Rivista Italiana di Genetica e Immunologia Pediatrica - Italian Journal of Genetic and Pediatric Immunology

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1 Rivista Italiana di Genetica e Immunologia Pediatrica - Italian Journal of Genetic and Pediatric Immunology Anno III numero 3 - luglio 2011 direttore scientifico: Carmelo Salpietro - direttore responsabile: Giuseppe Micali Possibili nuove applicazioni terapeutiche dei probiotici Gaia Cocurullo, Giuseppina Campana, Natja Valente, Michele Miraglia del Giudice e Laura Perrone II Clinica Pediatrica, Dipartimento di Pediatria F. Fede Seconda Università di Napoli I probiotici sono definiti da The United Nations Food and Agricultural Organization (FAO) and the World Health Organization (WHO), come "Microrganismi vivi che, quando somministrati in quantità adeguate, comportano un vantaggio per la salute dell'ospite" (1). I prebiotici sono, invece, definiti come oligosaccaridi non digeribili, frutto-oligosaccaridi e trans-beta-galatto-oligosaccaridi, che stimolano selettivamente la crescita dei bifidobatteri e dei lattobacilli, producendo così un effetto prebiotico. Con il termine simbiotici, invece, ci si riferisce all'uso contemporaneo sia di prebiotici che di probiotici. Quest ultima formulazione permette di aumentare la sopravvivenza del microrganismo perché rende immediatamente disponibile il suo substrato. Attualmente, il termine probiotico viene spesso utilizzato in maniera impropria. I requisiti secondo i quali un microrganismo si può definire probiotico sono: (2) essere di origine umana essere sicuro per l impiego nell uomo: in Europa un utile riferimento in questo senso può essere la lista delle specie batteriche qualificate presuntivamente come sicure dall EFSA (QPS). In ogni caso, i microrganismi probiotici non devono essere portatori di antibiotico-resistenze acquisite e/o trasmissibili; stabile rispetto all azione di acidi gastrici e bile; capace di aderire alla mucosa intestinale. La scoperta dei probiotici, nel 1908, si deve all immunologo russo, premio Nobel, Elie Metchnikoff, il quale, dopo diversi studi, propose una suggestiva teoria che evidenziava l esistenza di una correlazione tra la longevità dei popoli Balcani ed orientali ed il costante consumo da parte di questi di latte fermentato. Successivamente, E. Metchnikoff evidenziò la presenza di un elevato numero di Bulgarican Bacillus in questo alimento e, con ulteriori studi, dimostrò che questo probiotico è in grado di contrastare lo sviluppo di batteri putrefattivi nel tratto gastrointestinale. I probiotici costituiscono una parte del microbiota intestinale, la loro azione è importante per modulare e stabilizzare la composizione del microbiota stesso, oltre che per aiutare l ospite a digerire o a sintetizzare numerosi nutrienti. (3) Il microbiota, e quindi anche i probiotici che lo costituiscono, sono fondamentali per la costituzione, insieme alla mucosa intestinale ed al muco ivi presente, della cosiddetta barriera mucosa, che è un importante sistema di difesa nei confronti dei fattori potenzialmente immunogenici o patogeni presenti nel lume. (4) Infatti, poichè i microrganismi patogeni devono aderire alle pareti intestinali per poter sopravvivere, se i probiotici si distribuiscono lungo tutto il tratto digestivo, non solo ne impediscono l attecchimento, ma ne combattono anche la proliferazione attraverso la produzione di acidi organici ed il conseguente abbassamento del ph dell intestino. Affinchè questi effetti benefici si possano manifestare, è di fondamentale importanza che, al momento della somministrazione, i batteri siano vivi; in quanto, questo è un requisito essenziale per permetter loro di superare le barriere gastriche ed ileali e quindi di riprodursi nell intestino crasso dopo essersi insediati fra altri batteri vivi (il microbiota) ed esercitando, quindi, a tale livello funzioni che comportano un attività metabolica. Da ciò si desume perchè il termine probiotico sia da riservare, come precedentemente detto, solo ed esclusivamente a cellule vive e vitali. Un aspetto caratteristico del trattamento con probiotici, il quale si è reso palese in numerosi studi scientifici, è che ceppi differenti della stessa specie possono avere effetti anche grandemente differenti sull ospite. L azione di un probiotico dipende, infatti, in tutta evidenza, dall interazione tra le sue specifiche attività metaboliche o funzionali e quelle dell ospite, e queste caratteristiche, quindi, sono certamente ceppospecifiche. (5-6) Probiotici e malattie dell apparato gastrointestinale L iniziale interesse sull utilizzo terapeutico dei probiotici è stato rivolto al trattamento di affezioni, in particolare di natura infiammatoria, a livello dell apparato gastrointestinale. Sebbene siano numerose le evidenze riguardo ai