Ispiratrice e fondatrice del settore di ricerca sulla mutagenesi chimica e sulla mutagenesi ambientale Studiò le sostanze che possono reagire con il materiale genico e causarne mutazioni Confrontò gli effetti mutageni delle radiazioni ionizzanti e delle sostanze chimiche. Charlotte Auerbach (1899-1994) Dai suoi primissimi esperimenti fu evidente che le mutazioni prodotte chimicamente erano principalmente mosaici somatici, mentre quelle indotte tramite radiazioni ionizzanti erano cambiamenti whole-body. Inoltre, il rapporto tra mutazioni puntiformi e mutazioni cromosomiche era differente, essendo molto più alto dopo il trattamento chimico che dopo radiazioni ionizzanti. Dimostrò l effetto mutageno del solfuro di dicloroetile = gas mostarda (C 4 H 8 Cl 2 S) 1
Shiloh, Atm And Related Protein Kinases: Safeguarding Genome Integrity. Nat Rev Cancer. 2003 Mar;3(3):155-68. DOI: 10.1038/nrc1011 Tipo di danno Intrinseco Modificazioni spontanee di basi, errori di replicazione Agenti chimici Endogeni Esogeni (radicali (mutageni liberi) chimici) Radiazioni Ultravioletti Ionizzanti Lesioni al DNA Appaiamenti errati, inserzioni, delezioni, rotture del DNA Modificazioni di basi, siti abasici, rotture del DNA Addotti di DNA, crosslink, rotture del DNA Dimeri di pirimidina, modificazioni di basi Siti abasici, modificazioni di basi, rotture del DNa Estensione del danno e severità Quantità e tipo di danno tollerabile Danno eccessivo e/o irriparabile Risposta cellulare Risposta cellulare Attivazione del network della risposta Attivazione della pathway apoptotica Conseguenze Sopravvivenza cellulare Trasformazione maligna Morte cellulare 2
mutazione gameti embrione mutazione L intero organismo porta la mutazione (in eterozigosi) organismo Area mutata Gameti dell organismo 3
Tipi di danno al DNA Spontanei: Errori durante la replicazione del DNA, errori nell appaiamento del DNA omologo durante la ricombinazione, agenti endogeni prodotti dal metabolismo cellulare come i radicali liberi. Indotti: Agenti fisici: raggi X, gamma, UV) Agenti chimici (alchilanti; inibitori sintesi dessoribonucleotidi; intercalanti) I diversi tipi di mutazioni Mutazioni geniche (o puntiformi) Mutazioni cromosomiche F Mutazioni nel numero dei cromosomi Mutazioni geniche F Mutazioni nella struttura Le mutazioni geniche o puntiformi sono dovute in gran parte alla sostituzione di una singola base nucleotidica del DNA* con un altra Altri tipi di mutazione si originano in seguito alla perdita (delezione) o alla inserzione di una base nel filamento del DNA Sostituzione Delezione Inserzione *Se la mutazione avviene RNA la conseguenza sono alcune centinaia di molecole di proteina alterata sulle migliaia di copie che esistono in ogni cellula 4
Tipi di mutazioni geniche * * purine: (A) adenina, (G) guanina pirimidine: (C) citosina, (T) timina, (U) uracile * * 5
Sostituzione di una base nucleotidica con un altra La sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno grandi sul prodotto finale (la proteina specificata da quel gene). In base alle conseguenze se ne distinguono tre tipi: mutazioni silenti mutazioni missenso mutazioni non senso Mutazioni silenti. Se in seguito alla sostituzione di una base si ottiene una tripletta che specifica per lo stesso aminoacido la proteina prodotta sarà la stessa Fino a quattro diverse triplette specificano lo stesso aminoacido (il codice genetico è degenerato) Le sostituzioni silenti riguardano la terza base del codone, quella che varia tra codoni diversi che specificano lo stesso aminoacido 6
Mutazioni missenso. aminoacido Nella maggior parte dei casi la nuova tripletta codifica per un diverso CCU GCU Prolina Alanina La proteina avrà quindi lo stesso numero di aminoacidi ma una sequenza che differisce per un aminoacido La gravità degli effetti di una sostituzione dipenderà dalla somiglianza tra l aminoacido sostituito e il nuovo e dalla posizione della sostituzione Mutazioni nonsenso. Se il nuovo codone che si forma dalla sostituzione codifica per il segnale di stop avremo una proteina più corta della precedente (dipende dal punto in cui è avvenuta la sostituzione) AAG Lisina UAG Codone di stop 7
