenza del fatto che i tratti non interessati dalla struttura secondaria sono generalmente brevi, questi congiungono direttamente le strutture secondarie, senza attorcigliamenti o annodamenti complicati. Questo limita la varietà delle strutture terziarie, che formano delle famiglie. Le proteine si ripiegano per formare le strutture più stabili possibili. La stabilità deriva dalla i) formazione del maggior numero possibile di legami H intramolecolari e ii) dalla riduzione della superficie accessibile al solvente.

37 Le proteine globulari sono le più diffuse contengono un quantitativo variabile di α-eliche e β-sheets. Ad esempio la mioglobina, una proteina coniugata di 17 kda che trasporta ossigeno nei muscoli, sono presenti 8 segmenti di α-elica di lunghezza variabile da 7 a 26 a.a. Lo spazio tra le eliche è riempito dalle catene laterali (idrofobiche) mentre quelle polari sono esposte verso il solvente, come spesso succede. È relativamente insolito che una proteina globulare contenga una proporzione così grande di α-eliche. residui idrofobici in verde

38 Una proteina globulare più tipica è la ribonucleasi A bovina (bovine ribonuclease A) una piccola proteina (14.6 kd, 129 residui) che contiene alcune eliche corte, una sezione importante di β-sheets antiparalleli e alcuni ripiegamenti β, oltre ad alcuni segmenti senza struttura definita.

39 Codice colori amminoacidi: Il nucleo di una proteina spesso contiene soprattutto parti strutturate in eliche o foglietti, poichè in questo modo i gruppi polari C=O e N-H sono neutralizzati nella formazione di legami H e possono stare nell interno idrofobico di una proteina. Nei casi in cui un elica si affaccia al solvente, ecco che presenta una faccia con residui polari o carichi ed una con residui idrofobici (elica anfipatica). Si nota che eliche completamente esposte sono polari/cariche. Struttura della calmodulina (una proteina che lega il calcio Con un elica totalmente esposta al solvente) Struttura della flavodoxina (uno scambiatore di elettroni con un elica anfipatica esposta al solvente solo su una faccia)

40 L impaccamento delle proteine Calcolando il volume delle proteine globulari e la somma dei volumi di van der Waals dei singoli amminoacidi, si può vedere che la densità di impaccamento delle proteine è in genere Questo significa che ci sono spazi vuoti (molto piccoli) nell interno della proteina che possono conferire un certo grado di flessibilità meccanica. La maggior parte di queste cavità non sono grandi a sufficienza per ospitare molecole (acqua). Stabilizzazione del β-sheet Stabilizzazione dell α-elica I coil o random coil (gomitolo statistico, in Italiano) sono quelle parti di catena polipeptidica non interessata da una struttura secondaria. Queste parti sono, spesso, ugualmente strutturate, ma in maniera più variabile, grazie alle interazioni delle loro catene laterali (i gruppi R). Queste interazioni sono molto importanti per stabilizzare le strutture proteiche (vedi modello a destra)

41 La calmodulina (di Paramecio) che lega il calcio mediante regioni a loop non strutturate Da dati ai raggi X a 1.0 Å

42 Catene disordinate e dinamica nelle proteine Esistono anche tratti di catena polipeptidica che sono disordinati (e spesso non appaiono nelle mappe di diffrazione ai raggi X). Può essere che siano tratti flessibili che si possono muovere o che assumono posizioni alternative (per questo non appaiono chiari nella struttura). Spesso catene cariche sulla superficie delle proteine non sono strutturate (molte delle catene laterali delle lisine superficiali della mioglobina, ad esempio). Le proteine sono comunque mantenute strutturate da interazioni deboli, per questo sono comunque consentiti movimenti strutturali, anche rapidi. Talvolta sono a carico di un singolo atomo, talvolta di un intera porzione della catena polipeptidica. Possono essere indotti dall agitazione termica o da meccanismi precisi di induzione. Le vibrazioni degli atomi delle proteine sono solitamente movimenti veloci e limitati (0.5 Å). I movimenti collettivi sono più lenti e coinvolgono interi tratti di catena legati covalentemente. Un esempio: il movimento dei domini flessibili di legame degli antigeni negli anticorpi. Avvengono sulle scale di secondi e dipendono anch essi dall energia termica. Transizioni conformazionali ( secondi) coinvolgono intere porzioni di catena che si sposta anche di grandi distanze (1 nm). Possono avvenire in risposta a stimoli precisi o all instaurazione o rimozione di interazioni specifiche. Sono importantissime per la catalisi enzimatica

