Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR, dall inglese Nuclear Magnetic Resonance) sfrutta la differenza di energia che i vari stati di spin nucleari possono assumere in presenza di un campo magnetico. La spettroscopia NMR può dare una un grande numero di informazioni sulla struttura di molecola organiche.
P = I( I +1) } } = h 2π Lo spin nucleare Molti (ma non tutti) i nuclei atomici si comportano come se ruotassero sul loro asse. Il vettore momento angolare è orientato lungo l asse della rotazione. Il modulo P del vettore P è quantizzato, e dipende dal numero quantico di spin I. Il numero quantico di spin può assumere valore 0 (in questo caso non c è spin nucleare), ½, 1,, e così via fino a 6. P ed I sono fissi per ogni nucleo e non variano mai. + I = 1/2 1 2 } 1 2 } z Però può cambiare la orientazione che il vettore momento di spin può assumere nei confronti di una direzione esterna z. Anche questa orientazione è quantizzata, ed il vettore momento di spin può assumere solo 2I+1 orientazioni (quindi 2 orientazioni per nuclei con spin ½) definite dal numero quantico di spin m. Il numero quantico m può assumere i valori -I,-I+1,.., +I-1, +I (quindi solo ½ e +½ per i nuclei con spin ½)
z Lo spin nucleare _ + h 0 h Un nucleo con spin 1 ha invece tre possibili orientazioni del momento di spin, corrispondenti a valori di m pari a 1, 0, e +1. Tuttavia tratteremo solo i nuclei con spin ½. I = 1 α + 1 2 β 1 2 z Per ogni orientazione, m rappresenta la componente del vettore P lungo z, detta P z : P z = m Per i nuclei con spin ½: lo stato di spin con m = +½ è detto stato parallelo o stato α lo stato di spin con m = ½ è detto stato antiparallelo o stato β
µ Il momento magnetico nucleare Il nucleo atomico è carico, e ogni carica in movimento genera un campo magnetico, ogni nucleo dotato di spin si comporta come un piccolo magnete, è cioè dotato di un momento magnetico µ. µ z α β µ Il momento magnetico µ è proporzionale al momento di spin e ne ha la stessa direzione: quindi il suo modulo non può variare, e può assumere solo due possibili orientazioni per un nucleo con I = ½.
Il momento magnetico nucleare P µ 1 13 C µ P La costante di proporzionalità tra il momento magnetico µ ed il momento di spin P è detta rapporto giromagnetico (o rapporto magnetogirico) ed è indicata con il simbolo γ: µ = γ P il rapporto giromagnetico γ è una caratteristica intrinseca del nucleo, è diverso da nucleo a nucleo, e non può essere previsto teoricamente, ma solo misurato. Per esempio, γ è molto maggiore per il nucleo 1 che per il 13 C. z µ La proporzionalità tra momento magnetico e momento di spin vale anche per le loro componenti lungo l asse z: µ z = γ P z = m γ P P z µ z
Nuclei in un campo magnetico B 0 µ µ z m = -1/2 B 0 stato β B 0 orientazione "antiparallela" (a maggiore energia) m = +1/2 stato α orientazione "parallela" (a minore energia) µ µ z I due stati di spin α e β di un nucleo hanno la stessa energia, a meno che il nucleo non sia in un campo magnetico. In questo caso, lo stato α assume un energia minore della stato β, ed è possibile pensare a un tipo di spettroscopia che sfrutta il passaggio tra gli stati α e β del nucleo. Questo tipo di spettroscopia è detta spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)
Nuclei in un campo magnetico L energia di un nucleo in un campo magnetico è data dall interazione tra momento magnetico e campo magnetico esterno: E = µ B 0 Questo prodotto scalare può essere anche scritto: E = µ zb 0 dove ricordiamo che µ z è la componente del momento magnetico µ lungo l asse z del campo magnetico. Poiché come abbiamo visto µ z = m γ E = mγb 0 Per un nucleo con I = ½, m puo essere +½ o ½, per cui i due suoi possibili livelli energetici sono: E+ ½ = ½γB 0 e E ½ = + ½γB0 La differenza di energia tra i due livelli nucleari è: E = γb 0 e la frequenza di assorbimento è: E γb0 γb ν = = = 0 h h 2π
Nuclei in un campo magnetico È importante notare che mentre nella spettroscopia UV e IR la differenza di energia tra i due stati elettronici o vibrazionali è fissa, e dipende solo dalla struttura della molecola, nell NMR la differenza di energia tra gli stati nucleari è indotta dal campo magnetico esterno, e può quindi essere variata. E m = -½ E 1 E 2 m = +½ B 0 1 La differenza di energia E tra i due stati di spin (e quindi la frequenza di assorbimento) è direttamente proporzionale alla intensità del campo magnetico esterno B 0 ed è anche proporzionale a γ. In ogni caso la differenza di energia E è molto piccola rispetto a quelle in gioco nella spettroscopia UV e IR, e di conseguenza le frequenze usate sono molto minori, dell ordine dei Mz, e quindi nel campo delle radioonde, mentre le lunghezze d onda sono dell ordine dei metri (nell IR si parla di µm, e nell UV di nm). B 0 2 B 0
Sensibilità dell NMR Se la differenza di energia tra gli stati α e β è molto piccola, il numero di nuclei nello stato α (N α ) sarà molto simile a quello dei nuclei nello stato β (N β ). Questo in conseguenza della legge di Boltzmann: N N β α = e E kt E << kt Il numero di nuclei nello stato α (N α ) è detto popolazione dello stato α. hν hν hν hν hν β α α β β β β α α α β α β β α α α β β α β α α β β α α hν hν hν hν La sensibilità NMR è allora moto bassa: infatti se i nuclei nello stato α assorbono fotoni passando allo stato β, i nuclei nello stato β emettono fotoni per emissione stimolata e passano allo stato α. L assorbimento netto di radiazione elettromagnetica dipende allora dal piccolo eccesso (N α N β ) di nuclei nello stato α rispetto a quelli nello stato β.
