Ossidazione di eteroatomi da parte di CYP450

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1 Ossidazione di eteroatomi da parte di CYP450 Composti solforati (S-ossidazione): Mercaptani alcoli Tioeteri solfossidi ( solfoni) Solfossidi solfoni Gli intermedi R-S-OH (acidi solfonici) sono reattivi, potenzialmente tossici. Reazioni catalizzate anche dalle monoossigenasi flaviniche (FMO): comprendono 5 enzimi microsomiali che richiedono NADPH e O 2 e catalizzano ossidazione di eteroatomi (N, S, P). 85

2 N-ossidazione Reazioni catalizzate da CYP450 e/o monossigenasi flaviniche (FMO) Formazione di N-ossidi. P450: N ricchi di elettroni (piridine, chinoline); FMO: N poveri di elettroni (amine terziarie) Formazione di N-idrossilamine: amine aromatiche primarie e secondarie. Le N- idrossilamine possono essere O-coniugate con gruppi acetile o solfato uscita di di gruppi acetossi o solfato ioni nitrenio reattivi metaboliti cancerogeni. Le N- idrossilamine aromatiche possono anche essere ossidate a nitroso- e nitro-composti 86

3 Reazioni di riduzione di chinoni La cancerogenità del benzene e degli idrocarburi aromatici in genere (fenoli e idrochinoni e di tutti gli intermedi di ossidazione a chinone) può almeno in parte essere attribuita alla formazione di idrochinone radicalico e chinone in seguito a doppia ossidrilazione da parte del CYP450, successiva formazione del radicale idrochinonico per opera di perossidasi e infine autossidazione a chinone con produzione di anione radicale superossido (O 2.- ). Altro esempio: effetti tossici del paracetamolo. 87

4 N-dealchilazione (amine alifatiche primarie e secondarie): catalizzata solo da CYP450 La dealchilazione di ammine 2 e 3 rispettivamente ad ammine 1 e 2 è una delle più frequenti ed importanti reazioni metaboliche. Comporta l estrazione di un e- dal N o di un protone dal carbonio in a (in tal caso si ha idrossilazione del C-alfa e quindi dealchilazione con formazione dell aldeide o chetone. Si formono così prodotti più polari (facilmente eliminabili). N-dealchilazione di nitrosammine La formazione di nitrosoamine può avvenire in vivo, a partire da amine e nitriti, catalizzata dal ph acido dello stomaco. I nitriti si formano già nella saliva dai nitrati presenti negli alimenti come conservanti (affettati, carne): 88

5 Ossidazione delle idrazine (NH 2 -NH 2 ) L ossidazione delle idrazine (NH 2 -NH 2 ) forma composti instabili che decompongono con formazione di cationi (o radicali) acetili cancerogenesi, epatotossicità. Metaboliti tossici delle reazioni di dealogenazione La dealogenazione riduttiva di CCl 4 ed altri idrocarburi alogenati ha come intermedio il radicale CCl 3. perossidazione lipidica Si formano inoltre altri metaboliti tossici, come il fosgene tossicità epatica e renale Nella terapia dell avvelenamento da CCl 4 si somministra O 2 iperbarico per inibirne la capacità del CYP2E1 di metabolizzare CCl 4 a CO 2. 89

6 Metabolismo dell Alotano E un anestetico per inalazione eliminato per espirazione (80% della dose) e 20% dal CYP2E1 e CYP2B4. Dealogenazione ossidativa formazione di cloruro di trifluoroacetile addotti proteici formazione di neoantigeni epatite immuno-mediata nell uomo (e nella cavia) da autoanticorpi ad un esposizione successiva. Dealogenazione riduttiva radicale perossidazione epatotossicità diretta, con severità specie-dipendente (severa nel ratto, lieve nella cavia) Rara, si manifesta dopo esposizione ripetuta. Sensibilizzazione crociata con enflurano e forse altri anestetici alogenati l enflurano causa epatotossicità in soggetti precedentemente esposti ad alotano 90

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8 Deaminazione ossidativa E la stessa reazione catalizzata dalle MAO Nell uomo, esistono 60 o più enzimi CYP450, che differiscono, parzialmente, per specificità, induttori, inibitori. Membri della stessa sotto-famiglia possono avere omologia di sequenza fino al 97%. 92

