Bergamo 9 Ottobre. M.Scanziani Mfg Director Hospira S.p.A.

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1 Bergamo 9 Ottobre M.Scanziani Mfg Director Hospira S.p.A.

2 Hospira Società Mondiale in specialità farmaceutiche e sistemi infusionali. Leader di mercato mondiale in: Farmaci generici iniettabili Sistemi infusionali 70 anni di storia: Cambia statuto nello spin off di Abbott nel 2004 ~$4 billion all anno di rendita ~14,000 impiegati, 13 industrie di produzione Sede centrale nel Lake Forest, Ill., USA 2

3 Hospira è indirizzata verso le necessità di Critical Healthcare Prodotti chiave Clienti Necessità Critica Specialità farmaceutiche ignettabili portfolio di~200 prodotti Sistemi infusionali >550,000 devices istallati nel mondo Ospedali e siti healthcare providers Per ridurre costi Errori clinici infezioni Per sviluppare: Soddisfazione del paziente Soddisfazione dell operatore 3

4 Hospira in Italia Hospira Italia s.r.l. 70 Dipendenti Attività commerciali Consociata leader in Europa, Hospira offre al mercato farmaceutico italiano un ampio portfolio di prodotti farmaceutici equivalenti iniettabili ed è partner tecnologico accreditato per la gestione elettronica delle terapie infusionali. La leadership nella commercializzazione di farmaci oncologici iniettabili equivalenti e il recente ingresso nel mercato dei farmaci biotecnologici a brevetto scaduto (biosimilari) rendono Hospira Italia un prezioso alleato del Servizio Sanitario Nazionale nell ambito delle politiche di contenimento dei costi e valorizzazione dell impiego delle risorse a beneficio della innovazione. Hospira S.p.A. 260 Dipendenti Produzione Farmaceutica (sito di Liscate) Sito di produzione specializzato in prodotti farmaceutici iniettabili (liofilizzati, polveri sterili, fiale, prodotti liquidi sterili, etc.). Dotato di laboratori di Quality Control e R&D per l effettuazione della analisi richieste dal processo produttivo, studi di stabilità, sviluppo formulazioni e scale-up industriale.

5 Hospira S.p.A.

6 Hospira S.p.A. La nostra organizzazione 118 Manufacturing 26 QA 40 QC 30 Engineering 3 EHS 7 Finance 5 HR 4 Purchasing 16 Supply Chain 2 IT 9 One2One R&D

7 La produzione dei Farmaci Bioequivalenti Quality Manufacturing

8 Dal DNA alle Proteine L espressione genica negli eucarioti superiori

9 Trascrizione pre-mrna Splicing mrna Proteina Traduzione Modifiche Post-Traduzionali 9 Glocosidazione, Fosforilazione, Solfonazione, Legami S-S, eliminazione peptidi, etc.

10 Struttura delle Proteine La struttura tridimensionale delle proteine è profondamente legata alla loro funzione biologica. Le componenti che la definiscono sono le seguenti: STRUTTURA PRIMARIA: rappresenta la sequenza amminoacidica della proteina determinata dalle informazioni contenute nel mrna. STRUTTURA SECONDARIA: strutture fondamentali presenti nelle proteine. Esse si differenziano in α-elix, b-sheet e random coil. STRUTTURA TERZIARIA: conformazione tridimensionale della proteina determinata dal posizionamento nello spazio di α-elix, b- sheet e random coil. STRUTTURA QUATERNARIA: conformazione tridimensionale determinata dalla interazione di più proteine a formare un complesso multi-proteico. 10

11 11

12 Processo di Folding Proteico Processo iterativo che porta il polipeptide a raggiungere la corretta struttura tridimensionale. La sequenza aminoacidica già contiene le informazioni relative alla struttura tridimensionale della proteina. Il processo di folding è molto complesso e richiede spesso l interazione con altre proteine e l intervento di modifiche post-traduzionali.