Sensibilità dell NMR In termini quantitativi: Sfruttando l approssimazione: N N β α = e E kt e x 1 x N N β α = e E kt 1 E kt N β 0 N α γb 1 kt Nα N β γb0 N kt α Quindi: la sensibilità di un esperimento NMR aumenta all aumentare del campo magnetico applicato; inoltre, nuclei con rapporto giromagnetico elevato sono più sensibili di nuclei con rapporto giromagnetico più basso.
Nuclei utili in chimica organica I nuclei utilizzabili per l NMR devono avere I 0; in particolare sono utili i nuclei con spin ½. Tutti i nuclei con numero atomico pari e massa atomica pari hanno I = 0; tra questi 12 C ed 16 O. Invece il nucleo dell idrogeno ( 1, protone) è il nucleo più utilizzato per l NMR, poiché ha il rapporto giromagnetico più alto di tutti i nuclei stabili, ed ha abbondanza isotopica del 100%. Un altro nucleo utile in chimica organica è il 13 C. Il 13 C ha rapporto giromagnetico pari a circa ¼ di quello del protone, ed ha una abbondanza isotopica di solo l 1.1%, ma nonostante questo la spettroscopia 13 C NMR è molto utile perché il carbonio è l elemento base della chimica organica. Altri elementi utili sono 15 N (abbondanza isotopica solo 0.37%, ma l abbondante 14 N ha I = 1), 31 P (abbondanza isotopica 100%), 19 F (abbondanza isotopica 100%). 1 100% γ Η elevato 13 C 1.1% γ C ¼ γ
Il chemical shift Tutti i nuclei di una certo tipo (per esempio 1 ) sono esattamente identici, e quindi risuonano esattamente alla stessa frequenza se sottoposti allo stesso campo magnetico. Però in una molecola i nuclei non sono isolati, ma sono all interno degli atomi e quindi circondati da una nube di elettroni. Una nube di elettroni intorno ad un nucleo è in grado di diminuire leggermente il campo magnetico subito dal nucleo, cioè di schermare il nucleo nei confronti del campo magnetico esterno. Sono proprio gli elettroni a far si che nuclei chimicamente differenti risuonino a frequenze leggermente diverse, poiché subiscono campi magnetici leggermente diverse. Le differenze di frequenza sono molto piccole, solo centinaia o migliaia di z rispetto alle centinaia di Mz della radiazione elettromagnetica, ma posono essere misurate molto accuratamente. È possibile correlare la frequenza di risonanza dei nuclei alla distribuzione di elettroni nella molecola, e quindi alla struttura chimica.
Il chemical shift In assenza di campo magnetico, gli elettroni si muovono in maniera disordinata formando una nube elettronica intorno al nucleo.
Il chemical shift Il campo magnetico induce un movimento più ordinato degli elettroni, come se percorressero un orbita su un piano perpendicolare al campo magnetico.
Il chemical shift Il movimento degli elettroni produce a sua volta un campo magnetico (che è quindi indotto dal campo magnetico esterno). Le linee di forza di questo campo magnetico sono indicate in rosso.
Il chemical shift All interno della nuvola elettronica, il campo magnetico indotto si oppone al campo magnetico applicato, ed il nucleo è schermato. Una nube di elettroni intorno ad un nucleo schema il nucleo.
Il chemical shift Invece, intorno alla nuvola elettronica il campo magnetico è nella stessa direzione del campo magnetico esterno. Un nucleo che si trovasse in questa zona sarebbe deschermato.
Il chemical shift Riassumendo, il campo magnetico esterno induce un movimento degli elettroni all interno della nube elettronica. Questo movimento produce un campo magnetico che all interno della nube elettronica si oppone al campo magnetico applicato, mentre intorno alla nube elettronica si somma al campo magnetico applicato. La leggera differenza della frequenza di risonanza di nuclei in intorni chimici diversi è chiamata spostamento chimico o, più spesso, in inglese chemical shift. Gli elettroni intorno ad un nucleo schermano il nucleo quindi i protoni circondati da una alta densità elettronica risuonano a frequenza inferiore di protoni circondati da una bassa densità elettronica
Il chemical shift La frequenza di risonanza dei protoni è quindi collegata alla struttura chimica della molecola. Ci sono però due problemi per utilizzare questi dati: La frequenza di risonanza dipende dalla intensità del campo magnetico applicato. Non è quindi possibile semplicemente riportare la frequenza di risonanza di un protone in z. Piccole differenze nel campo magnetico dello spettrometro possono generare differenze nella frequenza di risonanza di protoni molto maggiori dei chemical shift. Questo problema si risolve usando una sostanza di riferimento, il tetrametilsilano (TMS), e misurando le frequenze di risonanza di un protone ν come differenza rispetto alla frequenza di risonanza ν TMS dei protoni del TMS (che quindi è considerata 0). In questo modo una piccola differenza di campo magnetico modifica non solo la frequenza di risonanza del protone in esame, ma anche quella dei protoni del TMS, e la differenza rimane (più o meno) costante. Tutti i chemical shift protonici (e 13 C) sono sempre riferiti al TMS; per altri nuclei ci sono altre sostanza di riferimento. Quindi il chemical shift è (per ora): ν ν TMS
Il chemical shift L altro problema è che gli stessi chemical shift sono generati da campi magnetici indotti, e quindi sono proporzionali al campo magnetico applicato. Questo rende non paragonabili i dati ottenuti su due spettrometri diversi, anche se il campo magnetico è quasi uguale. Quindi se in uno spettrometro a 100 Mz un protone risuona a frequenza maggiore di 260 z rispetto al TMS, a 200 Mz lo stesso protone risuonerà a frequenza maggiore di 520 z rispetto al TMS. Quindi nemmeno la grandezza (ν ν TMS ) è indipendente dalle condizioni della misura, perché è direttamente proporzionale al campo magnetico applicato. Se però dividiamo questa grandezza per la frequenza di risonanza (anch essa direttamente proporzionale al campo magnetico applicato) otteniamo una grandezza finalmente indipendente dalle condizioni sperimentali. È questa la scala dei δ, che è definita così: ν νtms 6 δ = 10 ν Il fattore 10 6 è necessario perché i chemical shift sono molto piccoli rispetto alle frequenze di risonanza. Usando i numeri visti sopra, il chemical shift sarebbe δ 2.6 in entrambi i casi.