43 Le forze che guidano il ripiegamento tridimensionale delle proteine globulari Due importanti tendenze razionalizzano il ripiegamento delle proteine globulari: -Una catena polipeptidica di L-amminoacidi ha, anche se non ha struttura secondaria, la tendenza ad attorcigliarsi nel senso destrogiro. Questo fa si che le catene tendano a disporsi preferenzialmente in una forma destrogira, ad esempio negli incroci necessari per la formazione di foglietti β paralleli. Antiparallelo rotazione destrogira naturale di una catena polipeptidica Molto diffusa Parallelo, destrogiro Parallelo, levogiro Si può formare il motivo βαβ rara -Il ripiegamento tende a nascondere i residui idrofobici all interno della proteina, per non esporli al solvente. Le proteine globulari possono essere classificate sulla base del tipo di nucleo idrofobico e di geometria dello scheletro che sono impiegate per nascondere i residui idrofobici. Il nucleo idrofobico è quella regione in cui si raccolgono per interagire tra loro e non con il solvente.

44 Si possono razionalizzare i ripiegamenti delle proteine globulari come strati di scheletro ripiegato, in modo che tra gli strati si possano nascondere i residui idrofobici. Più di metà delle proteine globulari note ha due strati, circa un terzo ne ha tre, poche ne hanno quattro o cinque. A volte non è facile definire gli strati o contarli. Strato 1 Strato 2 I residui idrofobici sono sepolti tra gli strati (a) Citocromo c (b) Fosfoglicerato kinasi (Dominio 2) (c) Fosforilasi (Dominio 2) Parti gialle=nuclei idrofobici

45 Gli strati possono anche essere geometricamente curvi, come per la trioso fosfato isomerasi, che ha uno strato centrale di β-sheet parallelo ed uno strato esterno di α-eliche. (d) Trioso fosfato isomerasi Oltre che per gli strati, le proteine sono classificabili sulla base della struttura secondaria che contengono (α-eliche antiparall, β-sheet paralleli o misti, β-sheet antiparall. proteine ricche di metalli o disolfuri). Le similitudini della struttura terziaria non devono ingannare su similitudini di funzione: l omologia funzionale è spesso dipendente da similitudini strutturali su una scala molto più piccola che l intera proteina.

46 Proteine di eliche antiparallele. È il modo più semplice per impaccare α-eliche. Le proteine quindi consistono di mazzetti (bundle) di eliche, spesso con una torsione levogira. La maggior parte di queste proteine è fatta di 4 eliche. Le globine sono un gruppo importante di proteine di α-eliche: sono costituite da due strati di eliche, uno perpendicolare all altro e la catena polipeptidica che passa continuamente da uno strato all altro. la proteina del virus del mosaico del tabacco la mioglobina

47 Proteine di β-sheets paralleli o misti Si nota che i β-sheets paralleli distribuiscono i residui idrofobici su entrambi i lati del piano. Di conseguenza, nessuno dei lati del foglietto può essere esposto al solvente: i foglietti paralleli sono quindi nel nucleo delle proteine che li contengono. Una struttura importante è il β-barrel (barile β), in cui 8 catene formano un foglietto cilindrico affiancato da eliche a loro antiparallele che formano un cilindro esterno di eliche parallele tra loro. Questa è la struttura della trioso fosfato isomerasi, già vista. entrambi i cilindri hanno una torsione destrogira

48 Un altro motivo strutturale comune basato su foglietti paralleli o misti è un muro interno di foglietto β attorcigliato protetto dal solvente da entrambi le parti da eliche. Queste strutture possono essere pensate come fatte di 3 strati di scheletro e quindi hanno 2 nuclei idrofobici. Un esempio è l esokinasi. esokinasi

49 Proteine con foglietti antiparalleli I foglietti antiparalleli dispongono, di solito, i residui idrofobici su un solo lato, per cui possono avere un lato esposto al solvente. La struttura minimale è a 2 strati, per proteggere il nucleo idrofobico. A volte la geometria è a barile (i barili contengono in genere un numero pari di catene e possono essere o tutti paralleli o antiparalleli). A volte le catene sono interbloccate con topologie complicate che ricordano le Greche. inibitore della tripsina dalla soia

