Prenatal BoBs : una nuova tecnologia per l analisi rapida di aneuploidie e sindromi da. diagnosi prenatale

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1 Prenatal BoBs : una nuova tecnologia per l analisi rapida di aneuploidie e sindromi da microdelezione e microduplicazione in diagnosi prenatale Bertinoro, 19 ottobre 2013 Liturri Olimpia

2 TREND DEGLI ULTIMI ANNI: TEST RAPIDI SU CAMPIONI FRESCHI FISH su Amniociti non coltivati QF-PCR Su campioni freschi: esclusione rapida (24-36h) di aneuploidie dei chr 13, 18, 21, X e Y che rappresentano circa il 70% degli sbilanciamenti cromosomici fetali Grati et al. 2010

3 In alcuni Paesi QF-PCR è applicata come sola analisi nei casi con AMA e aumentato rischio dopo screening biochimico (Hills et al, 2010) Hills et al, 2010 QF-PCR viene applicata con funzione anticipatoria, per controllare l ansia materna, di un risultato che arriverà, più completo, col cariotipo in media 15gg dopo QF-PCR in sostituzione del metodo diretto nell analisi dei villi coriali: con questo approccio citogenetico incompleto si può incorrere in falsi negativi dovuti a: Nei casi con cariotipo femminile non si ha la certezza di analizzare metafasi di origine fetale Si può incorrere in Falsi negativi citotrofoblasto correlati ai mosaicismi fetali veri confinati al solo Si può incorrere in Falsi negativi correlati alla mancata ricerca di UPD nei casi di mosaicismo confinato al solo citotrofoblasto Grati et al, 2006

4 TREND DEGLI ULTIMI ANNI: ANTICIPAZIONE DELLA DIAGNOSI PRENATALE NEL PRIMO TRIMESTRE 1) Esecuzione dei test screening nel 1 trimestre di 2)AUMENTO DI VILLOCENTESI è possibile riconoscere sbilanciamenti cromosomici nel cariotipo fetale ancor prima che segni ecografici specifici possano essere visibili (anche dopo un ecografia dettagliata) o nei casi in cui siano presenti segni lievi e/o aspecifici (es: nella sindrome di Wolf-Hirschhorn si evidenzia solo IUGR e oligoidramnios dopo 26 w.g) consente alle famiglie di poter essere informate con largo anticipo riguardo alla salute del proprio feto e poter quindi fare un scelta riguardo all applicazione di ulteriori indagini, al futuro della gravidanza e alla pianificazione familiare. Test molecolari rapidi e con maggiore risoluzione sembrano sempre più necessari per aumentare la d.r. degli sbilanciamenti cromosomici e per ridurre il rischio residuo di anomalie cromosomiche legate alla risoluzione del cariotipo fetale.

5 Studio multicentrico Europeo per validare una nuova tecnologia, Prenatal BACs-on-Beads TM, sviluppata allo scopo di diventare una piattaforma di screening prenatale targettata nei casi senza indicazioni specifiche alla diagnosi prenatale TOMA Advanced Biomedical Assays Francesca R. GRATI, Simona DE TOFFOL, Livia MARCATO, Beatrice GRIMI, Federico MAGGI, Giuseppe SIMONI - CHI de Poissy-Saint and Germain - Hôpital Robert Debré Francois VIALARD, Denise MOLINA-GOMES, Azedine ABOURA, Christelle LE SCIELLOUR, Fabrice BRU, Dept of Obs/Gyn, North Bronx Healthcare Network, Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University, Bronx, New York Susan GROSS (design)

6 Tecnologia BACs-on on-beads (BoBs BoBs) e una tecnologia di Array in sospensione che utilizza microsfere/biglie Luminex marcate in fluorescenza con tecnologia xmap. Ogni biglia è adesa con DNA amplificato con i BAC e può avere una differente molecola sulla sua superficie. Ognuna di queste biglie contiene una diversa miscela di due fluorocromi (rosso e infra rosso) che ha un ben definito spettro di emissione InfraRed Dye Red Dye

7 Ogni biglia viene analizzata singolarmente da due diversi laser dall analizzatore Luminex L interazione specifica del DNA del campione/reference con la sequenza target (BAC) viene quantificata dal sistema di rilevazione

8 Sindromi da microdelezione Range di normalità Range di normalità

9 Descrizione dei criteri adottati per disegnare il pannello di anomalie cromosomiche incluse nel kit prevalenza alla nascita relativamente elevata (1/4.000->1/ ); mortalità e/o morbidità significativa; ecografia prenatale silente o con segni lievi/aspecifici; correlazioni genotipo-fenotipo note (penetranza completa; no CNV a significato clinico incerto => counseling chiaro in virtù della conoscenza della storia naturale della patologia); elevata detection rate ( 70 70% dei pazienti mostra come meccanismo prevalente la delezione; non sono incluse sindromi causate prevalentemente da mutazioni puntiformi e difetti di metilazione; incidenza >1/3000). Seguendo questi criteri le 9 MD selezionate hanno mostrano globalmente alla nascita una frequenza di 1/1700. Esse sono: +

