Epatite C: epidemia antica o moderna?
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1 Epatite C: epidemia antica o moderna? Luigi Tagliaferro Lab. Dr. Pignatelli Lecce Taranto, 25 Ottobre 2004
2 Epatite C Storia delle Epatiti Virali Virus Epatopatici HCV Quasispecie Struttura/Biologia Molecolare Epidemiologia Sintomi Fattori di Rischio Diagnosi
3 Le Epatiti "Epatite virale" è un termine spesso adoperato per indicare una serie di patologie epatiche provocate da virus diversi (virus A-G, CMV, EBV, ecc.). Anche se hanno nomi simili, i virus delle epatiti A-G hanno strutture diverse e sono classificati in diverse famiglie. Molte infezioni sono tanto lievi da poter essere trascurate, mentre altre evolvono verso un'epatite fulminante che può rivelarsi fatale.
4 Le Pietre Miliari nella ricerca sui virus delle epatiti (1) EVENTI Prima descrizione di ittero epidemico (Ippocrate) ANNO 460 AC Isolamento di pazienti itterici (Papa Zaccaria) 751 Possibile origine dei diversi genotipi di HCV (Smith et al., 1997) 1000 Possibile origine dei diversi sottotipi 2 di HCV in Africa (Simmonds, 2004) 1750 Epidemia di epatite nell esercito di Napoleone in Egitto 1799 Casi di epatite associati con la vaccinazione del vaiolo 1883 Primo uso del termine Epatite 1900 Associazione fra epatite e infezione gastrointestinale 1916 Epatite da siero associata con somministrazione di immunoglobuline 1945 Comparsa dell epatite di Nuova Delhi, poi identificata come HEV 1955
5 Le Pietre Miliari nella ricerca sui virus delle epatiti (2) EVENTI ANNO Identificazione antigene Australia (HBsAg) 1963 Identificazione virus epatite B 1965 Identificazione virus epatite A 1973 Proposta dell'esistenza di un virus dell'epatite non A e non B 1975 Identificazione virus epatite D 1980 Identificazione virus epatite C 1988 Identificazione virus epatite E 1989 Introduzione dei test sierologici per l'epatite C 1990 Identificazione virus HGV/GBV-C 1995 Identificazione virus TTV 1997 Fonte: Christopher L. et al Viral hepatitis
6 Epatiti Virali infettiva A E trasmissione enterica Epatite virale NANB da siero B D F, G,? altro C trasmissione parenterale
7 Epatiti Virali - Quadro Biologico Vettore biologico feci sangue/ emoderivati fluidi corporei Via di trasmissione Tipologia delle Epatiti A B C D E oro-fecale percutanea permucosale sangue/ emoderivati fluidi corporei percutanea permucosale sangue/ emoderivati fluidi corporei percutanea permucosale feci oro-fecale Infezione cronica Prevenzione no sì sì sì no pre/postesposizione immunizzazione pre/postesposizione immunizzazione screening delle donazioni; valutazione del rischio comportamentale pre/postesposizione; Immunizzazione, Valutazione del rischio comportamentale igiene ambientale; potabilità idrica
8 Epatite C (HCV) L HCV, un piccolo virus appartenente alla famiglia delle Flaviviridae, è stato identificato nel 1988 mediante clonazione molecolare da un campione di sangue di paziente infetto E ritenuto il principale responsabile delle epatiti che venivano precedentemente definite non-a non-b. Il virus non può essere coltivato in vitro in maniera riproducibile e ciò ha ostacolato le ricerche
9 Virioni di HCV Fonte: EASL Consensus Statement (J. Hepatol. 1999, 30, )
10 The Flaviviridae Phylogenetic tree of the NS3 helicase sequences GBV-A GBV-C/HGV GBV-B Flaviviruses 100 Pestiviruses Hepaciviruses (Hepatitis C viruses) Fonte: EASL Consensus Statement (J. Hepatol. 1999, 30, )
11 Epatite C (HCV) VARIABILITA La caratteristica forse più importante dell HCV è la grande variabilità della sequenza genomica. Sulla base di questa eterogeneità genetica, gli isolati virali che maggiormente differiscono nella sequenza genomica sono stati suddivisi in sei genotipi (1-6). All interno di ogni genotipo sono stati successivamente raggruppati in numerosi sottotipi, più di 90. Recentemente (Mitchell et al, 2002) è stato proposto di aggiornare la classificazione, aggiungendo i genotipi 7, 8, 9 (Vietnam e Thailandia, dapprima classificati come non 1-4 ) e 10 (molto simile al 3a)
12 Albero filogenetico degli HCV 2(I) 4a(E) 4a(B) 4c 4e 4g 4h 4f 4d 5a a 6a 6b 7c/NGII/VII f c b e d a b f d 7b 7d c 7a e 11a g n m NGI 1c(E) 1(I) 1b 1 3 h i 9a 9b j k l 9c 8a 8b 1c(O) 1(II) 1(a) 3c 3e 3d 3f 3b 3(VI) 3a 3(III) TD3 10a (Simmonds, 1999; mod.)