Chemical shift protonico La maggior parte dei protoni di una molecola organica risuonano in un intervallo di 10 ppm, tra δ 0 e δ 10. Il principale fattore che determina il chemical shift di un protone è la densità elettronica del relativo idrogeno: atomi elettronegativi legati nelle vicinanze dell idrogeno riducono la sua densità elettronica, e quindi l effetto schermante degli elettroni, per cui il chemical shift aumenta. Cl 3 C C 3 3 C C 2 3 C Cl δ 0.86 δ 1.33 δ 3.47 I protoni olefinici (legati a carboni sp 2 ) hanno chemical shift molto più alto dei protoni legati a carboni sp 3, con valori tipici di δ 5-6. Questo perché i C ibridati sp 2 sono più elettronegativi dei C ibridati sp 3, ma non solo. Infatti i protoni degli alchini (legati a C ibridati sp) risuonano a δ 2-3. Ci sono quindi altri fattori che influenzano il chemical shift: gli effetti schermanti e deschermanti di altre nuvole elettroniche oltre a quella intorno al protone.
Effetti anisotropi sul chemical shift La densità elettronica intorno all idrogeno ha più o meno simmetria sferica, ed il protone al suo interno è schermato qualunque sia la orientazione della molecola rispetto al campo magnetico esterno. Tuttavia nubi elettroniche di altro tipo (tipicamente quelle dovute agli elettroni π, più mobili) possono anche deschermare il protone, se la molecola è orientata opportunamente rispetto al campo magnetico. Un esempio è l orbitale π degli alcheni: In questo caso, se il piano dell alchene è perpendicolare alla direzione del campo magnetico, gli elettroni possono muoversi efficacemente rimanendo nell orbitale, ed i protoni olefinici risultano deschermati, come si vede nella figura a destra. Perciò i protoni olefinici sono più deschermati di quanto dovrebbero essere sulla base dei soli effetti di elettronegatività.
Effetti anisotropi sul chemical shift Negli alchini, gli elettroni π hanno simmetria cilindrica rispetto all asse della molecola, ed la massima corrente elettronica si ha quando la molecola è parallela al campo magnetico. In questo caso i protoni sono schermati ed i protoni risultano più schermati di quanto dovrebbero essere sulla base dei soli effetti di elettronegatività. Naturalmente l alchino ruota liberamente in soluzione, e si può trovare anche perpendicolare al campo magnetico; in questa orientazione i protoni sono deschermati, però l effetto schermante che si ha quando l alchino è parallelo è più intenso e prevale.
Effetti anisotropi sul chemical shift Quando il benzene è perpendicolare al campo magnetico, i 6 elettroni π delocalizzati possono generare una intensa corrente elettronica (corrente d anello), che ha un forte effetto deschermante sui protoni aromatici Infatti i protoni aromatici risuonano circa 2 ppm al di sopra dei normali alcheni, e la presenza di protoni particolarmente deschermati, e quindi di corrente di anello, è una delle migliori prove sperimentali dell aromaticità. Naturalmente il benzene non è sempre perpendicolare la campo magnetico; quando è parallelo, i protoni possono anche essere schermati dagli elettroni π, ma l effetto è molto piccolo, perché per avere corrente elettronica gli elettroni devono attraversare il piano nodale; quando il benzene è perpendicolare, come abbiamo detto, l effetto deschermante è molto grande. In media, quindi, i protoni vengono sicuramente deschermati.
Effetti anisotropi sul chemical shift L importanza della corrente d anello per i chemical shift è clamorosamente evidenziata dal 18-annulene: δ 8.9 δ -1.8 In questo composto, i protoni all esterno del ciclo sono deschermati, e risuonano a δ 8.9, mentre i protoni all interno del ciclo sono estremamente schermati dalla corrente d anello, e risuonano addirittura a frequenze inferiori a quelle del TMS, a δ 1.8.
Chemical shift protonici tipici Protoni su carboni sp 3 Un metile senza particolari sostituenti risuona a δ 0.8 un metilene a δ 1.25 un metino a δ 1.50 Il chemical shift può variare per: Sostituenti elettronegativi in β: +0.3 C=C in α: +0.8 C=O in α: +1.0 Anello aromatico in α: +1.3 Ossigeno o alogeni in α: (alcoli, eteri, eteri aromatici, esteri, esteri aromatici) +2-4 Metileni legati a due gruppi subiscono aumenti più o meno additivi: p.e. il metilene dell acido malonico risuona a δ 3.4
Chemical shift protonici tipici Protoni su carboni sp 2 Alcheni (non coniugati, coniugati, coniugati a CO) δ 4.5-6.5 (tipico δ 5.3) Composti aromatici: δ 6.5-8.5 (tipico δ 7.3) Aldeidi: δ 9.5 Effetti di donazione o attrazione elettronica per risonanza possono far variare questi valori in maniera abbastanza prevedibile. Protoni su carboni sp: Alchini terminali: δ 1.7-2.7 Protoni su eteroatomi: Chemical shift variabili con concentrazione, solvente e temperatura per la formazione di legami idrogeno. I segnali sono quindi poco diagnostici, anche se il protone del COO appare abbastanza costantemente intorno a δ 10.5 (perché si forma la specie dimerica molto stabile) I segnali sono spesso larghi e non mostrano accoppiamento con protoni vicinali (protoni scambiabili). I segnali spariscono se si aggiunge D 2 O (scambio con deuterio).