benefici dei probiotici sul tratto gastrointestinale, non è ancora completante chiarito il meccanismo di azione degli stessi. (7) Dal punto di vista funzionale, numerosi dati sperimentali suggeriscono che i probiotici possano concorrere al rinforzo delle attività della barriera mucosa intestinale nei confronti di patogeni, in particolare influendo sulle cellule epiteliali intestinali (CEI) e sui macrofagi, ed al mantenimento dell equilibrio del microbiota intestinale. (8) Inoltre, trials randomizzati hanno evidenziato gli effetti immunomodulanti dei probiotici su cellule dendritiche o T a livello del tratto gastrointestinale, evidenziando come siano in grado di determinare un aumento dei livelli di IL-10 nei topi knock-out, una riduzione dei livelli di IL-1 e di TNFα ed un miglioramento del danno istologico nei soggetti affetti da colite e da sindrome del colon irritabile. (9, 10) Accertato e molto rilevante, è l effetto dei probiotici su alcune patologie gastrointestinali, in particolare, questi determinano un effetto benefico nelle patologie infettive del tratto gastroenterico e in tutte le patologie su base infiammatoria. La ragione di ciò è dovuta alle numerose interazioni, ben documentate da numerosi trials clinici, dei probiotici con i vari costituenti del tratto gastrointestinale. Tra i meccanismi di interazione tra probiotici e cellule epiteliali intestinali i più importanti sono: 1) Induzione della sintesi di heat shock proteins (hsp) citoprotettive Le CEI, quando vengono a contatto con stress termici, osmotici, ossidativi o di altro tipo, mettono in azione un sistema di tolleranza allo stress basato sull induzione delle cosiddette hsp cellulari. Nell intestino le hsp indotte includono la proteina hsp25, che stabilizza l actina, e la proteina hsp72, che previene la denaturazione cellulare. Tali meccanismi contribuiscono a mantenere efficienti le tight junctions fra le CEI, promuovendo così la funzione della barriera mucosa (11). Nell intestino i probiotici inducono la produzione di hsp citoprotettive (12). 2) Modulazione dei sistemi di segnalazione infiammatori nelle CEI Le CEI sono munite di sistemi di segnalazione chiave per l attivazione della risposta immune in risposta ad una varietà di stimoli. Il principale di questi sistemi è NFκB, presente nel citoplasma nella sua forma inattiva, legato alle molecole inibitorie della famiglia IκB. In presenza di stimoli pro-infiammatori, IκB viene fosforilata, si stacca da NFκB e permette così all NFκB stesso di migrare dal citoplasma al nucleo, attivando la trascrizione di geni specifici (13). Alcuni probiotici modulano la degradazione di IκB, mentre altri stimolano NFκB ad incrementare la secrezione di specifiche citochine (14). Lactobacillus plantarum inibisce l attività di NFκB e la degradazione di IκB in vitro (15). Un altro bersaglio molecolare modulato da parte dei probiotici è il PPARγ, un recettore nucleare che può regolare il livello dell infiammazione intestinale, che può in particolare svolgere un ruolo nell attenuare alcune patologie intestinali infiammatorie inibendo l attività di NFκB (PPARγ è infatti ridotto nelle CEI di pazienti con malattie infiammatorie intestinali o inflammatory bowel disease-ibd) (16-17). Il trattamento con ceppi specifici di probiotici può aumentare l espressione di PPARγ, e migliorare quindi l infiammazione in pazienti con IBD (18-19). 3) Regolazione dell apoptosi Alcuni probiotici possono regolare l apoptosi (la cosiddetta morte programmata ) delle CEI. Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) ATCC può attivare una proteina ad azione anti-apoptotica ed inibire una proteina ad azione pro-apoptotica in CEI stimolate con varie citochine (TNF-α, IL 1α-β o IFNγ). Altri esperimenti indicano che LGG attiva la produzione di due proteine, p75 e p40, che promuovono la proliferazione cellulare ed attivano la proteina Akt anti-apoptotica (20). La capacità dei probiotici di regolare l apoptosi può rappresentare anche un utile strategia per il controllo delle infezioni intestinali (21). 4) Modulazione dei sistemi di segnalazione dei Macrofagi A livello intestinale i probiotici modulano diversi sistemi di segnalazione dei macrofagi, con effetti sull immunità mucosale. Alla luce di questi importanti effetti dei probiotici a livello del tratto gastrointestinale, numerosi studi sono stati improntati al fine di poter evidenziare un possibile utilizzo di questi in diverse patologie gastrointestinali. La maggior parte di questi studi, effettuati negli ultimi anni, ha dimostrato l efficacia di specifici probiotici nel ridurre la sintomatologia nella popolazione pediatrica colpita da gastroenterite infettiva (22-25). Infatti, si è resa evidente, dopo trattamento con probiotici, una riduzione della durata della diarrea infettiva di 0, 7 giorni