13 Denaturazione Processo che determina la perdita della struttura tridimensionale della proteina e conseguentemente la perdita della sua funzione biologica. La denaturazione può essere causata da fenomeni fisici (calore, agitazione, etc.) o chimici (ph, SDS, etc.) Il processo di denaturazione difficilmente è reversibile. Spesso proteine denaturate modificano in modo sostanziale le loro caratteristiche funzionionali e chimicofisico (corpi insolubili, precipitazione in soluzione etc.). La denaturazione può avvenire anche per acidi nucleici ma in questo caso il fenomeno può essere reversibile (calore).

14 La Qualità nella Produzione

15 Quality by Design (QbD) Quali sono i prerequisiti per poter garantire la produzione di un Farmaco Bioequivalente di alta qualità? Conoscere la proteina. Oggi possiamo basarci su un bagaglio di conoscenza ampio e oggettivo generato grazio all innovazione tecnologica nelle metodiche di caratterizzazione genica e proteica. Conoscere il microrganismo ospite. Oggi abbiamo la possibilità di selezionare e controllare il microrganismo ospite grazie a metodiche real time e accurate. Contaminazioni e mutazioni del microrganismo ospite possono essere identificate in modo efficace. Disegnare il processo di produzione e purificazione della proteina. Applicando i criteri della QbD insieme a metodiche biomolecolari possiamo creare un processo robusto e riproducibile. 15 Controllo efficace del processo e del prodotto. Oggi possiamo applicare metodiche biomolecolari in grado di assicurare la conformità del prodotto rispetto alle specifiche.

16 Conoscere la Proteina

17 Eritropoietina (EPO) FUNZIONE Ormone glicoproteico che regola il processo di eritropoeisi, ovvero il processo di differenziazione dei globuli rossi dal midollo osseo. STRUTTURA PRIMARIA Presenta glicosidazioni post-traduzionali tipiche degli Eucarioti superiori. Presenta ponti disolfuro fondamentali per un corretto mantenimento della struttura tridimensionale. Significativo contenuto di amminoacidi apolari e basici Presenza di due ponti S-S 17

18 Eritropoietina (EPO) STRUTTURA SECONDARIA e TERZIARIA -helix -sheet 18

19 Recettore Eritropoietina (EpoR) RECETTORE DI MEMBRANA (omodimero) EPO EpoR EpoR 19

20 Conoscere il Microrganismo Ospite

21 Chinese Hamster Ovary cells (CHO cells) Linea cellulare immortalizzata (tumorale) Cellule isolate negli anni 60 e utilizzate per colture in terreno liquido. Per riprodursi hanno bisogno di Prolina nel terreno di coltura e questo le rende ideali come organismi ospite per proteine ricombinanti (marker selezionabile). CHO sono ancora oggi le cellule eucariote più utilizzate per la produzione industriale di proteine ricombinanti. Esse rappresentano l alternativa eucariote di E.coli. Ampiamente caratterizzate a livello genetico e metabolico.

22 Vettori di Espressione PLASMIDI: doppie eliche di DNA circolare capaci di replicarsi all interno della cellula ospite. Gli elementi principali sono: ORI (Origin of Replication) MCS (Multi Cloning Site) Marker (resistenza antibiotica, auxotrofia, etc.) Gene Cassette. Promoter Coding Region (ORF) HIS-tag Terminator VETTORI VIRALI: virus (DNA o RNA) geneticamente modificati in grado di integrare il proprio genoma all interno della cellula ospite. 22

23 Disegnare il Processo di Produzione

24 MCB WCB - Bioreattori MASTER CELL BANK Linea cellulare ricombinante in cui il gene di interesse è: Inserito in modo stabile Non contiene mutazioni Espresso ad alti livelli. MCB viene conservata a -70 C (evitare replicazione incontrollata) in single use vial. WORKING CELL BANK Da ogni vial di MCB vengono generate le Working Cell Bank (WCB), attraverso subculturazione. Anche WCB sono conservata a -70 C. PROTEINA RICOMBINANTE Ogni WCB viene utilizzata per produrre un lotto di proteina ricombinante attraverso inoculo in Bioreattore. MCB Subcultura WCB Bioreattore 24

25 Esempio applicato a EPO Cell Harvesting Tank) Control MCB Control Spin-flask (revitalization) Enrichment Culture Bioreatctor Control Microfiltration Control Control Ultrafiltration (change buffer) Control Purified Product Ultrafiltration (change buffer) Cell-Free Tank 25 Purification Columns (Different steps like ion exchange, affinity, etc.)