Integrazione L intensità di un segnale nello spettro NMR è proporzionale al numero di protoni che lo genera (Nuovo! Non succede né nell IR, né nell UV). Per intensità si intende l area sottesa al picco (integrale del picco) Linea integrale 55.5 : 22 : 32.5 5 : 2 : 3
Accoppiamento spin-spin I segnali degli spettri NMR hanno struttura fine: C C C N La causa della struttura fine, è l accoppiamento spin-spin, ossia l influenza degli stati di spin di un nucleo sulla frequenza di risonanza dei nuclei che lo circondano. L accoppiamento spin-spin rende più complessi, ma anche molto più ricchi di informazioni, gli spettri NMR,
Accoppiamento spin-spin Consideriamo un sistema formato da due protoni, A e X. Il protone A puo trovarsi negli stati di spin α e β con probabilità quasi uguale (come sappiamo le due popolazioni sono quasi identiche): B 0 A X A X A nello stato α A nello stato β Poiché ogni nucleo possiede un momento magnetico (ossia è un piccolo magnete), il campo magnetico del nucleo X può influenzare quello subito dal nucleo A, e come si vede dalla figura questa influenza è opposta se il nucleo A è nello stato α o β: nel primo caso X è schermato, nel secondo è deschermato.
Accoppiamento spin-spin X risuona a frequenze leggermente diverse se si trova vicino ad un A nello stato α o un A nello stato β. Il protone X dà quindi origine a due segnali, che nel loro complesso vengono detti doppietto: segnale dei nuclei X vicini agli A nello stato β segnale dei nuclei X vicini agli A nello stato α B 0 B 0 A X A X A nello stato β A nello stato α In generale, il numero di linee in cui è diviso il segnale generato da un nucleo è detto molteplicità del segnale.
La costante di accoppiamento Tutti i discorsi fatti possono essere ripetuti all inverso considerando l influenza di X sulla frequenza di risonanza di A, e allo stesso modo si può concludere che anche il segnale di A è un doppietto: segnale di A segnale di X La distanza (= differenza di frequenza) tra i due segnali del doppietto (di solito detti rami del doppietto) è detta costante di accopiamento ed indicata col simbolo J:
Costanti di accoppiamento L accoppiamento è sempre reciproco: se A è accoppiato con X, anche X è accoppiato con A ; in generale si dice che A e X sono accoppiati tra loro. la costante di accoppiamento tra A e X è identica a quella tra X e A. L accoppiamento è indipendente dal campo magnetico applicato: il chemical shift è proporzionale al campo applicato B 0, perché l effetto schermante degli elettroni è indotto dal campo magnetico esterno. Invece l accoppiamento spin-spin è dovuto alle interazioni tra i momenti magnetici nucleari, che sono indipendenti dal campo magnetico applicato L accoppiamento spin-spin si misura in z e non in ppm (con la scala dei δ) come i chemical shift.
Costanti di accoppiamento L aspetto dello spettro varia al variare del campo magnetico poiché il chemical shift è proporzionale al campo applicato B 0, mentre le costanti di accoppiamento sono indipendenti dal campo applicato B 0 60 Mz 200 Mz 600 Mz La scala dello spettro è in ppm, perciò le costanti di accoppiamento sembrano diminuire all aumentare del campo magnetico
Accoppiamento dipolare L accoppiamento descritto finora è detto accoppiamento dipolare. Esso dall orientazione relativa tra la retta che unisce i due nuclei e la direzione del campo magnetico B 0 A X A A x è schermato X X non è né schermato, né deschermato X A è deschermato La molecola ruota liberamente in soluzione, ed il nucleo X subisce un influenza pari alla media calcolata su tutte le possibili orientazioni della molecola. Questa media vale 0! NB. Quando la molecola ruota, l orientazione dei momenti magnetici dei nuclei rimane invariata!!
Accoppiamento scalare L accoppiamento dipolare non è responsabile della molteplicità dai segnali. Esiste però un altro meccanismo mediante il quale i momenti magnetici nucleari possono interagire: non in maniera diretta, ma indirettamente attraverso gli elettroni di legame. L accoppiamento attraverso questo meccanismo è detto accoppiamento scalare. L accoppiamento scalare non è mediato a 0 in soluzione, ed è responsabile della molteplicità dei segnali. L accoppiamento scalare dipende dal numero di legami chimici che separano i nuclei, e non dalla loro distanza nello spazio. In generale sono visibili accoppiamento tra nuclei separati fino a 3 legami (ma ci sono eccezioni!!) Per l NMR protonico significa che sono accoppiati i protoni geminali ( 2 J) e quelli vicinali ( 3 J).
Accoppiamento dipolare e scalare Accoppiamento dipolare Non visibile in spettri NMR in soluzione Dipende principalmente dalla distanza tra i nuclei Costanti di accoppiamento elevate quando visibili (centinaia o migliaia di z) Accoppiamento scalare Visibile in spettri NMR in soluzione Dipende principalmente dal numero di legami tra i nuclei Costanti di accoppiamento piuttosto piccole (decine o centinaia di z per le 1 J, 0-20 z per le 2 J e 3 J)
Sistemi di primo ordine e non di primo ordine Consideriamo ancora due nuclei A e X accoppiati tra loro. Effetto tetto
Sistemi di primo ordine e non di primo ordine Quindi: accoppiamenti tra protoni con chemical shift coincidenti non sono visibili (è come se non ci fossero) Il segnale dei protoni del benzene, etilene, acetilene, etano (ed anche TMS!) è sempre un singoletto, poiché in tutti questi composti i chemical shift di tutti i protoni sono uguali.
Sistemi di primo ordine e non di primo ordine se ν >> J se ν J se ν = 0 il sistema di spin si dice del primo ordine e lo spettro è facilmente interpretabile il sistema di spin si dice non del primo ordine e lo spettro diventa difficile da interpretare, ma il sistema di spin torna ad essere del primo ordine perché i protoni sono coincidenti Aumentando il campo magnetico un sistema non del primo ordine può diventare del primo ordine perché ν aumenta con il campo magnetico applicato, mentre J no.