9 Nell uomo la variabilità inter-individuale è molto marcata. Negli animali da esperimento ci sono anche forti differenze legate al ceppo tossicità ceppo-specifica. Valutazione delle interazioni farmaco-farmaco: saggi in vitro Durante le ultime fasi dello sviluppo di un nuovo farmaco, è importante conoscere le interazioni che esso può avere con altri farmaci visto che la politerapia è comune nella pratica clinica. Si procede effettuando saggi in vitro su diversi campioni di microsomi epatici umani (n=50 individui, per avere rappresentazione più corretta della variabilità interindividuale). Si misura l attività metabolizzante della nostra nuova molecola di farmaco in presenza di substrati modello che sono specifici per le varie isoforme del CYP. Dopo incubazione del nuovo farmaco + microsomi + substrato di riferimento, si misura la conc. del substrato di riferimento opportunamente marcato mediante spectroscopia di massa tandem. I risultati ci permettono di stabilire se il nuovo farmaco è un induttore o inibitore di quello specifico CYP e se vi sono interazioni tra farmaci. 93

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11 Ciascun enzima è caratterizzato dai substrati metabolizzati, dagli induttori ed inibitori. Tuttavia, data la scarsa specificità dei diversi enzimi, 2 o più enzimi possono partecipare al metabolismo di un singolo xenobiotico. Isoforme diverse (es. CYP2A1 e CYP3A4) possono metabolizzare lo stesso substrato. 95

12 In molti casi predomina il metabolismo operato da una forma enzimatica. Il contributo delle varie isoforme dipende dai valori di Km e Vmax. CYP e metabolismo dei farmaci Scarsa selettività in vitro un farmaco può essere metabolizzato da più CYP Tuttavia, gli studi su individui con fenotipo cattivo metabolizzatore per un determinato CYP hanno mostrato che per molti farmaci in vivo il metabolismo è catalizzato in modo predominante da un solo enzima, che controlla quindi la velocità di eliminazione. Ciò è dovuto alle diverse Km e Vmax dei vari enzimi 96

13 Variabilità del CYP450 97

14 Farmacogenetica La farmacogenetica studia le variazioni inter-individuali nella sequenza del DNA in relazione alla risposta ai farmaci. L'applicazione pratica delle conoscenze, provenienti dalla ricerca in farmacogenetica, consiste nella possibilità di predire la risposta di un paziente ad un certo farmaco sulla base di un test genetico di routine, per arrivare ad un individualizzazione della terapia, "il farmaco giusto al paziente giusto". I test del DNA, basati su queste variazioni genetiche, possono predire come un paziente risponderà a quel particolare farmaco. I clinici potranno utilizzare questa informazione per decidere la terapia ottimale e per personalizzare il dosaggio; i benefici consisteranno in una ridotta incidenza di reazioni avverse, in migliori esiti clinici ed in costi ridotti per il sistema sanitario nazionale. Questi test rappresentano il primo passo verso terapie paziente-specifiche. Profilo genetico e variabilita della risposta Un farmaco, quando entra nell organismo, si distribuisce al suo interno e a questo punto può essere metabolizzato, attivato, coniugato (cioè legato ad altre molecole) e infine escreto. Si supponga, per esempio, che un certo farmaco, per avere effetto, abbia bisogno di essere metabolizzato e poi trasportato, tramite un recettore, all interno della cellula. Si supponga inoltre che, semplificando un processo molto più complesso, metabolismo e trasporto siano controllati uno stesso gene che può essere polimorfico. In questo caso la variabilità di risposta sarà determinata dalle diverse varianti di questo gene. Si potranno avere individui: A) con entrambi gli alleli normali (indicati come wt/wt = wild type, selvatico): metabolizzano rapidamente e hanno una concentrazione media di farmaco nel sangue piuttosto bassa B) con un allele mutato e sono quindi eterozigoti (wt/m), metabolizzano più lentamente e hanno una concentrazione plasmatica di farmaco più alta C) con entrambi gli alleli mutati (m/m) e hanno concentrazioni elevate di farmaco nel plasma D) con copie multiple del gene nella sua forma normale, metabolizzano molto rapidamente e hanno concentrazioni plasmatiche bassissime del farmaco per cui c è assenza di effetto farmacologico. 98

