Gli eritroblasti: ieri un problema analitico

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1 Gli eritroblasti: performance strumentali e significato clinico V. Miconi Laboratorio di Patologia Clinica AULSS 5 Ovest Vicentino Gli eritroblasti: ieri un problema analitico Cornbleet J. Spurious results from automated cell counters. Lab Med 1983; 14(8): Culp NB, Wallace J. Correcting the NE-Series WBC count for nucleated RBCs. Sysmex J Int. 1991; 1:

2 Gli eritroblasti oggi Viable WBCs Non Viable WBCs NRBCs Increasing Fluorescence 2

3 me Volum NRBC Scatter Laser 3

4 Più piccoli dei linfociti Più grandi della maggioranza delle piastrine Più densi dei nuclei dei mononucleati 4

5 Eritroblasti e automazione: il presente I principi di misura Abbott Cell Dyn Sapphire ABX Pentra 120 DX Sysmex XE 2100 Siemens Advia 2120 Beckman Coulter LH 7xx Eritroblasti e automazione: il presente Le caratteristiche operative Abbott Cell Dyn Sapphire Beckman Coulter LH 7xx Siemens Advia 2120 ABX Pentra 120 DX Sysmex XE

6 Dati forniti in presenza di NRBC Abbott Cell Dyn Sapphire Horiba Abx Pentra 120 DX Siemens Advia 2120 Coulter LH 750 Sysmex XE 2100 WBC totali Valori assoluti popolazioni leucocitarie NRBC # Determinazione diretta cluster Determinazione diretta cluster Determinazione diretta cluster (canale WBC) Correzione Correzione Correzione Correzione Determinazione diretta cluster Conteggio canale dedicato Correzione Correzione Correzione Confronto crociato tra i nuclei dei PMN nel canale Baso e analisi del cluster individuato nella regione unstained del canale Perox Determinazione cluster rispetto alle 5 popolazioni leucocitarie; confronto tra canale formula e canale WBC NRBC % Fornito Fornito Fornito Fornito Fornito WBC Conteggio NRBC Su tutti i campioni Ad attivazione del canale specifico Su tutti i campioni Su tutti i campioni Conteggio canale dedicato Ad attivazione del canale specifico Reattivi Propidio Ioduro, componente del reattivo per i WBC Arancio di Tiazolo associato al colorante sudanofilo per leucociti Non reattivi dedicati Non reattivi dedicati Colorante polimetinico dedicato Problemi tecnici risolti Meno WBC corretti Meno Formula corretta Correzione WBC e Formula 6

7 .un esempio neonati pretermine Problemi analitici aperti Allarme poco specifico: dipende dalla eterogeneità dei volumi e dalla diversa sensibilità ai lisanti sono inclusi in maniera variabile: nel noise (insieme agli aggregati piastrinici, ai GR non completamente lisati, ai parassiti malarici ) nella popolazione linfocitaria (pseudolinfocitosi e pseudo leucocitosi, soprattutto se displastici o in fase di matrurazione più precoce) (Culp NB, Wallace J. Correcting the NE-Series WBC count for nucleated RBCs. Sysmex J Int. 1991; 1:62-65) Scarsa sensibilità per piccole quantità 7

8 Gli Eritroblasti nel sangue periferico: Trascorso il periodo neonatale, la presenza di NRBC nel sangue periferico è sempre indicativa di una condizione patologica! Kim YR, et al. Clin Lab Haematol 1998 Feb; 20(1):21-9 Anche un singolo NRBC sul vetrino è anormale, indica infatti un serio stress midollare, dall anemia emolitica alla neoplasia! Ed Uthman, MD Blood Cells and the CBC Published La quantificazione degli NRBC presenti nel sangue periferico è fondamentale per la diagnosi e la prognosi di molte malattie ematologiche! Wang F, et al. Counting and staging of peripheral and cord blood NRBC by flow cytometry. htm 8