Sistemi di spin di primo ordine: il sistema A 2 X Consideriamo un sistema in cui un protone X è accoppiato a due protoni A: A C C X I due protoni A (equivalenti, quindi l accoppiamento tra loro non conta) risentono dell effetto di X e risuonano come doppietto. Il protone X risente dello stato di spin di due protoni. Esistono quattro possibilità. αα m tot = + 1 αβ βα m tot = + 0 ββ m tot = 1 Il protone X risuona come tripletto 1:2:1. Il ramo centrale ha intensità doppia degli rami laterali, perché il protone X risuona a quella frequenza sia per lo stato αβ che per lo stato βα di A. A
Il sistema A 3 X Consideriamo ora un sistema in cui un protone X è accoppiato a tre protoni A: A C C A I possibili stati di spin complessivi dei tra protoni A sono ora: ααα m tot = + 3/2 ααβ αβα βαα m tot = + 1/2 ββα βαβ αββ m tot = 1/2 βββ m tot = 3/2 X A Esistono 4 possibili momenti magnetici totali (con i due centrali tre volte più probabili) ed il protone X risuona come quartetto 1:3:3:1.
La regola N+1 In generale, un protone accoppiato con la stessa costante di accoppiamento ad N altri protoni, appare con molteplicità N+1. Le intensità relative dei rami sono quelle del triangolo di Tartaglia (o di Pascal): Molteplicità Intensità relativa dei rami N singoletto 1 0 doppietto 1 1 1 tripletto 1 2 1 2 quartetto 1 3 3 1 3 quintetto 1 4 6 4 1 4 sestetto 1 5 10 10 5 1 5 eptetto 1 6 15 20 15 6 1 6 ottetto 1 7 21 35 35 21 7 1 7 Per esempio il C del 2-cloropropano è accoppiato con 6 protoni, ed appare come eptetto (i rami laterali si vedono appena!!!)
E se le costanti sono diverse? La regola N+1 vale sono le se costanti di accoppiamento sono uguali (o quasi uguali) Consideriamo invece un sistema AMX, in cui J AM J MX (qui J MX > J AM ) C C C A M X In questo caso l influenza di X su M è diversa da quella di A, e quindi gli stati αβ e βα non hanno più lo stesso effetto su M. Il segnale di M ha quindi 4 rami, ed è detto doppio doppietto.
Costanti di accoppiamento tipiche Accoppiamenti geminali Protoni su carboni sp 3 : Protoni su carboni sp 2 : Accoppiamenti vicinali Legame singolo, libera rotazione: Legame singolo, rotazione impedita: J 10-14 z J 1-3 z J 7 z legge di Karplus Legge di Karplus: La costante di accoppiamento vicinale dipende principalmente dall angolo diedro tra i due protoni. Come si vede nel grafico, è piccola per idrogeni sghembi (φ=60 ), ed è grande per idrogeni anti (φ=180 ). φ J = J 0 cos 2 φ per 0 < φ < 90 J = J 180 cos 2 φ per 90 < φ < 180 14 φ 12 0 10 8 6 4 2 0 φ 0 90 180 z φ 180
Costanti di accoppiamento tipiche Accoppiamenti vicinali Legame singolo, cicli a 6 termini (forma a sedia): J ax,ax 10 z J ax,eq 3 z J eq,eq 3 z Legame singolo, cicli a 5 termini: J 1-8 z (cis e trans) Legame doppio: J cis 7-11 z J trans 14-17 z Composti aromatici a 6 termini: J orto 7-9 z Composti aromatici a 5 termini: J orto 3-5 z
Costanti di accoppiamento long-range Sistemi insaturi Accoppiamento allilico ( 4 J: C-C=C): J 0-2 z Accoppiamento omoallilico ( 5 J: C-C=C-C): J 0-2 z Accoppiamenti meta e para in composti aromatici: J meta 1-3 z J para 0-1 z C C C C C C C Sistemi saturi Accoppiamento W: 4 J 0-7 z Presente solo se i quattro legami sono sullo tutti stesso piano (conformazione a W); è visibile in composti a conformazione rigida, particolarmente composti policiclici a ponte. C C C per esempio: O
1) Il magnete superconduttore: Lo spettrometro NMR Il campo magnetico deve essere il più uniforme possibile (disomogeneità < 1 parte su 10 9!)
1) Il magnete superconduttore: Lo spettrometro NMR RF Il campo magnetico deve essere il più uniforme possibile (disomogeneità < 1 parte su 10 9!)
Lo spettrometro NMR 2) Il Trasmettitore/ricevitore di radiofrequenza: Oppure: Consolle computer + RF (il nostro AMX-500!) 3) Il computer per il controllo ed l elaborazione dei dati:
Spettrometria NMR: aspetti tecnici La spettroscopia NMR ad alta risoluzione va effettuata su campioni in soluzione a causa di: Effetti anisotropi sul chemical shift Accoppiamenti dipolari Solventi per l NMR: non devono contenere protoni Molti disponibili: CDCl 3, CD 3 OD, D 2 O, CD 3 COCD 3, C 6 D 6, Ma anche 2 O se necessario (protoni scambiabili) con tecniche particolari Sistema di lock a deuterio: La presenza del deuterio è importante anche perché questo nucleo serve come ancora per mantenere costante il campo magnetico. Infatti c è una costante irradiazione alla frequenza di risonanza del deuterio, e se il campo magnetico varia, il deuterio va fuori risonanza. Rotazione campione: La cuvetta può essere fatta ruotare sul proprio asse, per migliorare l omogeneità del campo magnetico. In questo caso, possono comparire le cosiddette bande laterali. Oggi normalmente non si usa questa tecnica.