50 Le proteine contenenti metalli o ricche in ponti disolfuro Queste sono proteine generalmente piccole (100 residui) la cui struttura è fortemente influenzata dalla presenza di metalli o legami disolfuro. La struttura di queste proteine ricche in ponti disolfuro diventa instabile se i ponti disolfuro sono rotti. Alcune hanno ripiegamenti simili alle proteine viste finora. L insulina è un esempio di polipeptide ricco in disolfuri La ferrodoxina è ricca in ferro (come fa presumere il nome stesso) Insulina ferrodoxina

51 I coiled-coil Il motivo strutturale dell α-cheratina è detto coiled-coil. È un motivo presente anche in altri tipi di proteine non costituite esclusivamente di eliche. In un mazzo di eliche ce ne possono essere 2, 3 o 4 e possono essere parallele o antiparallele. Un esempio di coiled-coil molto esteso è la coda della miosina, proteina motore che si muove sulle fibre di actina

52 Elementi di struttura sovrasecondaria Sono anche chiamati motivi strutturali, o ripiegamenti (folds). Si tratta di raggruppamenti caratteristici di strutture secondarie trovate nelle proteine. Alcuni grandi motivi strutturali possono comprendere l intera proteina, altri sono molto semplici. Ad esempio, il coiled-coil si può intendere con motivo strutturale. A volte si possono individuare DOMINI di ripiegamento in lunghi polipeptidi: in questo caso, tratti diversi dello stesso polipeptide si ripiegano indipendentemente (e uno può essere ripiegato indipendentemente dagli altri). A volte anche la struttura terziaria è reminiscente della divisione in domini, e la proteina appare costituita di sezioni globulari collegate da filamenti non strutturati. Più comunemente, gli estesi contatti tra i domini non permettono di vedere chiaramente tale suddivisione. Alcuni moduli della titina

53 Esempi di motivi strutturali: Due semplici motivi strutturali che possono nascondere residui idrofobici, creando due strati nella proteina Già visto in precedenza, eliche (destrogire e, raramente, levogire) per fare foglietti β paralleli La tendenza dei β-strand di attorcigliarsi crea strutture come i β-barrel o i foglietti β attorcigliati. I motivi sono la base per una classificazione dei ripiegamenti delle proteine

54 Piruvato chinasi: una complessa struttura in cui si nota un motivo β-α-β

55 Altre consuetudini Quando entrambi presenti in una proteina, α-eliche e β-sheet fanno di solito parte di due strati strutturali distinti, perché non riescono a formare facilmente legami H tra loro. Più spesso che no, elementi vicini nella struttura primaria restano in prossimità anche in quella terziaria, ma non è una regola. Non si possono formare incroci o nodi nel passare da un elemento di struttura secondaria all altro. α-emolisina di Staphilococcus aureus: una proteina con un β- barrel che protrude e che si inserisce nella membrana cellulare creando un buco che porta alla lisi della cellula.

56 Helix- turn- helix

57 Beta sandwiches

58 4 α bundle

59 Le proteine di membrana si sono adattate ad un ambiente idrofobico La struttura della batteriorodpsina, una proteina pompa che sposta protoni attraverso la membrana (verso fuori)

60 La struttura quaternaria non lineare tridimensionale formata da legami idrogeno, legami covalenti (disolfuri), impaccamento idrofobico ed esposizione di superfici idrofiliche le strutture favorevoli sono frequenti e sono state catalogate

61 Esempi di altre strutture quaternarie Tetramero Esamero Filamento SSB, permette il legame coordinato al DNA DNA elicasi, legame coordinato al DNA e idrolisi di ATP ricombinasi, per il completo ricoprimento di una molecola estesa

62 In molte proteine, la struttura quaternaria si presenta simmetrica

63 Come nell emoglobina, la struttura quaternaria consente un livello aggiuntivo di funzionalità (o di complessità) il legame con l O 2 ha effetti strutturali su tutta la proteina, cambiando la propensione stessa di legare l O 2.