Delezione o inserzione di una base (mutazioni per spostamento della griglia di lettura-frameshift) Talvolta l errore consiste nell inserire una base in più nella sequenza del DNA. Altre volte durante la replicazione o durante la riparazione del DNA si ha la perdita di una base In entrambi i casi la lettura di tutta la sequenza che segue viene completamente alterata A U G A G G A C U C C C G G A U U A Met Arg Thr Pro Gly Leu A (inserzione) A U G A G G A A C U C C C G G A U U A Met Arg Asp Ser Arg Iso 8
Reversione vera Reversione di codone Reversione per soppressione Reversione e soppressione soppressione interna (intragenica) soppressione esterna (intergenica) Sequenza selvatica AAC CCC AGT GAT GTC AAA Asn Pro Ser Asp Val Phe Sequenza mutata AAC CCC ACT GAT GTC AAA Asn Pro Thr Asp Val Phe Reversione vera AAC CCC AGT GAT GTC AAA Asn Pro Ser Asp Val Phe Reversione di codone AAC CCC TCT GAT GTC AAA Asn Pro Ser Asp Val Phe 9
Reversione per soppressione interna (intragenica) Reversione per soppressione esterna (intergenica) Enzima attivo Ser - Leu - Phe - Iso - Gly - Leu Enzima inattivo Ser - Leu - Phe - Iso - Arg - Leu Enzima attivo Thr - Leu - Phe - Iso - Arg - Leu 10
Mutazioni spontanee Il tasso di mutazione si può calcolare dagli effetti fenotipici delle mutazioni (usando linee di laboratorio omozigoti) Oppure si può calcolare confrontando direttamente sequenze di DNA basato sugli effetti fenotipici nei metazoi: 10-6 - 10-5 mutaz./gamete/generazione/ locus basato su confronti di sequenze di DNA: 10-9 mutaz./pos. nucleotidica/anno Notevole variabilità dimensione del gene suscettibilità (hot spots) da specie a specie La frequenza di reversione è significativamente più bassa della frequenza di mutazione in avanti Alcuni esempi: con 10-5 mutazioni per locus per generazione (una mutazione ogni 100.000 gameti) se in Drosophila ci fossero 10.000 geni funzionali, avremo una mutazione ogni 10 genomi aploidi. Una popolazione di 500.000 individui (1.000.000 di genomi aploidi) porta almeno 100.000 nuove mutazioni ad ogni generazione. 11
Teoria adattativa Teoria genetica Test di fluttuazione di Luria e Delbruck Le mutazioni nei batteri avvengono come errori spontanei, indipendenti dall agente selettivo 12
La tecnica del piastramento in replica conferma che l insorgenza delle mutazioni è un evento spontaneo e casuale che può avvenire in qualsiasi momento e colpire il genoma in qualsiasi punto (la resistenza batterica è infatti il risultato di mutazioni preesistenti) 13
Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee? 1. Tautomeria 2. Radiazioni naturali 3. Danno ossidativo 4. Errori di crossing over 5. Elementi trasponibili 6. Errori nella replicazione 1. Tautomeria: modificazioni spontanee ed occasionali delle basi del DNA (depurinazione, deaminazione) 14
2. Radiazioni naturali: F raggi X rompono lo scheletro del DNA F le radiazioni UV causano la formazione di dimeri di timina 3. Danno ossidativo 15
4. Errori del crossing over durante la meiosi 5. Destabilizzazione indotta dagli elementi trasponibili Essenziale per la trasposizione Trasposasi 16
6. Errori nella replicazione 5 -AGCTAATCGTA-3 3 -TCGATTAGCATAAAAACGAGGC-5 5 -AGCTAATCGTA-3 3 -TCGATTAGCATAAA ACGAGGC-5 A Protrusione dell elica stampo Delezione di una base nell elica nuova 5 -AGCTAATCGTATTT TGCTCCG-3 3 -TCGATTAGCATAAA ACGAGGC-5 A 6a. Scivolamento su sequenze ripetute 17
6b Incorporazione errata di una base Le mutazioni, utili per la comprensione della struttura genica 18
19
mappa genetica (o di associazione) ordine dei geni su cromosoma politenico 20
Le mutazioni per la comprensione della funzione genica Esperimento di Beadle and Tatum 21
Relazione tra genotipo e fenotipo 22
Le mutazioni possono essere recessive o dominanti Tipi di mutazioni 1. Nulle (o equivalenti) 2. Neomorfe 3. Ipomorfe 4. Ipermorfe 5. Amorfe 6. Antimorfe Espressione ectopica 23
Nelle prossime pagine: Materiale didattico facoltativo 24