15 Classificazione dei soggetti Si possono avere, in generale, 4 fenotipi: Metabolizzatori lenti (PMs): soggetti omozigoti per l allele che codifica per un enzima inattivo o a bassa attività. Metabolizzatori intermedi (IMs): soggetti eterozigoti per un allele che provocano una ridotta attività dell enzima; osservabile solo se nessuno dei due alleli è dominante Metabolizzatori estensivi (EMs): soggetti omozigoti per l allele che codifica per l enzima con attività normale. Metabolizzatori ultrarapidi (UMs): soggetti che presentano copie multiple di un gene (dominante ereditario) Fattori genetici possono influenzano l effetto dei farmaci: enzimi farmaco metabolizzanti, trasportatori dei farmaci, recettori, canali ionici. L alterazione genetica che determina un alterata risposta al farmaco generalmente rimane stabile all interno di un individuo per tutta la vita Polimorfismi di CYP450 ed effetti avversi ai farmaci Le forme polimorfiche di CYP450 sono responsabili dello sviluppo di un numero significativo di reazioni avverse ai farmaci. Il 59% dei farmaci più citati in studi che esaminavano reazioni avverse erano metabolizzati da enzimi polimorfici di fase I. Il 44% dei farmaci che danno reazioni avverse sono metabolizzati da un enzima con una variante allelica responsabile di dar luogo a metabolismo lento. Phillips et al. (2001) J. Am. Med. Assoc. 286, Farmacogenetica CYP e successo farmacoterapeutico A causa del polimorfismo il numero dei non-responders ad una terapia farmacologica è alto e sembra rappresenti il 30-60% dei soggetti trattati con farmaci. La variabilità individuale nella risposta al trattamento farmacologico costituisce uno degli aspetti più rilevanti nella pratica clinica essendo responsabile di fallimenti terapeutici e di reazioni avverse che a loro volta, oltre a danneggiare il paziente, possono causare ricoveri prolungati e aumento dei costi sanitari. 99

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17 Polimorfismo del CYP2D6 (polimorfismo di idrossilazione della debrisochina) Il primo indizio derivò dall osservazione che le concentrazioni plasmatiche di alcuni antidepressivi triciclici presentavano una variabilità interindividuale di più di 30 volte, a parità di dose/kg somministrata. Inoltre, alcuni pazienti sembravano appartenere ad una popolazione distinta, dal punto di vista farmacocinetico. Successivamente, si osservò che una certa percentuale di individui aveva una deficienza nel metabolismo ossidativo della debrisochina (un anti-ipertensivo simile alla guanetidina). Queste due reazioni enzimatiche sono catalizzate dal CYP2D6, che catalizza anche l ossidazione di alcuni antidepressivi triciclici. Il CYP2D6 presenta numerose varianti (polimorfismi); attualmente ne sono state identificate almeno 68, e alcune di queste codificano per enzimi che possiedono una differente velocità di metabolizzazione dei substrati o addirittura causano una alterazione nel normale riconoscimento del substrato specifico. Nel contesto del trattamento, queste variazioni possono influenzare la corretta determinazione della dose iniziale di molti farmaci. Per i farmaci con un ristretto profilo terapeutico e con curva dose-risposta ripida, questo deficit può dare luogo sia ad un overdosaggio che ad un incapacità di mantenere l'efficacia terapeutica. Possedere entrambi le forme del gene che conferisce scarsa velocità di metabolizzazione all enzima fa sì che quell individuo tenderà ad accumulare o ad eliminare più lentamente i substrati o i farmaci che sono maggiormente metabolizzati da questo enzima. Questi metabolizzatori lenti o poveri avranno una maggiore concentrazione a livello ematico del farmaco e generalmente un maggior effetto, a parità di dosaggio, rispetto ad individui che possiedono le forme dell enzima cosiddette normali. I metabolizzatori lenti sono più frequentemente esposti ad effetti indesiderati se trattati con dosi standard di questi composti. Tipici esempi comprendono l acidosi lattica da fenformina e gli effetti dose-dipendenti da antidepressivi triciclici e antipsicotici. Tuttavia, l equazione forma lenta del CYP = effetti avversi non è sempre applicabile. Diversi farmaci come la fluoxetina, il metoprololo o il naproxene possono essere metabolizzati da diversi tipi di CYP. Avendo quindi a disposizione diverse vie metaboliche, cioè diversi CYP, per lo stesso farmaco non è detto che siano tutte inefficienti e fattori non strettamente metabolici come altre malattie o interazioni farmaco-farmaco possono spiegare l insorgenza delle reazioni avverse ai farmaci (ADR). 101