64 Generalmente, solo una piccola frazione della superficie proteica è conservata Invariante (il residuo è sempre lo stesso, es: Asp) Conservato (il residuo è generalmente simile, es: carico neg.) non conservato (diversi residui in diverse specie)

65 Le chaperonine e l assistenza al ripiegamento Le chaperonine sono grandi complessi di proteine fatti a doppio anello il cui ruolo in vivo è assistere al ripiegamento delle proteine Le Chaperonine cercano di controbilanciare il ripiegamento delle proteine in forme non-native e l aggregazione delle proteine - Durante il folding de novo - Nelle condizioni di stress (es.: ad alta temperatura sono a volte detti heat shock proteins ) N =ripiegamento nativo

66 Cause dell aggregazione Interazioni idrofobiche Legami idrogeno intercatene Affollamento intracellulare U = catena non ripiegata (unfolded) N = Proteina ripiegata in modo nativo I = intermedio parzialmente ripiegato

67 Il meccanismo di assistenza al ripiegamento delle chaperonine 1- Legano i polipeptidi non ripiegati in modo nativo attraverso interazioni idrofobiche 2- Permettono ai polipeptidi di ripiegarsi in un ambiente idrofobico isolato 1. Il polipeptide non-nativo si lega all anello trans (lontano a GroES) di GroEL 2. 7ATP (equatoriali) e GroES si legano all anello cis di GroEL 3. Dissociazione dei 7ADP e di GroES dall anello cis di GroEL 4. Il dominio apicale di GroEL ruota e cambia conformazione per raddoppiare il volume della sua cavità e mutare le proprietà superficiali da idrofobiche a idrofiliche

68 CHAPERONI CITOSOLICI di Coli e possibile utilizzo contro corpi di inclusione Si possono usare chaperoni come - disaggregasi che disaggregano il corpo es ClpB - chaperoni folding es DnaK e GroEL che intervengono anche nel folding de novo - chaperoni holding che prevengono l aggregazione oppure coaggregano con gli aggregati per richiamare le disaggregasi Oltre ai chaperoni è possibile usare proteasi per disaggregare i corpi di inclusione Schlieker et al.

69 incontra DnaK 5-18% TF Polipeptide nascente Intermedi del folding Hsp60 (GroEL), Hsp70 (DnaK) e Hsp90 (HtpG), assistendo il folding, possono aiutarlo mandandolo avanti e prevenendo così l aggregazione. Però queste proteine non sono in grado direttamente di soccorrere grossi aggregati. Incotra GroEL aggregati Proteina Nativa 10-15%

70 Problematica con alto riscontro nell espressione di proteine ricombinanti eterologhe La sovraespressione porta ad un livello di aggregazione proteica elevato: CORPI D INCLUSIONE Sempre maggiore è l interesse riscontrato dagli studi che descrivono l eterogeneità della struttura dei corpi d inclusione e le interazioni dinamiche delle proteine precipitate sotto questa forma con la frazione solubile.

71 Come si determina sperimentalmente la struttura delle proteine?

72

73 Cristallografia ai raggi X cristallizzare una proteina bombardarla con i raggi X e registrare il disegno di diffrazione determinare la mappa di densità elettronica dallo scattering e dalla fase mediante trasformata di Fourier: Utilizzare la densità elettronica e le conoscenze biochimiche sulla proteina per raffinare le informazioni ed ottenere un modello "All crystallographic models are not equal.... The brightly colored stereo views of a protein model, which are in fact more akin to cartoons than to molecules, endow the model with a concreteness that exceeds the intentions of the thoughtful crystallographer. It is impossible for the crystallographer, with vivid recall of the massive labor that produced the model, to forget its shortcomings. It is all too easy for users of the model to be unaware of them. It is also all too easy for the user to be unaware that, through temperature factors, occupancies, undetected parts of the protein, and unexplained density, crystallography reveals more than a single molecular model shows. - Rhodes, Crystallography Made Crystal Clear p. 183.

74 Cenni storici 1864 Viene cristallizzata l emoglobina Röngten osserva che quando i raggi catodici (elettroni) colpivano un bersaglio metallico si originava una nuova forma di radiazione penetrante, che egli chiamo raggi X Facendo attraversare dai raggi X un cristallo di solfuro di zinco Von Laue ottiene i primi diffrattogrammi. W.L. Bragg e W.H. Bragg propongono una correlazione semplice tra la figura di diffrazione ottenuta con i raggi X e la disposizione degli atomi nel cristallo che ha generato la figura (legge di Bragg). Anni 30 Bernal, Crowfoot, Bragg, ottengono i primi diffrattogrammi da cristalli di proteine (insulina, emoglobina, mioglobina) Atsbury ottiene il primo diffrattogramma ai raggi X del DNA Pauling e Corey propongono la struttura di α-elica e foglietto β in base a considerazioni teoriche Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica del DNA sulla base delle analisi diffrattometriche ai raggi X di Franklin e Wilkins Perutz e coll. elaborano i metodi basati sull impiego dei metalli pesanti per risolvere il problema delle fasi nella cristallografia ai raggi X Kendrew descrive la struttura della mioglobina a una risoluzione di 2 Å. Perutz propone la struttura della emoglobina, piu grande, ad una risoluzione inferiore. Anni 80 Hartmut Michel risolve la struttura (3 Å) della prima proteina di membrana (centro di reazione fotosintetico). Anni 90 Diviene possibile la cristallografia risolta nel tempo Vengono risolte le strutture (3 Å) delle subunita L e S del ribosoma (circa 1.5 e 1 MD rispettivamente).