10 La sindrome DiGeorge 22q11.2 Deletion Syndrome Per applicare la tecnica FISH è necessario la coltura cellulare e l analisi viene effettuata sui cromosomi in metafase. Il 90% dei casi di DGS è da delezione di 22q11.2. Segnalati casi con del10p13 e con del 18q La maggioranza delle delezioni sono de novo. Circa il 12% risulta da segregazioni sbilanciate di traslocazioni o da ricombinazioni di inversioni pericentriche parentali.

11 CARATTERISTICHE della tecnologia Prenatal BoBs facile esecuzione (protocollo in piastra automatizzabile, bassa quantità/qualità di DNA richiesto, colture cellulari non necessarie, elevata efficienza e processività); elevata specificità (>99%; Falsi positivi <1%); elevata sensibilità (>98%; Falsi negativi <2% e tutti correlati ai cariotipi euploidi); elevata riproducibilità (risultati solidi in virtù del confronto con due DNA di controllo); alto valore predittivo (penetranza completa ed elevata frequenza di 1/1700) elevata capacità di anticipazione diagnostica (ancor prima che i segni clinici si manifestino: elevato rapporto incidenza/prevalenza) Prenatal BoBs applicato sul DNA (da villo nativo) permetterebbe minimizzare il rischio residuo di anomalie cromosomiche anche in gravidanze a basso rischio

12 INDICATIONS FOR PRENATAL DIAGNOSIS US abnormalities Increased MSS for Down Syndrome AMA ( 35y) Maternal anxiety (<35y) Miscarriage Previous fetus with Parent carrier of a chr abn Other Unknown n cases included Prenatal BoBs studio mondiale n cases analyzed % Overall abnormal results (aneuploidies + partial unbalances) N % detectable by karyotype Total n partial unbalances detectable by targetted FISH (based on clinical suspicion) detectable by PNBoBs only Low risk , , , High risk , , , Unknown , , , ,3 81 7, , ,9 42 3, , ,9 5 0, , , , ,3 3 2, ,6 3 8, ,1 12 9, , ,7 31 5, , Total number of cases ,2 0, Incidence of partial unbalances detectable by PNBoBs only % 1/ 95% CI 0,028-0,01502 (1/363-1/67) 0,0047-0,0157 (1/214-1/64) 0,0009-0,0297 (1/1059-1/34) 0,0025-0,0121 (1/393-1/83) 0,0009-0,0078 (1/1098-1/128) 0,0083-0,0531 (1/121-1/19) 0,0043-0,0556 (1/231-1/18) 0,0003-0,0098 (1/3240-1/102) 0,0037-0,0074 (1/271-1/135) total low risk total imbalances detectable by BoBs % 1/ 95% CI , ,0022-0,0063 (1/461-1/158)

13 Prenatal BoBs in combinazione a cariotipo fetale in gravidanze a basso rischio VANTAGGI Analisi di sbilanciamenti di zone critiche del DNA associate a patologie note, non determinate dal cariotipo fetale (Cariotipo: risoluzione è di 6-10 Mb, Prenatal BoBs: 1Mb) Utile in gravidanze senza specifiche indicazioni o nei casi in cui siano presenti segni lievi e/o aspecifici Facile esecuzione, rapidi tempi di risposta (48 48h), facile interpretazione SVANTAGGI Non consente di rilevare le poliploidie, riarragiamenti cromosomici bilanciati, mutazioni puntiformi, difetti di metilazione, anomalie cromosomiche a mosaico 30% e sbilanciamenti cromosomici di regioni non rappresentate nel kit. contaminazione materna 70% può essere fonte di diagnosi errata

14 CONCLUSIONI Il Prenatal BoBs TM non ha lo scopo di sostituire il cariotipo convenzionale in particolare se vi è un sospetto di anomali fetali in ecografia, ma può essere una valida alternativa alla FISH o QF- PCR, sia per il costo, sia per i tempi di risposta (tecnica comparabile). Prenatal BoBs TM in un corretto percoso clinico e scelto un appropriato laboratorio di riferimento può aiutare e migliorare le ansie della coppia e pianificare al meglio le cure del nascituro. Nei progetti futuri c è quello di aggiungere nuove sindromi da microdelezioni aumentando così il pannello a disposizione.

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