13 Epatite C: quasispecie La natura di quasispecie dell HCV costituisce un fattore di grande importanza nella storia naturale dell infezione da HCV. La quasispecie è definita come una popolazione eterogenea di virioni ciascuno dei quali può differire dall altro anche solo per una mutazione puntiforme del genoma. Solitamente, in un singolo soggetto con infezione primaria predomina una popolazione di virus omogenea dal punto di vista genetico. Sotto la pressione della risposta immunitaria dell ospite essa può modificarsi nel corso del tempo, portando all emergenza di una o più popolazioni virali che, a seguito della modificazione genetica, abbiano ottenuto un "vantaggio" in termini di sopravvivenza della specie.
14 Origine della quasispecie di HCV Il genoma di HCV è costituito da un filamento di RNA a polarità positiva singolo Il filamento intermedio replicativo, a polarità negativa, è sintetizzato da un enzima (RNA polimerasi-rna dipendente) privo dell attività di correzione della sintesi Questo difetto causa la formazione popolazione di HCV, simile ma distinta: di una una quasispecie O.E. Varnier (Microbiology upgrade)
15 Varianti dell HCV E importante sottolineare che la quasispecie nasce prima ancora che il virus venga sottoposto a stress dovuti alla pressione selettiva del sistema immunitario o dei farmaci antivirali. La quasispecie di HCV può avere conseguenze biologiche importanti, fra cui : incapacità dell individuo di reagire al virus aumento delle resistenze all interferone ed agli antivirali difficoltà di approntare un vaccino Recenti evidenze suggeriscono che esista un diverso tropismo da individuo a individuo correlato alla quasispecie [fegato, midollo osseo, reni, monociti/macrofagi (CD14), linfociti B (CD19) e granulociti (CD15)] O.E. Varnier (Microbiology upgrade)
16 Elementi Strutturali di HCV Envelope gp70 (E2) gp31 (E1) Proteine del Capside Core (p21) RNA
17 Struttura Genomica della frazione UTR di HCV Regione Ipervariabile Strutturale Non strutturale 5 UTR 3 UTR C E1 E2 NS2 NS3 NS4 NS5A NS5B Proteina del Core Metallo-proteasi Cofattori Replicasi Glicoproteine dell Envelope Proteasi / Elicasi omologia: % dei nucleotidi tra differenti isolati
18 Prevalenza Pandemica di HCV 5 mio 8,9 mio 7,6 mio 17,9 mio 32,2 mio 28,0 mio 59,4 mio Fonte: World Health Organization
19 Genotipi HCV: nomenclatura Simmonds 1a 1b 2a 2b 3a 3b Okamoto I II III IV Mori I II III IV V VI Cha GI GII GIII GIII GIV GV Nakao Pt K1 K2a K2b K3 Prototipo HCV-1 HCV-J HCV-J6 HCV-J8 E-b1 Tb Z6 SA3 HK1 HCV-H HCV-BK Ta EG-1 SA4 HK2 HCV-T BR36 to SA1 HK3 Isolati HCV-JK1 HCV-J1 BR33 HD10 EG-33 BU79 SA7 HK4 HCV-J4 BU74 SA11 GB80 PC GB116 GB549 GB809 Fonte: OPTION/BIO (1994): 121,1.