75 Cristallografia ai raggi X Servono grandi quantità di proteine cristallizzate (le proteine devono cristallizzare) È difficile cristallizzare le proteine Molto difficile per proteine idrofobiche (transmembrana) Più accurato dell NMR Costoso: $100,000/proteina Accesso a radiazione adatta Tempo di calcolo per risolvere la struttura

76 Cristallografia a raggi X Ottenere cristalli della proteina mm Le singole molecole sono ordinate in modo periodico, ripetitivo. La struttura è determinata dai dati di diffrazione. problema fondamentale è che l intensità dello scattering dei raggi X risultante dall interazione con una singola molecola è troppo debole per dare informazioni utilizzabili. Con un cristallo l ampiezza dello scattering viene amplificata di un fattore pari al numero di cellule unitarie che formano il cristallo esaminato.

77 Condizioni per la cristallizzazione di proteine Proteina pura > 97% e in grande quantita. Lenta precipitazione da una soluzione sovrasatura metodo hanging drop. Giocano un ruolo molti parametri critici: ph, temperatura, concentrazione della proteina, natura del solvente e del precipitante, ligandi della proteina, etc. Alcuni cristalli non diffrangono affatto o troppo poco (disordine intrinseco), altri sono troppo piccoli o troppo fragili.

78 Le proteine nei cristalli tendono a impaccarsi lasciando fra loro larghi spazi Impaccamento della glicolato ossidasi Struttura nativa Diffusione di ligandi, metalli pesanti

79 Diffrazione a raggi X

80 Risoluzione

81 Spettroscopia NMR I protoni risuonano ad una frequenza che dipende dal loro intorno chimico. Questo può essere impiegato per caratterizzare una struttura. Non ha bisogno di cristalli, la proteina può essere in soluzione (anche se in genere molto concentrata). A risoluzione più bassa della cristallografia ai raggi X.

82 Spettroscopia NMR determinare delle costrizioni (distanze, angoli) Proteine in soluzione acquosa, mobili, vibrano e si mescolano grazie all agitazione termica l NMR rileva i chemical shift dei nuclei atomici con spin non nullo a causa delle interazioni che hanno con l ambiente circostante determina le distanze tra coppie di atomi impiega, poi, conoscenze chimiche e biochimiche sulla proteina per determinare famiglie di modelli. da usare per determinare una struttura

83 Campo magnetico NMR NOE (Nuclear Overhauser Effect)

84 Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Proteine in soluzione Limite di dimensione ~ 40 kda Proteine stabili a lungo Marcatura con 15 N, 13 C, 2 H. Strumentazione molto costosa Tempo per assegnare le risonanze

85 Pro e contro X-ray NMR Richiede cristalli, problematico Non ha limiti (teorici) di grandezza Piú preciso Risoluzione Struttura può essere deformata dai cristalli, rigida Una soluzione Possibile in soluzione, più semplice Limitato a proteine fino a circa 300 residui Meno preciso Numero di vincoli Struttura nativa in soluzione, flessibile Molti modelli

86 X-ray NMR

87 Fluorescence Resonance Energy Transfer è spesso descritto come righello molecolare segmenti di una proteina sono etichettati con fluorofori il trasferimento di energia avviene quando donatore ed accettore interagiscono, questo dipende dalla distanza e decresce come 1/d 6 dove d è la separazione tra donatore ed accettore donatore ed accettore devono essere distanti meno di 50 Å, l intensità di emissione dell accettore è sensibile alle variazioni di distanza si possono individuare coppie di punti di catena che sono, ad esempio, separati quando la catena non è ripiegata e prossimi quando la catena è ripiegata.