Scansione del chemical shift e del campo magnetico Uno spettro NMR può essere ottenuto in due modi. Scansione della frequenza: si varia la frequenza della radiazione elettromagnetica e si misura l assorbimento per ogni frequenza Scansione del campo: si lascia costante la frequenza della radiazione elettromagnetica, e si varia il campo magnetico: all aumentare del campo magnetico entreranno in risonanza protoni via via più schermati, e si ottiene comunque uno spettro. Negli apparecchi NMR ad onda continua questo secondo metodo era usato molto frequentemente, ed è ancora molto comune dire segnale a campi alti per intendere un segnale di un protone molto schermato, che quindi risuona a frequenze (e chemical shift) bassi; analogamente, un protone che risuona a campi bassi è piuttosto deschermato, e quindi ha una frequenza di risonanza e chemical shift piuttosto alti.
Protoni equivalenti Due protoni sono equivalenti se si trovano nello stesso intorno chimico. Due protoni equivalenti hanno sempre la stessa frequenza di risonanza. Tuttavia due protoni possono avere la stessa frequenza di risonanza anche se non sono equivalenti, per caso o perché gli intorni chimici dei due protoni, pur non essendo identici, sono molto simili. Ci sono due motivi per l equivalenza: Simmetria molecolare Scambio chimico (equilibrio conformazionale)
Simmetria molecolare Due protoni sono equivalenti per simmetria molecolare se, in una molecola con un qualunque elemento di simmetria, i protoni sono correlati dell'elemento di simmetria. C 3 C C C 3 C 3 C C C 3 C C X X X X X X X Y
Scambio chimico Due protoni sono equivalenti per scambio chimico sono rapidamente interconvertibili, ossia che possano facilmente passare l uno al posto dell altro. a a b b b b a b b a a a b b b a a b a b a a b b a c b b c a b c a I protoni di un metilene in sistemi ciclici e/o vicino ad un centro chirale sono spesso non equivalenti: Cl Br Cl Cl Cl Br Cl Cl Br Cl Br Cl
Protoni equivalenti: casi complessi O Me Me O O O C 2 Br Br Br Br Ph Ph Ph Ph
Equivalenza magnetica e di chemical shift Nell'NMR protonico esistono due tipi di equivalenza: Due protoni che sono nello stesso intorno chimico (per simmetria o per scambio chimico) sono detti equivalenti per chemical shift. I protoni sono anche magneticamente equivalenti se hanno la stessa costante di accoppiamento con tutti i protoni appartenenti al sistema di spin. B E C D J AB = J A'B A A' J AC = J A'C J AD = J A'D J AE = J A'E In altre parole, A e A' sono magneticamente equivalenti se hanno la stessa costante di accoppiamento con ogni altro protone con cui sono entrambi accoppiati. Se, al contrario, queste eguaglianze non si verificano, i protoni continuano ad essere equivalenti per chemical shift, ma non sono magneticamente equivalenti.
Equivalenza magnetica e di chemical shift Se due protoni sono equivalenti per chemical shift, ma non magneticamente equivalenti, lo spettro NMR non è più del primo ordine e la molteplicità è Cl complessa. 1 6 2 5 3 4 Cl J 3,4 = J 5,6 = 8 z J 3,5 = J 4,6 = 2 z In questo caso il sistema di spin non è più chiamato A 2 B 2, ma AA'BB' Me C 2 O N + COO 2.0 2.5 3.0 ppm
NMR a trasformata di Fourier (FT-NMR) Esiste un metodo alternativo (e più vantaggioso) per registrare spettri NMR; l'nmr ad impulsi, detto anche NMR a trasformata di Fourier. Invece di misurare l'assorbimento di radiazioni elettromagnetiche a frequenze via via diverse, si sottopone il campione ad un solo, intenso, e brevissimo impulso di radiofrequenza. Questo impulso è capace di eccitare tutti i nuclei (di un certo tipo!) nello stesso tempo, indipendentemente dal loro chemical shift. Dopo la fine dell'impulso, i nuclei ritornano alla normale distribuzione di Boltzmann emettendo fotoni, ogni nucleo alla propria frequenza di risonanza. L'emissione non va avanti all'infinito, ma diminuisce in maniera esponenziale. Per un singolo nucleo, la radiazione emessa ha questo aspetto, e la frequenza può essere misurata direttamente: t Grafico di una intensità in funzione del tempo
Il FID Però se abbiamo due nuclei che emettono a frequenze diverse, le due onde interferiscono: t e già in presenza di soli 4 nuclei l'interferogramma (detto FID, da Free Induction Decay) diventa incomprensibile: t Il FID è dunque una sovrapposizione di radiofrequenze, cioè di segnali sinusoidali in funzione del tempo, ognuno alla frequenza di risonanza del nucleo che lo produce.
La trasformata di Fourier Le informazioni del normale spettro NMR sono tutte presenti, nel FID, ma in maniera non facilmente comprensibile. t Per fortuna esiste una operazione matematica (detta trasformata di Fourier) che permette di trasformare il FID (che è il grafico di una intensità in funzione del tempo) nel normale spettro NMR (che è il grafico di una intensità in funzione della frequenza). t FT ν
L'impulso Come può un impulso di radiofrequenza, che è a una certa ben precisa frequenza, eccitare nuclei che risuonano a frequenze differenti? In realtà la frequenza di un'onda è perfettamente definita solo se il treno d'onde ha lunghezza infinita. Se invece il treno d'onde dura solo un tempo t, la frequenza non è più perfettamente definita, e si ha: ν t 1 dove ν è l'indeterminazione della frequenza e t la durata del treno d'onde. Quanto più breve è l'impulso, tanto più indefinita è la frequenza. Per impulsi di circa 10µs (cioè 10-5 s), l'impulso è efficace per un range di circa 10.000 z (20 ppm a 500 Mz), e può quindi eccitare tutti i nuclei. Naturalmente, per essere efficace, un impulso così breve deve anche essere molto intenso.