20 Distribuzione Geografica dei Genotipi HCV 2,3,1 1,3,2 1,2,3,4,5 1,2, ,2 1,2 1,6,2 1,3,2,5 La distribuzione geografica dei genotipi predominanti nella popolazione (donatori di sangue) in differenti contesti geografici, viene segnalata in ordine di decrescente prevalenza Fonte: C. L. van der Poel et al. (1994): Lancet 344, 1475, modif.
21 Sintomatologia da Epatite C Principali evidenze asintomatiche o subcliniche Periodo di Incubazione: 4-8 settimane di media (intervallo compreso da 2 a 26 settimane) Sintomi: affaticamento, letargia, nausea epatosplenomegalia, malessere epatico ittero Malattia epatica scompensata: edema tissutale (es. ascite) sanguinamento gastrointestinale setticemia Malattia cronica epatica: fibrosi cirrosi carcinoma epatocellulare
22 Categorie di Rischio per Infezione da HCV RISCHIO Tossicodipendenti da droghe iniettabili Pazienti dializzati Emofilici Emotrasfusi Categorie a basso rischio: Operatori del settore sanitario esposti al contatto con materiali biologici infetti Neonati provenienti da madri sieropositive (rischio più elevato se la madre è sieropositiva da HIV) Partner sessualmente attivi (rischio più elevato se il partner è sieropositivo da HIV) Persone a stretto contatto con pazienti con infezione in fase acuta
23 Efficiency of HBV and HCV Transmission Exposure HBV HCV Transfusion Injecting drug use Perinatal Needlestick Sexual Mucous membrane ++ +/- Non-intact skin + +/- Intact skin - -
24 Protocolli Diagnostici per HCV Screening: ALT EIA o altro Conferma: LIA (Line Immune Assay) RIBA (Recombinant ImmunoBlot Assay) PCR Qualitativa Paziente / Monitoraggio della Terapia: PCR Quantitativa ALT
25 Procedure Diagnostiche Test Specifici (indiretti) Indagini sierologiche di rilevazione anticorpale anti-hcv Test di screening anticorpali anti-hcv (EIA, PA, ecc...) Test di sierologia supplementare/conferma (LIA, RIBA)
26 Procedure Diagnostiche Test Specifici (diretti) Indagini molecolari che rilevano, stimano e/o caratterizzano il genoma di HCV RNA presente nel campione in esame a) Test qualitativi per ricerca di HCV RNA b) Saggi quantitativi per quantificazione dei livelli di HCV c) Determinazione del genotipo virale
27 Procedure Diagnostiche Test Para-Specifici Enzimi Epatici, ALT o AST (alanina o aspartato transaminasi) presenti a titoli elevati in caso di danno agli epatociti, forniscono indicazioni di sofferenza epatica (non necessariamente associata ad infezione virale) solitamente fluttuanti in corso di infezione da HCV normalmente espressi con valori compresi tra 0 e 45 U/ml circa metà dei pazienti con epatite cronica da HCV, istologicamente confermata, presentano livelli di ALT nella norma o prossimi ad essa
28 HCV: diagnostica indiretta Test Supplementare (LIA, RIBA 3 a generaz.) Evidenzia: anticorpi anti-core (c22) anti-e/ns1 (envelope) anti-ns3 (c33c) anti-ns4 (c100-3, 5-1-1) anti-ns5 (RNA polimerasi)
29 Core E 1 E 2 NS 2 NS 3 NS 4 NS 5 Test Specifici HCV - RIBA Control C100-3 C33-C C22-C SOD POS NEG POS IND IND
30 Andamento dei marcatori dell HCV ALT Anti-c100 Anti-c33 Anti-c22 HCV-RNA INFEZIONE MALATTIA GUARIGIONE
31 HCV: diagnostica indiretta GIUDIZI DIAGNOSTICI 1) Screening positivo / Test Supplem. negativo Infezione da HCV improbabile: si consiglia un controllo fra 4-6 mesi 2) Screening positivo / Test Supplem. indeterminato Possibile infezione da HCV: si consiglia la ricerca del genoma virale (HCV-RNA) 3) Screening positivo / Test Supplem. positivo Infezione da HCV pregressa o in atto: si consiglia la ricerca del genoma virale (HCV-RNA)