ed una riduzione della frequenza degli episodi diarroici già nelle prime ore successive al trattamento (26). In base a queste recenti evidenze scientifiche, pertanto, ne è consigliata l assunzione, in corso di gastroenterite acuta, fin dalla comparsa dei primi sintomi. L efficacia è evidente soprattutto nei casi di infezioni da Rotavirus trattate precocemente con terapia reidratante orale associata a Lactobacillus GG (27-30). Questo probiotico è in grado di diminuire l escrezione di rotavirus nelle feci (31), contribuendo alla riduzione della diffusione del virus e perciò migliorando l efficacia delle strategie di prevenzione degli episodi infettivi sia in comunità, sia durante la degenza ospedaliera, anche se con risultati che non possono essere ancora considerati definitivi (32-34). L efficacia del trattamento con il probiotico LGG è dimostrata nelle gastroenteriti sostenute da Rotavirus di severità lieve-moderata, mentre i risultati ottenuti nel trattamento delle forme Rotavirus negative, e soprattutto in quelle batteriche, non sono significativi (27-34). Si ipotizza che l inefficacia di LGG nelle diarree batteriche sia dovuta alla capacità dei batteri coinvolti di produrre mucinasi che vanificano gli effetti del probiotico (35). Uno studio del 2005 ha, invece, dimostrato l efficacia del Lactobacillus paracasei ST1 nelle gastroenteriti non determinate da Rotavirus (36). Risultati che confermano l efficacia della supplementazione con probiotici nella terapia delle gastroenteriti in età pediatrica, vengono osservati anche da una recente review (37), che ne evidenzia, inoltre, la ceppo-specificità; in particolare i probiotici

2 che hanno dimostrato i più promettenti risultati sono Lactobacillus casei subsp. rhamnosus GG, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum. L incidenza di diarrea in corso di terapia antibiotica (AAD) è del 5-30% (30). La maggior parte degli antibiotici può indurre, durante il trattamento, la comparsa di diarrea: il rischio è tuttavia maggiore nel caso di terapie con aminopenicilline, associazione di aminopenicilline con acido clavulanico, cefalosporine e clindamicina (38). Recenti meta-analisi riportano un importante riduzione dei casi di AAD quando alla terapia antibiotica sia associato un trattamento preventivo con probiotici (38-40). Il microrganismo più efficace sembra essere Saccharomyces boulardii, tuttavia nei bambini si è dimostrato efficace anche LGG (41-42). S. boulardii, per il quale esiste il rischio di una diffusione ematogena nei pazienti immunocompromessi, si è dimostrato efficace nell inibire il ripetersi di episodi di infezione da Clostridium difficile (43). Anche se non tutti gli studi hanno confermato l efficacia del trattamento con probiotici nella prevenzione dell AAD, una review del 2009 ha dimostrato che l efficacia stessa è legata prevalentemente al ceppo utilizzato (44) ; gli studi analizzati confermano inoltre come i ceppi Saccharomyces boulardii e Lactobacillus rhamnosus GG presentino sufficienti evidenze cliniche per confermare il loro utilizzo nella terapia della diarrea da antibiotici. L enterocolite necrotizzante (NEC) è una causa rilevante di morbilità e mortalità nei neonati prematuri; l eziologia di questa patologia non è stata ancora del tutto chiarita. Sono stati identificati fattori di rischio, quali prematurità, alimentazione enterale e colonizzazione batterica, che causerebbero la risposta infiammatoria esagerata responsabile della necrosi ischemica dell intestino (45). Sulla base delle osservazioni sui modelli animali, alcuni studi hanno valutato gli effetti di una supplementazione con probiotici sull incidenza di NEC nei neonati. Una review recentissima (46) ha analizzato i risultati di 11 studi presenti in letteratura evidenziando come il rischio di NEC e di morte, nelle popolazioni trattate con probiotici, si sia rivelato effettivamente più basso, confermando un significativo beneficio della supplementazione con probiotici nei bambini prematuri e di peso molto basso alla nascita. In questa meta-analisi si conclude addirittura che, per gli importanti effetti ottenuti, i risultati statisticamente significativi e le evidenze riscontrate, non sembrano più necessari studi randomizzati contro placebo. Probiotici e malattie allergiche I disturbi allergici sono associati ad uno shift isotipico Th1/Th2, con una risposta immunitaria principalmente mediata dalla popolazione Th2, con conseguente rilascio di citochine quali IL-4, IL-5 e IL-13 e la produzione di IgE. (47) Ciò non consente, quindi, il fisiologico riequilibrio, nei primi anni di vita, verso una risposta immunitaria Th1 mediata che permetta, quindi, la produzione di IL-12 e IFN-γ. Negli ultimi anni vasto interesse è stato riposto nella possibile applicazione dei probiotici in soggetti con