9 Utilità clinica del riconoscimento degli eritroblasti: Monitoraggio intensa stimolazione eritropoietica Conteggi elevati nel sangue possono indicare la presenza di patologie, quali: anemie emolitiche, TTP talassemia o anemia falciforme recupero post-aplasia Screening per disordini emopoietici gravi : anemie mieloftisica nei midolli metastatizzati anemia perniciosa fibrosi midollare emopoiesi extra-midollare Disordini non ematologici: Conteggi elevati nei gravi stati ipossici: Patologie polmonari Patologie cardiache Farmaci (fattori di crescita, corticosteroidi) Utilità clinica del riconoscimento degli eritroblasti: Monitoraggio pazienti in gravidanza: Conteggi elevati nel sangue materno possono indicare la presenza di situazioni patologiche es. pre-eclampsia Screening dei campioni neonatali: un incremento dei conteggi nei neonati può indicare la presenza di: Ipossia Fetale Asfissia Fetale Anemia del prematuro Anemia da incompatibilità ABO (MEN) Valutazione acidosi metabolica Possibile indice utilizzabile nella valutazione del danno neurologico perinatale. 9

10 Il conteggio degli eritroblasti nella terapia trasfusionale nel morbo di Cooley Nel morbo di Cooley il marcato sbilanciamento nella sintesi della catena globinica, con eccesso di catene alfa e loro precipitazione all interno dei precursori eritroidi ha come risultato la formazione di grandi corpi inclusi, responsabili della distruzione intramidollare dei precursori stessi, dando origine così ad eritropoiesi inefficace, caratteristica di tutte le sindromi beta-talassemiche ed, in particolare, il morbo di Cooley. L anemia presente è causata sostanzialmente da tre distinti meccanismi 1) l eritropoiesi inefficace 2) l emolisi dovuta alla distruzione delle emazie che contengono catene alfa 3) microcitosi ed ipocromia dovute a ridotta sintesi dell emoglobina Il conteggio degli eritroblasti nella terapia trasfusionale nel morbo di Cooley La terapia deve mirare a: prevenire l'anemia mantenere livelli di emoglobina sufficienti a sopprimere l'eritropoiesi endogena (altamente inefficace) M.T. Fosburg, D.G. Nathan. Treatment of Cooley s Anemia. Blood 1990; Vol. 76 N 3: S. Piomelli et al. Ann. NY Acad. Sci. 1969; Vol165:427 10

11 La figura mostra un paziente affetto da morbo di Cooley in cui si evidenzia chiaramente una diminuzione del numero di eritroblasti circolanti al crescere dei valori di emoglobina. Hb 6,4 7,8 8,4 ret NRBC Eritroblasti: suggerimenti sullo stadio maturativo Eritroblasti Policromatofili Eritroblasti Ortocromatici Sysmex XE

12 Eritroblasti e Neonati Range x10 9 /l (2) La conta NRBC è inversamente proporzionale al indice di Apgar al 1 e 5 minuto ed al ph su sangue cordonale L incremento del numero degi eritroblasti viene associato alla ipossia intrauterina prematurità, isoimmunizzazione, cardiopatie congenite, travaglio prolungato, asfissia o danno neurologico neonatale, feti nati morti, diabete gestazionale e preeclampsia, sindrome da meconio B. Bain,

13 Persistent nucleated red blood cells in peripheral blood is a poor prognostic factor in patients undergoing stem cell transplantation Otsubo H, Kaito K, Asai O, Usui N, Kobayashi M, Hoshi Y. Clin Lab Haematol. 2005; 27(4): The survival rates of patients with a NRBC count >200x10^6/L were significantly lower than those of patients whose counts were <100x10^6. These data indicated that persistent NRBC in peripheral blood is a poor prognostic factor and suggested that monitoring NRBC after Stem Cells Transplantation might provide useful clinical information. Critical Care 2007, 11:R62 (doi: /cc5932) This article is online at: 13

14 NRBC e prognosi A. Stachon et al J Lab Clin Med 2002; 140(6): The detection of erythroblasts in the peripheral blood of burn patients is highly predictive of death. Detection of erythroblasts in burn patients is of high prognostic power with regard to in-hospital mortality, providing physicians with a strong prognostic method with which to identify seriously threatened patients. It seems attractive to think about an incorporation of erythroblasts into further refinements of burn scores. (Plast. Reconstr. Surg. 115: 120, 2005.) 14