32 Procedure Diagnostiche: Test Specifici Diretti Indagini molecolari che rilevano, stimano e/o caratterizzano il genoma di HCV RNA presente nel campione in esame a) Test qualitativi per ricerca di HCV RNA b) Saggi quantitativi per quantificazione dei livelli di HCV c) Determinazione del genotipo virale
33 Test per la Ricerca di HCV RNA Qualitativo LightCycler con Hybr. probes COBAS AMPLICOR HCV National Genetics Institute SUPERQUANT assay (NGI) home-brew RT-PCR Quantitativo LightCycler con Hybr. Probes (range: 5.3 x x UI/ml) COBAS AMPLICOR HCV MONITOR (range: 6 x x 10 5 UI/ml) Bayer/Chiron QUANTIPLEX bdna assay National Genetics Institute SUPERQUANT assay (NGI) home-brew RT-PCR
34 Genotipizzazione dell HCV tramite sequenziamento degli acidi nucleici (reazione di Sanger) 5 NC Amplicon Roche AMPLICOR HCV MONITOR TM 5 NC Amplicon LightCycler Sample preparation Purification Sequencing reaction CLIP Sequencing / TRUGENE HCV 5 NC Sequencing detection Long-ReadTower GeneObjects Sequencing analysis Gene Objects / HCV 5 NC GeneLibrarian TRUGENE HCV 5 NC report (Type/Subtype/Isolate/accession number)
35 La PCR
36 DNA Target
37 Primer down Primer up 5
38 Taq Polymerase
39 Amplicon
40
41 [amplicon] La PCR cresce esponenzialmente Numero di cicli
42 Perchè nasce la PCR quantitativa?
43 [ amplicon ] Perchè la PCR NON cresce esponenzialmente! Vari fattori limitano la crescita esponenziale Numero di cicli
44 [ amplicon ] Quantità diverse di Target all inizio della PCR generano curve parallele ma traslate in numero di cicli Numero di cicli
45 [ amplicon ] In una PCR con misurazione end-point (Amplicor, DEIA, gel di agarosio) la quantità di amplicon rilevato non è proporzionale alla quantità di target iniziale Numero di cicli
46 [ amplicon ] In una PCR con misurazione Real Time il numero di cicli necessario per raggiungere un certa quantità di amplicon è proporzionale alla quantità di target iniziale Soglia di rilevamento Numero di cicli
47 FRET 495nm Fluorescence Resonance Energy Transfer LC-640 FLU LC-705 La distanza fra le due sonde è cruciale!
48 Maccanismo di azione delle Hyb. Probe
49 Meccanismo di azione delle Hyb. Probe
50 LigthCycler
51 Capillare
52 Caricatore
53 Ventola
54 Ottica
55 Obiettivi Messa a punto di un sistema di quantificazione di HCV RNA: accurato rapido in grado di identificare tutte le specie di HCV dotato di una buona riproducibilità Tipizzazione diretta degli ampliconi di HCV prodotti con la real time PCR
56 Studio campioni di plasma di pazienti HCV positivi in follow up (periodo: Ott Set 2004) HCV quantitativa: single step real time RT-PCR con LightCycler (LC) e tecnologia FRET tipizzazione: sequenziamento di ampliconi purificati
57 HCV quantitativa: caratteristiche Elaborazione e memorizzazione di una curva di calibrazione standard mediante diluizioni scalari 1:10 di plasma umani di riferimento certificati dall OMS: HCV Accurun 305 ( UI/ml) o Accurun 405 ( UI/ml), BBI Dosaggio quantitativo di HCV RNA in campioni clinici basato sull amplificazione di un singolo standard di riferimento ( or UI/ml), interpolato con la curva standard memorizzata Soglia teorica: 53 UI/ml
58 Primer e sonde utilizzate per HCV Tipo di Posizione Temp. di Sequenza nucleotidica sonda melting KY80s AgCgTCTAgCCATggCgT C KY78s CAAgCACCCTATCAggCAgT C HCV 3FL gcagcctccaggacccccc X C HCV 5LC LC640-CCCgggAgAgCCATAgTggTCTg p C