patologie allergiche. Il razionale di ciò risiede nella scoperta di un importante effetto immunomodulante a livello gastrointestinale, svolto dalla flora non patogena ivi residente, compresi i microrganismi probiotici quali lattobacilli e bifidobatteri. A supporto di questa ipotesi vi è l osservazione, derivata da diversi studi scientifici, che la composizione della flora batterica intestinale vari tra bambini con e senza malattie allergiche, in particolare in questi ultimi, vi è una prevalenza di batteri patogeni, tra i quali sono presenti soprattutto i Clostridi. Questo è, inoltre, testimoniato da uno studio che ha messo in evidenza come la diversa composizione della microflora, in soggetti di due paesi diversi, determini una bassa (in Estonia) ed un alta (in Svezia) prevalenza di patolgie allergiche. (48). Inoltre, è da sottolineare, che questa variazione può precedere lo sviluppo di malattie allergiche suggerendo una relazione causale. (49-52) Ciò ha portato a formulare l ipotesi plausibile, che una flora intestinale aberrante possa causare o peggiorare le malattie allergiche. Ciò è inoltre stato evidenziato, negli ultimi anni, da numerosi studi, i quali hanno dimostrato che la stimolazione del sistema immunitario, da parte di alcuni prodotti di derivazione microbica, è in grado di prevenire lo sviluppo di patologie allergiche nell infanzia. (53-54) L azione immumodulatoria espletata dai probiotici è in parte mediata dalla regolazione delle cellule T helper, incrementando così da una parte l espressione di citochine antinfiammatorie, tra le quali principalmente vi è l IL-10, e dall altra riducendo quella di citochine proinfiammatorie quali l INF-γ, il TNF-α e l IL-12 (55). Nella letteratura internazionale è possibile ritrovare diversi studi i quali hanno valutato se vi fosse un reale intervento benefico nelle malattie allergiche da parte dei probiotici. Tra questi, interessanti sono i risultati evinti da uno studio il quale ha voluto evidenziare se vi fossero modificazioni nei tassi d incidenza di sensibilizzazione allergica in soggetti con colonizzazione del tratto gastroenterico con batteri gram-positivi della flora intestinale, tra i quali anche lattobacilli e bifidobatteri (56-57) ; i risultati di questo studio sono stati incoraggianti in quanto si è evidenziata una riduzione del tasso di incidenza di sensibilizzazione allergica in questi soggetti. Inoltre, il primo e più noto studio che ha testato l effiacacia probiotica nel trattamento delle patologie allergiche, è stato quello condotto da Kalliomaki et all. (58-61). Questo trial clinico prevedeva la somministrazione in donne in gravidanza, con una storia familiare di patologia allergica nella propria famiglia o in quella del partner, di Lactobacillus rhamnosus strain GG (LGG), 2-4 settimane prima del termine della gravidanza e per 6 mesi dopo la nascita al neonato. Durante il secondo anno di follow-up nel gruppo di trattamento si è verificata una riduzione del 50% del tasso d incidenza di dermatite atopica rispetto al gruppo di controllo. Tale effetto benefico, però, non si è protratto fino al quinto anno di follow-up. Nello studio più recente in questo campo, Wickens et al. (62) hanno dimostrato un differente effetto esplicitato nella prevenzione della dermatite atopica, da parte di Lactobacillus rhamnosus e di Bifidobacterium animalis subsp. Lactis. I risultati hanno rivelato che la supplementazione perinatale con Lactobacillus rhamnosus, ha notevolmente ridotto il rischio di dermatite di circa la metà rispetto al gruppo trattato con placebo. Al contrario, Bifidobacterium animalis subsp. Lactis, non ha mostrato nessun effetto sulla prevenzione della dermatite o dell atopia. Questo studio ha, quindi, fornito ulteriori prove sull efficacia della profilassi effettutata con Lactobacillus rhamnosus per ridurre l incidenza di dermatite atopica in neonati ad alto rischio. È importante, inoltre, sottolineare come questo studio attesti il concetto, precedentemente accennato, che non tutti i probiotici sono ugualmente efficaci, in quanto l efficacia è assolutamente ceppo-specifica. Diversi studi affermano che la maggiore efficacia preventiva del LGG sullo sviluppo di dermatite atopica, si abbia se il trattamento probiotico venga fatto già in epoca prenatale. Il motivo per il quale questo intervento profilattico non viene ancora attuato è perché vi sono delle evidenze le quali assocerebbero l utilizzo di LGG nel periodo perinatale con un più alto tasso di wheezing e/o asma nei soggetti trattati rispetto alla popolazione. (58) Pertanto, il rapporto rischio / beneficio della somministrazione perinatale di probiotici non è ancora noto, ci si auspica che i futuri studi condotti in questo campo facciano particolare attenzione a constatare se vi sia davvero questa conseguenza al