Vantaggi dell'ft-nmr Tutte le frequenze sono registrate contemporaneamente, invece che sequenzialmente come nell esperimento ad onda continua, e l intero esperimento dura 1 2 secondi (il tempo che la radiofrequenza impiega ad andare a zero) invece che qualche minuto L'esperimento può essere ripetuto molte volte in poco tempo, e questo migliora drasticamente il rapporto S/R (lucido successivo). Mentre l'nmr ad onda continua è una spettroscopia di assorbimento, l'ft-nmr è una spettroscopia di emissione (i nuclei emettono radiofrequenza dopo l'eccitazione) Poiché il momento dell'eccitazione dei nuclei è separato da quello dell'aquisizione dati (emissione della radiofrequenza) è possibile eccitare gli spin nucleari in maniera più sofisticata. Diventano possibili: Esperimenti multiimpulso (noi studieremo il DEPT) Spettroscopia NMR bidimensionale Tutta la spettroscopia NMR moderna è in trasformata di Fourier
Rapporto S/R e FT-NMR Quando un esperimento è ripetuto molte volte, il segnale (S) si trova sempre nello stesso punto, mentre il rumore (R), che è casuale, no. Quindi l'intensità del segnale è proporzionale al numero di esperimenti (N), mentre si può dimostrare che il rumore è proporzionale solo a N, quindi: S N N R N 1 2 3 4 1 +2 +3 +4 N = 4 Poiché S R N, registrando un numero molto alto di esperimenti, è possibile evidenziare segnali completamente nascosti dal rumore di fondo
Il disaccoppiamento di spin Se un protone è irradiato con continuità alla sua frequenza di risonanza, la radiazione elettromagnetica causa un continua variazione del suo stato di spin α a β e viceversa (si tratta di una serie continua di assorbimenti ed emissioni stimolate). Consideriamo ora un sistema AX, e supponiamo di registrare uno spettro (ad onda continua o in trasformata di Fourier) mentre è in corso una continua irradiazione del nucleo A. B 0 A X A X A nello stato α Senza irradiazione A nello stato β L irradiazione fa passare A da α a β e viceversa Il protone X non si trova più nelle vicinanze di un protone nello stato α oppure nello stato β, ma nelle vicinanze di un protone che cambia continuamente il suo stato di spin. Il protone X risente quindi dello momento magnetico medio del nucleo A, che è zero.
Il disaccoppiamento di spin In definitiva, se si irradia con continuità sul nucleo A, il nucleo X non risente più dell accoppiamento con il nucleo A, e risuona come singoletto, cioè come se il nucleo A non esistesse (ma eventuali accoppiamenti con altri nuclei continuano ad esistere!). Senza irradiazione Con irradiazione Nello stesso tempo, il segnale del nucleo A non è più presente poiché la continua irradiazione fa sì che le popolazioni degli stati α e β diventino identiche. Le informazioni che ci vengono da esperimenti di disaccoppiamento di spin sono oggi ottenibili più facilmente dall'esperimento NMR bidimensionale COSY.
L'effetto nucleare Overhauser (NOE) L effetto nucleare Overhauser è una variazione dell intensità del segnale di un protone in seguito all irradiazione di un protone che si trova nelle vicinanze del protone osservato Il fenomeno del NOE è legato all accoppiamento dipolare, e quindi vicini significa effettivamente vicini nello spazio, e non separati da pochi legami. Generalmente si osserva un aumento dell intensità per molecole organiche, diminuzione per macromolecole. Se si ha aumento di intensità si parla di NOE positivo, se si ha diminuzione di NOE negativo. Gli aumenti e diminuzioni di intensità sono in genere piccoli per NOE omonucleari, con un valore massimo teorico del 50% e valori reali che sono tipicamente compresi tra l 1% ed il 10%. Non spiegheremo in dettaglio il meccanismo del NOE. Diciamo solo che l'irradiazione su un nucleo fa sì che la differenza di popolazione tra gli stati α e β si annulla. Di conseguenza* nei nuclei accoppiati dipolarmente (quindi vicini), la differenza di popolazione tra gli stati α e β dei nuclei varia (aumenta sa il NOE è positivo), e per questo l'intensità del segnale di questo nuclei aumenta. * Perché questo sia una conseguenza non lo spieghiamo!
L'effetto nucleare Overhauser (NOE) Poiché l'aumento di intensità è piccolo, normalmente il NOE viene misurato utilizzando spettri differenza: Spettro con irradiazione Spettro senza irradiazione = NOE! Spettro differenza
Uso dell'effetto nucleare Overhauser L aumento della intensità del segnale di un protone in seguito all irradiazione su un altro protone è in generale considerata prova della vicinanza spaziale (diciamo entro 3-4 Å) tra i due protoni. Non è vero il contrario, cioè non possiamo concludere dall assenza di NOE che i due protoni sono lontani. Il NOE è di enorme utilità per la determinazione della stereochimica delle molecole. Per esempio se stiamo studiando la stereochimica di: 5 O 4 O cis 1 3 2 O 5 O 4 O 1 un effetto NOE tra i protoni in 2 e in 4 indica vicinanza spaziale tra i due protoni, e questo è in accordo solo con il diastereoisomero cis. 3 2 O 5 O 4 O 1 3 trans 2 O
NOE e disaccoppiamento Una irradiazione su un protone è in grado di provocare sia NOE che disaccoppiamento di spin, ed i due effetti avvengono contemporaneamente in un esperimento ad onda continua. Questo è un problema, perché il disaccoppiamento, facendo variare le molteplicità, rende difficile l'uso dell'esperimento differenza. In un esperimento a trasformata di Fourier, tuttavia, i due fenomeni possono essere tenuti ben distinti. Nel NOE la variazione dell intensità del segnale è alla variazione della differenza tra le popolazioni degli stati α e β: l'intensità del segnale dipende dalla differenza di popolazione al momento dell'impulso, per cui è importante avere irradiazione prima dell impulso, non dopo. Nel disaccoppiamento di spin l'irradiazione fa variare la frequenza a cui il nucleo emette, e quindi l'irradiazione deve avvenire durante l'emissione, cioè dopo l impulso. Quindi: Irradiazione prima dell'impulso NOE Irradiazione dopo l'impulso disaccoppiamento
Rilassamento Il rilassamento è il ritorno all'equilibrio di un sistema che è stato perturbato. In generale il rilassamento è un processo esponenziale, e può essere definita una costante di tempo T (il cosiddetto tempo di rilassamento) che ci dice quanto velocemente il sistema rilassa. Per quanto riguarda l'nmr, il tempo di rilassamento T 2 ci dice quanto velocemente il FID decade, e il tempo di rilassamento T 1 quanto velocemente il sistema torna alla distribuzione di equilibrio di Boltzmann (i due processi sono diversi, ma in molecole piccole vanno più o meno alla stessa velocità). Per esempio: t Rilassamento veloce (T 2 piccolo) Rilassamento lento (T 2 grande)
Rilassamento Nel FID di destra della pagina precedente, il segnale decade più velocemente, e la frequenza è più indefinita: dopo la trasformata di Fourier, i segnali saranno più larghi e meno risolti. Quindi: Rilassamento veloce (T 2 piccolo) Rilassamento lento (T 2 grande) Un tempo di rilassamento piccolo (rilassamento veloce) riduce la risoluzione. Però dobbiamo dire che prima di poter ripetere un esperimento NMR, dobbiamo aspettare che si ristabilisca la distribuzione di popolazioni di Boltzmann. Se il tempo di rilassamento è lento, dobbiamo aspettare molto tempo, e possiamo ripetere l'esperimento meno volte per unità di tempo: il rapporto segnale/rumore scende. Quindi: Un tempo di rilassamento grande (rilassamento lento) riduce la sensibilità.