15 Sensibilità allarme H 20 ANRBC allarme NRBC (n=21) ADVIA CD4000 LH-750 PENTRA XE-2100 falsi - veri + senza allarme NRBC (n=313) GdS-E SIMeL ADVIA CD4000 LH-750 PENTRA XE-2100 falsi + veri - Allarme Eritroblasti Abbott CD4000 Abx Pentra 120 Bayer Advia 120 Coulter LH750 Sysmex XE2100 VP VN FP FN Sensibilità Specificità VPP VPN GdSE- SIMeL

16 Casistica sperimentazione Modena campioni patologici Selezionati circa 200 campioni con patologie ad eziologia diversa e a carico di tutte tt le serie circolanti Riferimento microscopico su base H20A NRBC Abbott Sa apphire y = 0.63x , r 2 =

17 ra 120 DX nrbc ABX pentr y = 0.36x , r quadro = nrbc Coulter LH y = 0.22x , r quadro =

18 nrbc Siemens Ad dvia y = 0.20x , r quadro = nrbc Sysmex XE y = 0.88x , r quadro =

19 ifferenza NRBC Abbott-m d Ref <=1 Sens 50.0% Spec 95.6% Conc 85.2% nrbc Abbott <=1 nrbc Abbott > Ref > Sens 30.0% Spec 98.5% Conc 82.9% differenza NRBC ABX-m Ref <=1 Ref >1 Nrbc ABX <=1 Nrbc ABX >

20 - differenza NRBC Coulter Sens 55.0% Spec 81.8% Conc 81.8% Ref <=1 Ref >1 Nrbc Coulter <=1 Nrbc Coulter > differenza NRBC Siemen ns Ref <=1 Ref >1 Sens 65.0% Spec 66.2% Conc 65.9% Nrbc Sieme Nrbc Sieme ns ns <=1 >

21 differenza NRBC Sysm mex Ref <=1 Ref >1 Nrbc Sysmex <=1 Nrbc Sysme x > Sens 90.0% Spec 95.6% Conc 94.3% differenza NRBC Abbott

22 -20 differenza NRBC ABX-m differenza NRBC Coulter r

23 -20 d ifferenza NRBC Siemens s differenza NRBC Sysmex x

24 Conteggio Eritroblasti Abbott CD Sapphire Abx Pentra 120 DX Siemens Advia 2120 Coulter LH 7xx Sysmex XE2100 PN 2002 flags Sensibilità Specificità MO 2008 Sensibilità 50,0 30,0 65,0 55,0 90,0 Specificità 95,6 98,5 66,2 81,8 95,6 ERITROBLASTI: CONCLUSIONI 1 Le moderne strumentazioni forniscono conteggi WBC precisi, lineari, esenti da interferenze e carryover anche in presenza di valori elevati di NRBC. Dati precisi ed accurati sono disponibili in tempi rapidi e con minor impiego di risorse (minor numero di revisioni microscopiche). i Il conteggio NRBC dà prestazioni migliori dei flag (2008 vs 2002) 24

25 ERITROBLASTI: CONCLUSIONI 2 Risulta aumentata l efficacia clinica di un parametro significativo in diagnostica e follow up di numerose patologie conclamate e/o asintomatiche Si aprono nuovi scenari d uso e campi di applicazione per diagnostiche precoci precedentemente non percorribili (sangue cordonale; sangue midollare; trapianto di midollo osseo; ) Considerazioni finali Da un punto di vista tecnico, la modalità e la qualità dei dati refertati dipendono da: conoscenza degli strumenti utilizzati a disposizione filosofie analitiche e tecnologie Unfortunately...since the cell counters do not classify and count abnormal cells there are no multiparameter hematology analyzer which meet the criteria for an ideal device da Ideal hematological analyzer definition (E. Simson, W. Groner, 1995) 25

26 And yet, we must not stop exploring and measuring, for there is always more to learn. Maxwell Wintrobe 1979 Preparato di T. Artusi, G. Bonaccorsi