trattamento. Nel 2007 è stato pubblicato il primo studio che ipotizza il ruolo preventivo di un probiotico sulla ricorrenza di sintomi respiratori allergici nei bambini. Questo studio si prefiggeva lo scopo di valutare se il consumo giornaliero a lungo termine (12 mesi) di un latte fermentato contenente il probiotico Lactobacillus casei DN (un probiotico con attività immuno-modulante) potesse migliorare lo stato di salute e modificare il profilo immunologico di bambini in età prescolare con sintomatologia allergica a inalanti. (54) Si è trattato di uno studio multicentrico, prospettico, randomizzato, in doppio cieco, in cui sono stati arruolati 187 pazienti di età compresa tra 2 e 5 anni. Lo studio ha mostrato come la supplementazione con il probiotico abbia ridotto del 33% la ricorrenza di episodi di rinite/anno. Per interpretare l effetto immunomodulante dei probiotici nelle malattie allergiche, è stato ipotizzato che questi microbi stimolino i tessuti linfoidi associati all apparato intestinale e che ciò determini delle alterazioni a livello del sistema immunitario in via di sviluppo, che esitano principalmente in una inversione della polarizzazione pre-natale Th2 verso una risposta immunitaria Th1-mediata (switch Th2/Th1), determinando, quindi, anche una maggiore tolleranza verso gli antigeni ubiquitari non dannosi per l organismo. (63) Nonostante i numerosi studi al riguardo, tenendo conto anche dei risultati precedentemente riportati, tuttora non si è ancora capaci di definire con esattezza quale sia il reale meccanismo comune dei probiotici nell indurre un effetto anti-infiammatorio. Ma un importante dato, sul quale è sicuramente importante ancora indagare in futuro, è quello relativo ad una recente dimostrazione che, a differenza di tutte le citochine misurate, tra cui anche l IL-10, il trasforming growth factor-β (TGF-β) è l'unica citochina a non essere stata soppressa in animali trattati con probiotici dopo stimolazione allergenica. È ben noto il potente effetto inibitorio del TGF-β sulla proliferazione dei linfociti T e B, per cui questa osservazione sembra fornire degli elementi per poter considerare il TGF-β come uno dei più importanti mediatori dell effetto anti-infiammatorio determinato dai microrganismi probiotici. (59) L importanza del microbiota intestinale per un corretto sviluppo del sistema immunitario è stata ulteriormente confermata anche a livello cellulare. Difatti, è stato dimostrato che, in assenza di stimoli microbici, l attività delle Cellule T regolatorie (Treg), tenda ad essere deficitaria e ciò contribuirebbe a determinare un sistema di tolleranza immunitaria alterato che, in ultima analisi, determinerebbe un esagerata proliferazione di cellule T effettrici con conseguente aumentata produzione di citochine pro-infiammatorie. (64;8) A supporto di questa ipotesi vi è un recente studio sperimentale condotto su topi sensibilizzati alla ovoalbumina (OVA) ai quali sono stati somministrati per via orale Bifidobacterium lactis (Bb-12) e Lactobacillus rhamnosus (LGG), in quanto i risultati hanno evidenziato una marcata riduzione sia della risposta IgE che delle IgE e IgG specifiche per l OVA nei topi trattati con questi due probiotici. Questi dati suggeriscono, dunque, che il trattamento con probiotici possa comportare un effetto generale sulla produzione di immunoglobuline allergene-specifiche, non solo inibendo, quindi, le risposte immunitarie Th2-dipendenti (IgE), ma anche determinando la soppressione Th1 (IgG2a). Ciò confermerebbe che, l'inibizione funzionale della sensibilizzazione allergene-indotta e la riduzione delle malattie delle vie aeree, dopo trattamento con probiotici per via orale, sarebbe legata alla maggiore attività di cellule Treg causando effetti immunosoppressivi sulla risposta allergene-specifica ed una maggiore tolleranza. Negli animali che sono stati alimentati con Bb-12 e LGG, inoltre, è stata riscontrata una significativa soppressione della conta cellulare totale, con una particolare importante riduzione dell afflusso di eosinofili nelle vie aeree. (53) L attivazione, da parte dei probiotici, delle cellule Treg sembra essere, dunque, uno dei punti cardine nella mediazione del loro effetto anti-infiammatorio in molte patologie allergiche, in quanto, non solo le cellule Treg, una volta attivate, possono sopprimere le Cellule T effettrici in un modo antigene- nonspecifico chiamato "bystender suppression, ma studi in vivo hanno, inoltre, dimostrato che le cellule Tregs possono creare un ambiente di regolazione che promuove lo sviluppo di nuove popolazioni di Tregs con una specificità verso antigeni diversa da quella della popolazione d origine, queste nuove cellule Treg, inoltre, sono capaci anche di migrare in altre sedi. (65) Infatti, alcuni Lattobacilli, possono indurre la