26 Controllare il Processo e il Prodotto

27 PARAMETRI FISICO/CHIMICI TEMPERATURA : la temperatura deve essere mantenuta sotto controllo, in particolare durante la fase di crescita cellulare ed espressione della proteina (Bioreattore). O 2 eco 2 : i livelli di Ossigeno e Anidride Carbonica devono garantire l ambiente ottimale per la crescita delle cellule. L Anidride Carbonica può modificare il ph nel bioreattore. ph: ha un diretto impatto sulla crescita cellulare e sulla denaturazione proteica. Deve essere pertanto mantenuto sotto controllo. AGITAZIONE: la velocità di agitazione determina l ossigenazione e il rinnovo del terreno di coltura all interno del bioreattore. Eccessiva agitazione può determinare denaturazione proteica o formazione di schiuma all interno del bioreattore. TERRENO DI COLTURA: il rinnovo del terreno di coltura è importante nelle fasi di crescita cellulare e di espressione della proteina eterologa. 27

28 28 Un esempio

29 PUREZZA CELLULARE ELETTROFORESI: metodica che permette di separare materiale genetico o proteico sulla base di caratteristiche chimico/fisiche. NORTHEN BLOT: metodica che permette di trasferire RNA precedentemente separato in elettroforesi su una membrana. La membrana può essere poi ibridata con DNA o RNA della proteina o del marker di interesse. SOUTHERN BLOT: metodica che permette di trasferire frammenti di DNA precedentemente separato in elettroforesi su una membrana. La membrana può essere poi ibridata DNA o RNA della proteina o del marker di interesse. PCR: Polymerase Chain Reaction. Amplificazione mediante primer specifici. RFLP: Restriction fragment Length Polymorphism. Profilo del DNA mediante enzimi di restrizione seguiti da Southern Blot. RIBOTYPING: profilo di restrizione dei geni codificanti per rrna 12S, 23S per procarioti e 18S per eucarioti. 29

30 30 Alcuni esempi

31 PUREZZA DEL GENE ETEROLOGO PCR: mediante primer altamente specifici è possibile verificare la presenza del gene eterologo e la sua corretta struttura genica. Si possono amplificare più regioni della gene cassette. SEQUENZIAMENTO: mediante tecniche automatico di sequenziamento è possibile verificare la sequenza genetica del costrutto fino a evidenziare la presenza di mutazioni puntiformi. BLOTTING: si possono utilizzare varie metodiche di blotting per verificare livelli di espressione mrna. 31

32 PUREZZA DELLA PROTEINA SDS PAGE: tecnica di elettroforesi in gel denaturante che separa le proteine sulla base del loro peso molecolare. ISOELETTROFOCUSING (IEF): tecnica di elettroforesi in gel a gradiente di ph che separa le proteine sulla base della loro carica. SDS page e IEF possono essere associate in sequenza sullo stesso gel per effettuare 2D Elettroforesi. WESTERN BLOT & IMMUNOBLOTTING: metodica che permette di trasferire proteine precedentemente separate in elettroforesi, su di una membrana. La membrana può essere poi ibridata con anticorpi specifici per singoli epitopi. ELISA: metodica utilizzata per individuare la presenza di particolari epitopi sulla proteina. 32

33 Alcuni Esempi ph 9 - pi 6 ph

34 Tutti sanno che una cosa è impossibile da realizzare, finché arriva uno sprovveduto che non lo sa e la inventa. Albert Einstein 34

35 Thank You

36 DNA Genetic Code DNA RNA 36

37 Thank You

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