88 Protein DataBank (PDB) X ray: 58,000 NMR: 7,400

89 Utili portali di ricerca per strutture

90 Il problema del ripiegamento delle proteine cioè il problema di capirci qualcosa

91 Perché il ripiegamento delle proteine è un problema? Chiunque abbia faticato per ripiegare una carta stradale dovrebbe portare particolare rispetto alle proteine, le quali si ripiegano da sole ed in pratica si mettono anche nel cassetto - (Brian Hayes, da un articolo su American Scientist, 1998)

92 Come si ripiegano le proteine? Le proteine si ripiegano spontaneamente nella loro struttura nativa, impiegando un tempo biologicamente breve (dell ordine dei secondi) la struttura nativa è lo stato fondamentale del sistema, La differenza energetica con il primo stato eccitato è >> kt il ripiegamento di una proteina è una reazione chimica, il meccanismo è tale che lo stato di transizione abbia bassa energia libera le proteine si ripiegano o si denaturano come risposta ad uno stimolo esterno e per svolgere funzioni biologiche

93 Perché il ripiegamento delle proteine è (ancora) un problema irrisolto? La struttura tridimensionale proteica NON È GERARCHICA, ma contestuale e la nucleazione ha luogo contemporaneamente: le strutture 2 e 3 crescono insieme

94 Le proteine non hanno un problema di ripiegamento ce l hanno i ricercatori Cartoons by Larry Gonick In principio, le leggi della fisica determinano per intero come una catena lineare di amminoacidi si ripieghi in una struttura tridimensionale complessa dotata di proprietà biochimiche utili. In pratica, predire la struttura partendo dalla sequenza è un grande problema irrisolto.

95 Perché il ripiegamento è un problema? è molto difficile caratterizzare il processo di ripiegamento!

96 Perché il ripiegamento delle proteine è (ancora) un problema irrisolto? STATO FONDAMENTALE STATO NATIVO

97 Paradosso di Levinthal (1968): Se la ricerca è casuale: Ω = 5 ~ 10 τ = Ω ~ 10 fold k sec 2CI2 N= 83 residui ~ 5 stati ogni residuo τ fold >> età dell universo!! Ricerca casuale nello spazio conformazionale Energia coordinata(e) di reazione panorama di energia conformazionale simile ad un campo da golf

98 Teoria della superficie di energia potenziale La proteina cerca CONFORMAZIONI ad ENERGIA PIÙ BASSA Cartoons by Larry Gonick Superficie di energia potenziale a campo da golf superficie di energia potenziale altamente corrugata troppo lento! troppo lento! Energia superficie di energia potenziale ad imbuto OK! coordinata(e) di reazione

99 Studi teorici hanno mostrato come superfici di energia potenziale fatte ad imbuto con un minimo unico possano guidare efficientemente una proteina verso strutture native grazie alla progressiva organizzazione delle strutture parzialmente ripiegate che si formano lungo il cammino. L imbuto è corrugato da impedimenti locali (impedimenti sterici, contatti non nativi, ecc.) che producono barriere di potenziale alcune volte maggiori delle fluttuazioni termiche. Durante il ripiegamento, questa corrugazione dell imbuto comanda la cinetica del processo intrappolando le molecole che si stanno ripiegando. Si ipotizza che i processi di ripiegamento/denaturazione possano avvenire su questa complessa superficie di energia potenziale, caratterizzata da numerosi intermedi.

100 Cartoons by Larry Gonick

101 Una proteina è guidata verso la sua struttura nativa da superfici di energia potenziale con una struttura globalmente ad imbuto Le molecole individuali seguono cammini differenti. (J. M. Fernandez, H. Li, Science 2004, 303, ) Esaminare gli equilibri conformazionali e le cinetiche di ripiegamento al livello della singola molecola, sta divenendo una necessità ed al tempo stesso una grande sfida in biologia sperimentale. (Onuchic & Wolynes Current Opinion in Structural Biology 2004, 14:70 75)

102 Examining protein conformational equilibrium and folding kinetics at a single-molecule level Within such a complex funneled multidimensional energy landscape, different protein molecules, in spite of having the same sequence, can follow markedly different trajectories during their folding and also in their thermal fluctuations after having reached their native structure. In fact, one molecule can be driven into one funnel trap, while a different molecule can visit another one, and so on. Through such a multiplicity of conformational paths, peculiar structures could be assumed or particular motions could be made even by only a few molecules of the ensemble. Those structures might be selected or those motions might be rectified to make a specific biological function possible, and the same function would be inaccessible for all the other molecules at that same moment. It has been theoretically recognized that the structure of a protein required for a biological function might also be the result of catastrophic events, such as the cracking or unfolding of part of the protein due to transient strain energies. On this basis, examining protein conformational equilibrium and folding kinetics at a single-molecule level has become a necessity, and it is currently considered a great challenge in experimental biology.