produzione di Tregs all interno del tessuto linfoide associato alla mucosa intestinale (GALT), ma, una volta prodotte, queste Tregs sarebbero capaci di diffondere all interno delle vie aeree in risposta ad uno stimolo immunitario o infiammatorio. Questa ipotesi è sostenuta dai risultati di uno studio sperimentale che indicano il ritrovamento, dopo trattamento orale con L.reuteri, di un aumentato numero di Tregs nei linfonodi di drenaggio del polmone, rispetto ai soggetti del gruppo di controllo trattati con placebo. (65) Le cellule Treg non rappresentano l unico bersaglio cellulare dei probiotici nella mediazione del loro effetto immunomodulante, infatti, in numerosi studi si è evinta anche una importante azione dei probiotici a livello delle cellule dendritiche (DC). Le DC hanno la capacità di indurre la produzione di IL-10, suggerendo per loro, quindi, un fenotipo di tipo regolatorio. L azione sulle DC di molti probiotici sembra essere una delle chiavi per la loro azione immunomodulante. (66) Di recente, Kwon et al. (67) hanno dimostrato

3 che le DC regolatorie esprimono alti livelli di IL-10, TGFβ, COX-2 e indoleamine 2, 3-deossigenasi (IDO). Tutte queste molecole sono in grado di stimolare la generazione di Tregs CD4+ Foxp3+ dopo la somministrazione di una preparazione con ceppi probiotici misti nei topi. L enzima IDO è il fattore limitante nella conversione del triptofano a chinurenine immunoattive. Le DC, esprimendo IDO, contribuiscono alla generazione e al mantenimento della tolleranza periferica mediante deplezione delle cellule T autoreattive e inducendo le risposte mediate da Treg. (68) Hayashi et al (69) hanno osservato che l attività antiinfiammatoria di L. reuteri nelle vie aeree di topi OVA sensibilizzati si associ con l'aumento sistemico, quindi non localizzato solo a livello polmonare, dell attività dell enzima IDO. Quindi, in relazione a tutto ciò, sembra che la capacità di alcuni probiotici di promuovere l'attività dell enzima IDO, oltre che all espressione di IL-10 da parte di DC, possa essere importante nella generazione di un regolazione della risposta immunitaria e nello stabilimento di uno stato di tolleranza. (65) Probiotici e asma Altro possibile e importante effetto benefico dei probiotici è stato prospettato in soggetti con asma bronchiale. A tal riguardo sono stati effettuati diversi studi scientifici utilizzando probiotici diversi, i risultati non sono stati univoci. Sebbene studi condotti su bambini ad alto rischio di sviluppare allergia, non abbiano prodotto risultati rilevanti sulla riduzione dell incidenza di asma, c è evidenza che la somministrazione orale di certi microrganismi possa modulare la risposta immune a livello polmonare. (65) In un modello murino di asma bronchiale si è dimostrato che la somministrazione orale di probiotici, prima e durante la sensibilizzazione con allergene e il challenge delle vie aeree, porta ad una soppressione di tutte le caratteristiche del fenotipo asmatico, compresa la produzione di IgE specifiche, l infiammazione delle vie aeree e lo sviluppo di iperresponsività delle vie respiratorie (AHR). Inoltre, questo effetto è associato con la soppressione della risposta immunitaria Th2 allergene-indotta, di pari passo con l'induzione di TGF- β a livello intestinale. (53) Il ruolo dei probiotici è stato analizzato, in diversi studi, sia nell ambito del trattamento della patologia asmatica già manifestatasi sia nell ambito della prevenzione di questa patologia. Da sottolineare è, infatti, che il wheezing ricorrente nell'infanzia può essere la prima manifestazione di asma; circa il 30% dei bambini che presentano, durante la prima infanzia, più di tre episodi di bronchite asmatica possono sviluppare asma persistente. (70) Nell ambito di una possibile prevenzione dell asma attraverso l utilizzo di probiotici, è da tener presente il ruolo della dermatite atopica (AD. Il razionale, per il quale si potrebbe attuare un trattamento preventivo in bambini con AD, è basato sul dato che questa malattia può essere la prima manifestazione della cosiddetta marcia atopica, la naturale progressione delle patologie allergiche, con successivo sviluppo di asma e rinite allergica. Infatti, circa il 40% dei bambini con AD svilupperanno asma più avanti durante l infanzia. (71) Altri fattori predisponenti allo sviluppo di asma sono un anamnesi positiva per familiarità allergica, una sensibilizzazione precoce verso aeroallergeni, l esposizione al fumo di sigaretta ed una quantità di proteina cationica eosinofila aumentata (ECP). (72-73) Poiché la sensibilizzazione allergica può verificarsi in età precoce, strategie di intervento preventivo, dovrebbero essere effettuate in questo periodo critico. Proprio sulla base di queste premesse, di recente è stato pubblicato uno studio (74), il quale