Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is a genetically heterogeneous group of disorders

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1 Abstract ABSTRACT Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is a genetically heterogeneous group of disorders sharing the same clinical phenotype, characterized by distal limb muscle wasting and weakness, usually with skeletal deformities, distal sensory loss and abnormalities of deep tendon reflexes; the degree of severity can vary greatly from patient to patient, even within the same family. This work focuses on the most common form of 'demyelinating' neuropathy, Charcot- Marie-Tooth 1A disease and on a technique used to detect subjects affected by this disease: the Real Time PCR. Charcot-Marie-Tooth 1A disease is caused by a 1.4 Mb duplication in the 17p11.2 chromosomal region encompassing the Peripheral Myelin Protein gene (PMP22). This region is flanked by tandem repeated sequences called CMT1A-REPs, often responsible of the unequal crossing over during meiosis; the result of the unequal crossing-over is the presence of three copies of PMP22. The PMP22 gene encodes for the Peripheral Myelin Protein 22 (PMP22); the protein play an important role in the regulation of the correct function of Schwann cells, because it seems to be a structural protein. The consequence of the over-expression of the gene has profound effects on the development and maintenance of myelin of the peripheral nerves. The routine molecular tests actually used to detect the duplication in CMT1A are: - analysis of a recombinant hot spot of 3.2 Kb by PCR; this method is useful to detect the 63% of cases of duplication; - 5 -

2 - analysis by microsatellite markers; we can use 7 different microsatellites in order to detect the 74% of cases of duplication; - analysis by FISH and PFGE; these techniques are able to detect the 100% of cases of duplication, but they need fresh blood or lymphoblastoid cells, and they take about one week or more for the results. In the last years, the advent of Real Time PCR allowed to determine the PMP22 gene copy number using a quantitative approach. It is a particular kind of Polymerase Chain Reaction that uses a couple of primers, the Taq polymerase, and a double labelled probe. In our study 100 CMT1A patients and 70 normal controls were tested in parallel for PMP22 gene and RNAse P gene; Rnase P is an housekeeping gene existing in single copy in the human genome. In our analysis we used the comparative method of threshold cycle ( Ct). We analyzed the threshold cycle of each sample both for the PMP22 gene and RNase P gene; comparing these data with those obtained for a calibrator sample (diploid) we could obtain the gene copy number for each single sample. This technique is sensible and specific in 100% of cases; it is fast and minimizes diagnosis cost. With the application of Real Time PCR it is possible to detect 100% of cases of duplication: this method requires a run of only 1 hour and 30 min and it has a great advantage: the screening of 50 different samples in the same time. The values obtained for duplicated samples are: 1.51±0.22 SD for duplicated samples; 0.96±0.11 SD for normal samples. The most important evidence is that there is no overlap between the values of duplicated and normal samples

3 In conclusion, Real Time PCR is a simple, fast and sensitive method to detect 17p11.2 duplication in patients affected by Charcot-Marie-Tooth disease

4 Riassunto RIASSUNTO La malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) fu descritta nel 1886 da tre medici: Jean- Martin-Charcot, Pierre Marie e Howard Henry Tooth; essa include un grande gruppo di neuropatie che riguardano il sistema nervoso periferico. È la più frequente neuropatia periferica ereditaria con una prevalenza di 1:2.500 nati e una penetranza del 100%. Si divide in due forme cliniche principali: la CMT1, forma demielinizzante e CMT2, forma assonale. È caratterizzata da: ipotrofia e debolezza muscolare prevalentemente localizzata a livello distale degli arti inferiori (distribuzione peroneale), simmetrica, a decorso lentamente progressivo, generalmente accompagnata da ipo/areflessia osteotendinea, ipoestesia superficiale e profonda, piede cavo e dita a martello. L ereditarietà può essere: autosomica dominante, autosomica recessiva. X-linked. Relativamente frequente è l evenienza di mutazioni di nuova insorgenza. La forma più comune è la CMT di tipo 1A determinata dalla duplicazione di una regione genica di 1.4 Mb sul cromosoma 17p11.2 contenente il gene che codifica per la Proteina della Mielina Periferica (PMP22). La PMP22 non è l unico prodotto proteico del gene: dallo splicing alternativo, infatti, deriva anche la proteina GAS3, con differente terminazione 5, che si esprime a livello dei fibroblasti. La PMP22 è una proteina localizzata a livello del Sistema Nervoso Periferico; è parte integrante della membrana delle cellule di Schwann da cui è prodotta, dove forma l impalcatura per la mielina. Nella maggior parte dei casi di CMT il difetto genetico che determina l insorgenza della patologia trova la causa nel verificarsi di un crossing-over ineguale dei cromosomi durante la meiosi; ciò è dovuto alla presenza di regioni ad elevata omologia costituite da 8