1. allele nullo (o equivalente) variazione che non modificano né la quantità, né la qualità biochimica e funzionale del prodotto genico il prodotto genico risulta invariato e normalmente localizzato esempi sono le circa 12,000 differenze della sequenza del DNA codificante che si osservano nella popolazione umana che non hanno alcuna conseguenza patologica 2. allele neomorfo neomorfo (neo=nuovo) definito come causato da una mutazione che porta ad un prodotto genico nuovo o una funzione nuova si distingue solo didatticamente dall allele ipermorfo, in quanto è una variante che è difficile da distinguere nelle singole condizioni valgono le stesse considerazioni fatte per l allele ipermorfo sulla natura dominante della mutazione in alcune forme di cancro l allele neomorfo è una chimera di due geni, dovuta ad una traslocazione cromosomica, come il cromosoma di fusione Philadelphia, con la comparsa della nuova proteina bcr-abl (caso di leucemia mieloide cronica) 3. allele ipomorfo variazione della sequenza del DNA che riduce la quantità di prodotto genico e/o la sua qualità funzionale tali alleli sono silenti e recessivi e possono agire più come modificatori del fenotipo che come causa diretta di patologia alleli ipomorfi possono però essere causa di malattia se in emizigosi esempio: gli alleli ipomorfi del gene della distrofina localizzato sul cromosoma X che determinano quadri di distrofia muscolare di Becker nei maschi in quanto hanno una singola copia del gene 25
4. allele ipermorfo ipermorfo (iper= aumentato) è l allele che determina l aumentata quantità o funzione di un prodotto genico l allele ipermorfo può essere semplice o avere una combinazione di altri effetti per es., essere presente in una localizzazione impropria o in un tempo sbagliato è associato di regola ad un tratto genetico dominante, in quanto l aumentata espressione/funzione non può essere limitata dall allele non mutato un esempio è l aumentata funzione del recettore per l FGF3 (Fibroblast Growth Factor Receptor 3) che causa l acondroplasia (nanismo dismorfico) che è appunto a trasmissione autosomica dominante In achondroplasia, the mutated form of the receptor is constitutively active and this leads to severely shortened bones. 5. allele amorfo variazione di sequenza del DNA drastica: corrisponde classicamente alla delezione (cancellazione) della sequenza codificante del gene; un allele amorfo può essere prodotto da altri tipi di mutazione (per es.: possono avere la medesima conseguenza di una delezione totale del gene) in emizigosi, se colpisce una funzione genica essenziale (es emofilia, distrofia muscolare di Duchenne, etc) può essere causare di una malattia genetica l allele amorfo in eterozigosi, in genere, è presente in un portatore sano di una malattia autosomica recessiva può essere, da solo, causa di malattia se riguarda un gene in cui il 50% del dosaggio (prodotto dall allele non mutato) è insufficiente a mantenere un fenotipo normale (aploinsufficienza) 6. allele antimorfo (o dominante negativo) antimorfo (anti=contro) definito come causato da una mutazione che porta ad un prodotto genico antagonistico è il risultato di una mutazione che colpisce un gene il cui prodotto proteico funziona in cooperazione con altre proteine particolari mutazioni rendono la proteina di disturbo a tutte le altre pur essendo queste ultime perfettamente normali un esempio è dato dal collagene in cui più geni (NB: due alleli per ogni gene) contribuiscono alla formazione delle proteine ciascuno producendo una parte delle catene di base: 26 una mutazione in un solo allele produce un effetto negativo complessivo
Espressione ectopica L'ectopia (dal greco ἔκτοπος (éktopos) che è fuori di posto) è la disposizione di un gene nel punto sbagliato. Per espressione ectopica di un gene si intende l'espressione di un gene con una localizzazione differente da quella normale. L'espressione ectopica può portare in alcuni casi alla formazione di organi ectopici (per esempio nel moscerino Drosophila melanogaster. Per ottenere l'espressione ectopica di un gene si può farlo precedere da un elemento enhancer nel promotore. In questo caso si ottiene generalmente una sovraespressione ectopica, ovvero un'espressione del gene elevata in tutto l'organismo, quindi anche in tessuti e organi dove non si trova in natura. 27
Relazione tra genotipo e fenotipo: utilizzo delle mutazioni per identificare nuove funzioni proteiche selvatico Presenza di Soppressione del fenotipo photorecettori extra (mutazione in un gene (EGFR costitut. attivo) dowstream) selvatico Suppression second-site modifier screen Retina degenerata (dom. poliglutammina espanso) Soppressione del fenotipo 28