ha valutato l effetto della somministrazione precoce di un simbiotico per 12 mesi (Bifidobacterium breve M-16V e un galatto/frutto oligosaccaride: Immunofortis ) sulla prevalenza dei sintomi asmatici in bambini con dermatite atopica (AD). Questo studio multicentrico, è stato condotto in doppio cieco controllato con placebo, su novanta bambini affetti da AD, di età <7 di mesi,. Al termine dell anno di follow-up si è evidenziato che la prevalenza di 'wheezing frequenti' e 'wheezing e / o respirazione rumorosa, al di fuori di quella correlata al raffreddore ' era significativamente più bassa nel gruppo trattato con simbiotici rispetto a quello trattato con il placebo. Inoltre, nel gruppo che assumeva il simbiotico, un numero significativamente inferiore di soggetti, rispetto al gruppo di controllo, ha iniziato ad utilizzare farmaci per l'asma dopo l inizio dello studio. Invece, i livelli di IgE totali non differivano tra i due gruppi, ma, cinque tra i soggetti appartenenti al gruppo di controllo, hanno sviluppato elevati livelli di IgE specifiche per l epitelio di gatto, mentre ciò non si è evidenziato in nessuno tra i soggetti del gruppo trattato. Questo studio, quindi, evidenzierebbe un buon effetto preventivo, di questo simbiotico, nei confronti della sintomatologia asmatica in bambini con AD. Recentemente, è stato pubblicato il primo studio (75) che evidenzia la riduzione, dopo trattamento con simbiotici, della risposta Th2- mediata indotta da allergeni ed un miglioramento dei valori del PEF in pazienti con asma allergico. In questo studio condotto da van de Pol et al., sono stati reclutati ventinove soggetti adulti con asma intermittente o lieve persistente e allergia agli acari della polvere (HDM). Questi soggetti, dopo esser stati randomizzati in doppio cieco, sono stati suddivisi in due gruppi, il primo dei quali ha ricevuto un simbiotico (90% galattooligosaccaridi a catena corta, 10%frutto-oligosaccaridi a catena lunga: Immunofortis e Bifidobacterium breve M-16V), mentre il secondo ha assunto solo placebo, per entrambi i gruppi, il tempo di trattamento è durato 4 settimane. I risultati di questo studio non hanno mostrato un influenza del trattamento sull aumento di eosinofili nello sputum 6 e 24 ore dopo il challenge bronchiale con HDM. Allo stesso modo, altri parametri di infiammazione bronchiale di funzionalità polmonare non differivano in seguito al trattamento, rispetto al gruppo trattatto con placebo. Tuttavia, i valori di PEF sia del mattino che della sera, sono risultati significativamente aumentati nel corso di trattamento con simbiotici. I simbiotici, inoltre, si sono mostrati in grado di modulare anche l assetto citochinico, infatti, l'aumento nel siero di IL-5 dopo challenge allergenico è risultato significativamente inibito nei soggetti che hanno assunto i simbiotici, allo stesso modo, è risultata ridotta la produzione di citochine-allergene indotta da parte di cellule Th2 (IL-5 e IL-4 + IL-13). Uno dei più importanti studi che attesta l effetto dei probiotici nel trattamento di bambini con asma allergico è quello condotto da Yue- Sheng Chen et al. (76), i quali hanno condotto uno studio randomizzato in doppio cieco, su un gruppo di bambini in età scolare (tra i 6 e i 12 anni) affetti da asma lieve o moderata persistente da almeno un anno e rinite allergica (AR). Lo scopo di questo studio era evidenziare se la somministrazione quotidiana di Lactobacillus gasseri A5, per 8 settimane, potesse migliorare i sintomi clinici correlati all asma ed alla rinite, e se questo probiotico avesse degli effetti immunomodulanti nei soggetti selezionati nello studio. I risultati di questo studio hanno mostrato un importante effetto di questo probiotico in soggetti con asma allergico. Infatti, rispetto ai pazienti che facevano parte del gruppo di controllo, quelli che hanno ricevuto il trattamento probiotico hanno mostrato significativi miglioramenti di FEV1, FVC, FEV1/FVC (%) e MEF25-75, dopo il periodo di trattamento. Inoltre, la risposta al test di broncodilatazione è diminuita significativamente nel gruppo trattato con probiotici rispetto al gruppo di controllo, questo importante dato è stato il primo ad evidenziare che il trattamento con probiotici può diminuire l AHR nei bambini asmatici, e quindi non più solo in modelli murini di asma. Inoltre, anche se, non si sono evidenziate differenze significative nel miglioramento della frequenza dei sintomi asmatici e di AR tra i soggetti trattati con probiotici e quelli che assumevano il placebo, tuttavia, vi è stato un miglioramento statisticamente significativo della sintomatologia asmatica diurna e dei sintomi correlati all AR nel gruppo di trattamento con il probiotico rispetto al gruppo che assumeva placebo. Non si è evidenziata, invece, alcuna differenza nel numero di