103 Misure di singola molecola Discrasia: pensiamo nei termini di una molecola singola, ma facciamo solitamente esperimenti campionando numeri di Avogadro di molecole ed estraendo quantità mediate Superiamo le limitazioni delle medie con misure di molecole singole, poi è possibile effettuare medie nel tempo medie nelle popolazioni conformazionali

104 Gli esperimenti di denaturazione indotta dalla forza normalmente esplorano traiettorie differenti sulla superficie di energia potenziale rispetto agli esperimenti di denaturazione termica o con agenti chimici. denaturazione meccanica denaturazione termica (X. Zhuang & M. Rief, 2003) Gli esperimenti di denaturazione meccanica sono particolarmente rilevanti per le proteine che sono soggette a forze di trazione in vivo.

105 denaturazione meccanica della titina mediante microscopia a forza atomica: Rief et al. Science 1997, 276, La curva di forza ha un profilo a denti di sega in cui ogni picco corrisponde allo svolgimento di un dominio individuale I singoli moduli si svolgono sequenzialmente. mediante optical tweezers Kellemayer et al. Science 1997, 276, ; Tskhovrebova et al., Nature 1997, 387,

106 Denaturazione e rinaturazione di una proteina in velocity clamp Miosina II coiled coil: si comporta come una vera molla entropica: può rilassare molto velocemente poiché la sua struttura è topologicamente semplice Titina: la denaturazione e la rinaturazione procedono su due traiettorie diverse. Il tempo richiesto per campionare tutte le possibili interazioni e scegliere i minimi di energia ottimali diventa sempre più lungo (fig.from X. Zhuang, M. Rief Curr. Op. Str. Biol: 2003) Il processo è dominato da effetti cinetici quando la velocità di applicazione della forza è più alta del tempo di rilassamento molecolare più lento.

107 Panorama (superficie) di energia libera

108 Simulazioni di Dinamica Molecolare ( R) = Elegame + Eangolo + Ediedrica + Eelettrostatica EvdW E + da:

109 The Structural Prediction Problem Given a protein sequence, compute its structure. Possible in principle. Astronomical, highly under-constrained search space. Biophysics complex and incomplete. Next to impossible in practice.

110 Secondary Structure Prediction Much simpler to predict a small set of classes than to predict 3-D coordinates of atoms. Amino acids have different propensities for alpha helices, turns and beta sheets. Homology can also be used since fold is more conserved than sequence.

111 A Major Challenge of Bio-informatics The challenge: Understand the relationship between amino acid sequence and the 3D structure of proteins; Predict 3D structure from sequence. Unfortunately, the relationship between sequence and structure is very complicated. Current tools perform this task poorly. Best performance (so far) can be achieved using sequence homology to a known 3D structure experimentally determined (by X-ray crystallography or NMR).

112 How do Proteins Acquire Correct Conformation? The primary amino acid sequence is crucial in determining its final structure. In some cases, additional interactions may be required before a protein can attain its final conformation (for example, cofactors, one or more subunits). Proteins can change their shape and function depending on the environmental conditions in which they are found. The primary amino acid sequence does not change.

113 How is the 3D structure determined? 1. Experimental methods (Best approach): X-rays crystallography - stable fold, good quality crystals. NMR - stable fold, not suitable for large molecule. 2. In-silico methods (partial solutions - based on similarity): Sequence or profile alignment - uses similar sequences, limited use of 3D information. Threading - needs 3D structure, combinatorial complexity. Ab-initio structure prediction - not always successful.

114 Predicting Protein Structure Principle: Look for the structure with minimum free energy. Rule of thumb: Hydrophobic a.a. wants to stay inside (conserved),hydrophilic a.a. wants to be outside (less conserved, assuming water as the universal solvent in cells). The main driving force for folding is to pack hydrophobic side-chains into the interior of the molecule, thus creating a hydrophobic core. Factors other than free energy: shape, size, polarity, strength of interactions, etc.