5 sequenze ripetute in tandem e denominate CMT1A-REP. Il verificarsi del crossing over ineguale determina la duplicazione di una regione di 1.4 Mb, fiancheggiata dalle regioni fortemente omologhe: il prodotto di tale crossing-over darà luogo a un allele normale e un allele che presenta la regione contenente il gene per la PMP22 in duplice copia, con conseguente presenza di tre copie totali del gene. L over-espressione del prodotto proteico è causa di processi di demielinizzazione-rimielinizzazione della cellula di Schwann con formazione di onion bulbs, ovvero di processi citoplasmatici delle cellule iperplastiche, osservati alla biopsia dei nervi. Attualmente esistono diverse tecniche che consentono di determinare la duplicazione nella malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 1A: - l analisi dell hot spot ricombinante che porta alla formazione di un frammento giunzionale di 3.2 Kb mediante PCR, test rapido e valido, ma in grado di identificare la duplicazione solo nel 63% dei casi; - l analisi mediante microsatelliti, che consente di individuare il 74% dei casi di duplicazione; - la FISH (Fluorescence in Situ Hybridization) e la PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresys) che sono, invece, in grado di evidenziare la duplicazione nel 100% dei casi. 100%. L informatività delle prime due tecniche citate, anche se coniugate, non raggiunge il Negli ultimi anni l avvento della Real Time PCR ha consentito, invece, di poter stabilire metodi in grado di evidenziare la duplicazione nel 100% dei casi come per la FISH e la PFGE. La Real Time PCR si basa sulla presenza di due primer (forward e reverse) e di una sonda dotata di due marcature fluorescenti alle estremità 5 e 3. La sonda rappresenta l elemento innovativo su cui si basa la tecnica: con il procedere dell amplificazione, 9

6 infatti, essa emette fluorescenza solo se viene degradata dall azione esonucleasica della Taq polimerasi dopo essersi correttamente legata alla regione complementare del DNA in analisi. La reazione avviene in parallelo per il sistema relativo alla PMP22 e per un gene housekeeping sicuramente presente in copia singola nel genoma, nonché ubiquitariamente espresso. La presenza di quest ultimo è fondamentale per l analisi di quantizzazione in Real Time, poiché consente di avere un riferimento di numero di copie geniche. Il calcolo del numero di copie geniche viene effettuato secondo il Metodo Comparativo del Ct che richiede l utilizzo di un controllo sano (diploide) come calibratore in ogni reazione di amplificazione. Il tempo richiesto per la reazione di Real Time PCR è di 1 ora e 30 minuti, a differenza di FISH e PFGE che richiedono tempi notevolmente più lunghi, con l ulteriore evidente beneficio di poter effettuare corse per 50 campioni contemporaneamente. Il lavoro qui descritto ha stabilito il genotipo di 100 pazienti CMT1A e 70 controlli utilizzando la Real Time PCR secondo il metodo comparativo del Ct. Nei pazienti CMT1A il calcolo del numero di copie geniche ha dato un valore medio di 1.51 con una deviazione standard di 0.22; per i controlli il valore medio è di 0.96 con una deviazione standard di E molto importante notare che non abbiamo ottenuto alcun valore di sovrapposizione tra i pazienti e i controlli sani. Un precedente lavoro compiuto presso il CNR Istituto di Scienze Neurologiche di Mangone (CS) - ha consentito di stabilire che la Real Time PCR, applicata alla diagnosi della malattia di Charcot-Marie-Tooth 1A, risulta un valido strumento per l individuazione di tutti i pazienti portatori di duplicazione del gene per la PMP22. Il nostro studio conferma quanto stabilito nel lavoro precedente e sottolinea ulteriormente la validità della tecnica. 10