59 Curva di calibrazione per LightCycler con lo standard UI/ml (1)
60 Curva di calibrazione per LightCycler con lo standard UI/ml (2) 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 IU/ml log 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E calculated IU/ml 0,000E+00 1,681E+02 1,737E+03 1,684E+04 1,698E+05 Accurun HS (BBI) 0,0E+00 1,7E+02 1,7E+03 1,7E+04 1,7E+05 standard dilutions
61 Dosaggio quantitativo di HCV RNA in LC: risultati Carica virale: range dinamico osservato min 5.7 x 10 1 UI/ml; max 2.5 x 10 9 UI/ml Riproducibilità del crossing point dello standard: Accurun UI/ml UI/ml N di esperimenti 80 (Ott 02 Ago 03) 107 (Ago 03 Set 04) Media inter-assay: ( ) ( ) Mediana : DS : CV : 3.55 % 4.78 %
62 n. of samples Distribuzione della carica virale nei pazienti in follow up HCV viral loads IU/ml log ,0E+01 1,0E+02 1,0E+03 1,0E+04 1,0E+05 1,0E+06 1,0E+07 1,0E+08 1,0E+09 IU/ml log
63 HCV: genotipizzazione 266 ampliconi purificati con trattamento termochimico (PCR Purification, DiaTech) Tipizzazione di 35 differenti sottotipi di HCV con un kit commerciale (TruGene HCV genotyping assay) e un sequenziatore automatico (OpenGene DNA, Visible Genetics inc., Bayer) Valutazione della temperatura di melting per ciascun genotipo possibile tipizzazione?
64 Distribuzione dei genotipi di HCV HCV genotypes distribution 50,0 45,0 40,0 35,0 30,0 36,1 30,8 % of samples 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 5,3 8,6 0,8 4,1 0,4 0,8 0,8 2,3 6,0 3,0 1 1a 1b 1c 2 2a 2b 2c 2d 3 3a 4 4a 4e 5a 0,4 0,4 0,4 genotypes 1 1a 1b 1c 2 2a 2b 2c 2d 3 3a 4 4a 4e 5a % of genotypes 5,3 8,6 36,1 0,8 30,8 4,1 0,4 0,8 0,8 2,3 6,0 3,0 0,4 0,4 0,4
65 Temperatura di melting e genotipi di HCV (su n 112 campioni periodo Ott 2002 Mag 2003)
66 Conclusioni Il dosaggio quantitativo di HCV RNA con LightCycler è: accurato riproducibile in grado di quantificare tutta la quasispecie di HCV cost/effective rapido Questioni aperte: La PCR su LC ha la stessa efficienza per tutti i genotipi di HCV? Potrebbe essere possibile tipizzare direttamente su LC (temp. di melting) usando differenti sonde in differenti posizioni?
67 Decorso diagnostico nella Epatite C Acuta RNA-PCR ALT IgM anti-core anti-core/ns3 anti-ns settimane anni sintomatologia Epatite Acuta
68 Decorso diagnostico nella Epatite C Cronica RNA-PCR ALT anti-hcv-eia // IgM // 6 settimane anni sintomatologia Epatite Acuta CAH CPH CAH Cirrosi /HCC
69 Algoritmo diagnostico per le infezioni da HCV EIA per Anti- HCV Negativo (non reattivo) STOP Positivo (ripetizione) RIBA per Anti-HCV oppure Negativo RT-PCR per HCV RNA Negativo Indeterminato Positivo Positivo STOP Ulteriori Indagini di Laboratorio (PCR, ALT) Valutazione Clinica (eventuale genotipo) PCR negativa, ALT normale PCR positiva, ALT alterata Fonte: MMWR 1998;47 (No. RR 19) modificato da L. Tagliaferro
70 Progressione Clinica della Infezione da Epatite C 20-25% Epatite C Acuta (100%) 75-80% Anittericità, spesso asintomaticità clinica 20-30% Remissione Totale 70-80% HCV-Persistenza 40-60% Epatite C Cronica Cirrosi 20-30% Portatore HCV Asintomatico Carcinoma Epatocellulare anni
71 Considerazioni finali Probabilmente il virus dell Epatite C esiste ed infetta l Uomo da molto tempo Ciò che conta oggi è che rappresenta una sfida drammaticamente attuale e più diffusa di altre patologie infettive più blasonate Le moderne scienze bio-mediche, se ben coordinate, potranno senz altro raggiungere il traguardo finale
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