18 CYP 2D6 Poiché molti farmaci psicotropi hanno un ristretto profilo terapeutico e le reazioni avverse sono comuni, il fatto di poter predeterminare i livelli d attività del 2D6 per i pazienti trattati con i suddetti agenti può avere un beneficio clinico significativo. Es. la nortriptilina viene somministrata alla maggior parte dei pazienti in un range di mg. Ma nei metabolizzatori poveri di CYP2D6, l'effettiva dose tollerabile è mg. Nei metabolizzatori ultrarapidi, la variazione genetica dà origine a copie multiple del gene. I pazienti con quest amplificazione genetica metabolizzano il farmaco così velocemente, che possono richiedere una dose di 500 mg, per ottenere l'effetto terapeutico. Si dovrebbe tuttavia tenere presente che molti farmaci che subiscono la biotrasformazione da parte del 2D6, particolarmente gli antidepressivi, producono metaboliti attivi, e ciò tende a complicare l'interpretazione della relazione efficacia/tossicità. Determinazione del dosaggio per pazienti in trattamento con nortriptilina La capacità metabolizzante individuale di nortriptilina si misura in base al rapporto tra le concentrazioni urinarie della debrisochina (non metabolizzato) e della 4- idrossidebrisochina (metabolita) dopo somministrazione di una singola dose. Questo rapporto è detto rapporto metabolico. In base a questo rapporto, una percentuale di individui pari al 5-10% (nei caucasici) è composta da cattivi metabolizzatori. Il polimorfismo del CYP2D6 presenta notevoli variazioni interetniche. In particolare, negli asiatici la percentuale di cattivi metabolizzatori è pari all 1%; inoltre, i buoni metabolizzatori asiatici hanno una capacità metabolica inferiore a quelle dei buoni metabolizzatori caucasici. Le popolazioni nere differiscono sia dai caucasici sia dagli asiatici. 102

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21 I polimorfismi che determinano gli alleli CYP2D6*3, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*6 si riscontrano nel 97% dei metabolizzatori lenti. L allele più comune è il CYP2D6*4 ( %), segue il CYP2D6*3 (2.7%) e il CYP2D6*5 (2.6%). Altri alleli (CYP2D6*6, CYP2D6*7, CYP2D6*8, CYP2D6*11, CYP2D6*12, CYP2D6*14, CYP2D6*20, CYP2D6*31, CYP2D6*38, CYP2D6*44), sebbene rari, sono anch essi associati ad un assenza di attivita enzimatica. 105

22 Rapporto fenotipo-etnia nel metabolismo dipendente da CYP450 Studi familiari hanno dimostrato che i cattivi metabolizzatori sono omozigoti per un gene recessivo autosomico (aa) Sono stati identificati gli alleli mutati che causano carenza del CYP2D6. L analisi del genotipo (analisi del DNA dei leucociti) consente ora di stabilire con accuratezza il fenotipo. Sono state identificate varianti geniche con duplicazione o amplificazione del gene codificante per l enzima, varianti associate a capacità metabolica ultrarapida. 106

23 Conseguenze del polimorfismo del CYP2D6 Il CYP2D6 metabolizza molti farmaci di notevole importanza clinica e con discreta tossicità potenziale: antidepressivi triciclici, antipsicotici, molti antiaritmici, β- bloccanti lipofili, oppiacei. L influenza del polimorfismo del CYP2D6 dipende dall importanza dell ossidazione catalizzata da questo enzima sull eliminazione del farmaco. I cattivi metabolizzatori corrono quindi il rischio di sviluppare effetti avversi con dosi ordinarie di farmaco. D altra parte, in soggetti con capacità metabolizzante molto rapida, dosi ordinarie possono determinare concentrazioni plasmatiche sub-terapeutiche e quindi un effetto clinico inadeguato, come nel caso degli antidepressivi triciclici. Oppure possono presentare intossicazione da morfina dopo somministrazione di profarmaco codeina poiché viene velocemente convertita a morfina. Conseguenze tossicologiche del polimorfismo del CYP2D6, non legate ai farmaci Il CYP2D6 partecipa al metabolismo di: insetticidi organofosforici atrazina (erbicida) MPTP (neurotossina che induce PD) I cattivi metabolizzatori potrebbero essere più sensibili agli effetti tossici di queste sostanze. I cattivi metabolizzatori professionalmente esposti a pesticidi sembrano avere un più alto rischio di sviluppare il morbo di Parkinson 107