pazienti che hanno mostrato un miglioramento dei sintomi asmatici notturni tra i due gruppi. Altro dato importante di questo studio è che il numero di soggetti che hanno mostrato un miglioramento nel punteggio childhood asthma control test (C-ACT) è stato maggiore nel gruppo trattato con il probiotico rispetto al gruppo di controllo. Inoltre, anche se i livelli sierici di IgE totali sono diminuiti lievemente in entrambi i gruppi, alla fine del periodo di studio, la differenza non era statisticamente significativa. Tuttavia, si è osservata una diminuzione significativa della produzione, da parte delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs), di TNF-α e di IL-13. È stato, inoltre, osservata, dopo il trattamento con L. Gasseri, una riduzione della produzione di citochine Th1 correlate, quali IFN-γ e IL-12, prodotte da parte di PBMC dopo stimolazione allergenica con PHA o Der p rispetto al gruppo di controllo. Mentre, la diminuizione dei valori di IL-10, nel gruppo trattato, è stata così lieve da non risultare statisticamente significativa. Purtroppo la letteratura scientifica nel campo di applicazione dei probiotici nel trattamento di soggetti con asma di tipo allergico, risulta essere ancora alquanto scarna, per cui, allo stato attuale, non si ritengono sufficienti i dati relativi agli esperimenti su modelli murini di asma che hanno evidenziato un efficacia del trattamento probiotico, per giustificare l utilizzo nella pratica clinica di probiotici nei soggetti con questo tipo di patologia. Probiotici e infezioni Altro importante effetto dei probiotici, risulta essere quello protettivo nei confronti di infezioni batteriche e virali dell apparato gastrointestinale e del sistema respiratorio. (77) La somministrazione di probiotici, infatti, è stata associata ad una minore incidenza di polmonite (78), ad una riduzione delle infezioni respiratorie nei bambini sani e ricoverati in ospedale (79-80), e si è ridotta la durata dell infezione con raffreddore comune. (81) Occorre notare che, oltre a causare direttamente morbilità e mortalità, ci sono prove che le infezioni delle vie respiratorie, soprattutto quelle virali, sono un fattore contribuente non solo al peggioramento dell'asma, ma anche allo sviluppo della malattia stessa. (82) Infatti, è stato suggerito che il potenziale effetto benefico dei probiotici nell asma potrebbe essere anche determinato dalla capacità di ridurre le infezioni virali nei primi anni di vita. (83) Questo effetto protettivo dei probiotici, sia in somministrazione intranasale che per via orale, nei confronti delle infezione delle vie aeree sarebbe da correlare, probabilmente, ad un aumento delle cellule che secernono IgA nella mucosa bronchiale (84) ma anche ad una up-regulation delle cellule natural killer (NK) e / o all attività dei macrofagi presenti nella mucosa delle vie aeree. (85-86) Uno studio randomizzato, in doppio cieco e contro placebo, è stato realizzato allo scopo di determinare se i probiotici possano ridurre il rischio di infezioni nei neonati. La ricerca ha coinvolto soggetti di età inferiore ai 2 mesi, cui è stato somministrato quotidianamente, fino a 12 mesi di età, latte arricchito da Lactobacillus rhamnosus GG e Bifidobacterium lactis Bb-12 o un latte con placebo. I dati ottenuti suggeriscono che i probiotici possano rappresentare un mezzo sicuro per ridurre il rischio di otiti medie acute precoci ed il ricorso ad antibiotici per le infezioni respiratorie ricorrenti durante il primo anno di vita. (87) Risultati analoghi sono emersi in uno studio condotto su una popolazione di 326 bambini di età compresa tra i 3 e i 5 anni, che ha rilevato una diminuzione di incidenza dell uso di antibiotico di oltre il 65% e una riduzione dei giorni di assenza da scuola di oltre il 25% tra i bambini trattati con un probiotico. (88) Un ulteriore studio randomizzato in doppio cieco ha anch esso evidenziato come il trattamento orale con L.rhamnosus GG possa ridurre il tasso di severità delle infezioni virali. (89) Conclusioni In conclusione, quindi, possiamo affermare che il potenziale campo di applicazione dei probiotici è notevolmente vasto e non ancora del tutto chiarito. Sicuramente la letteratura internazionale ha confermato un reale effetto benefico ed immunomodulante dei probiotici in diverse patologie gastrointestinali, allergiche e respiratorie, ma, naturalmente affinchè questi possano rientrare nella routine dei piani terapeutici necessitano ulteriori conferme scientifiche. Bibliografia 1. FAO/WHO Expert Consultation. Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria (2001) Salminen S, Bouley C, Boutron-Ruault MC, Cummings JH, Franck A, Gibson GR, et al. Functional food science and gastrointestinal physiology and function. 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