Spettroscopia NMR 13 C I principi dell'nmr 13 C sono identici a quelli dell'nmr protonico, quindi esaminiamo solo le differenze. La sensibilità è molto minore rispetto a NMR protonico a causa di bassa abbondanza isotopica (1.1% invece di ~100%) basso rapporto magnetogirico, γ C = ¼γ, e visto che sensibilità γ 3, allora la sensibilità è solo 1/64 di quella protonica (senza considerare l'abbondanza isotopica) Tempi di rilassamento più lunghi (anche decine di secondi, ma non si aspetta tanto!) Chemical shift range 0-220 ppm (invece degli 0-10 ppm dell'nmr protonico) il riferimento per la scala dei δ sono i carboni del TMS Costanti di accoppiamento: le 1 J CC, 2 J CC e 3 J CC esistono ma non danno luogo a molteplicità nello spettro (è improbabile avere 2 13 C vicini) le 1 J C (125-250 z) e le 2 J C e 3 J C (0-15 z) darebbero luogo a una molteplicità complessa, ma si usa il disaccoppiamento di spin a larga banda (broadband decoupling) quindi: In uno spettro 13 C i segnali sono tutti singoletti (ma non se ci sono accoppiamenti con 19 F, 31 P, ecc, ecc,)
Disaccoppiamento a larga banda Gli esperimenti 13 C vengono normalmente effettuati in presenza di disaccoppiamento protonico. Questo è come un disaccoppiamento di spin, ma deve funzionare su tutti i protoni e non solo su quelli che risuonano a una certa frequenza. Per questo viene detto disaccoppiamento a larga banda (broad band decoupling - BB). Si effettua con un irradiazione ad alta potenza, e di intensità variabile nel tempo. Una irradiazione del genere influenza tutti i i protoni, poiché è come se fosse realizzata attraverso una serie continua di impulsi di radiofrequenza; in alcuni casi si fa proprio così. Nell'esperimento disaccoppiato la sensibilità aumenta perché i segnali sono tutti singoletti c'è il NOE eteronucleare (segnali fino a 3 volte più intensi per C, C 2 e C 3 ) La presenza di NOE però significa che l'intensità dei segnali non è più proporzionale al numero di 13 C (non si può usare l'integrazione). Un'altra causa sono i lunghi tempi di rilassamento di alcuni carboni (particolarmente quelli non protonati).
Spettri 13 C NMR L'intervallo più ampio di chemical shift e il fatto che i segnali sono tutti singoletti fa sì che: In uno spettro 13 C è molto raro che due segnali siano sovrapposti (a meno che non siano di carboni equivalenti!) Il numero di atomi di carbonio in una molecola è almeno pari al numero di segnali nello spettro 13 C (può essere maggiore se ci sono carboni equivalenti)
Chemical shift 13 C tipici Esistono regole additive per il calcolo del chemical shift che funzionano bene per specifiche classi di composti, ma richiedono la consultazione di tabelle. Sono invece valori da ricordare: Carboni sp 3 Metili legati a C δ 5-25 Metileni e metini legati solo a C δ 5-55 Il chemical shift risente poco della elettronegatività di sostituenti in β e di effetti di anisotropia del chemical shift (gli effetti ci sono, ma il range di chemical shift èampio). C legati a O δ 55-85 C legati a 2 atomi di O (acetali) δ 90-110 C legati ad N (amminico o ammidico) δ 40-70 C legati ad eternatomi elettronegativi, ma di alto peso molecolare (I, Br, anche S) non subiscono aumenti significativi rispetto a C legati solo a C.
Chemical shift 13 C tipici Carboni sp 2 Alcheni e composti aromatici: δ 100-165 (tipico δ 120-130, di più per C non protonati) È particolarmente alto il chemical shift di carboni in β al CO, particolarmente basso quello di carboni in β ad ossigeno (eteri vinilici). Carboni (di alcheni ed areni) legati a O δ 150-160 Carbonili (qui lo spettro 13 C è importante): Aldeidi: δ 195-200 Chetoni: oltre δ 200 Chetoni coniugati: δ 195-200 Esteri, ammidi, ed altri derivati di acidi carbossilici: δ 165-170 Carboni sp: Alchini: δ 70-90 Nitrili: δ 110-120
Esperimenti DEPT Il disaccoppiamento a larga banda è molto utile, ma elimina una importante informazione: il numero dei protoni legati ad ogni carbonio. In sua assenza, infatti, e considerando solo le costanti grandi 1 J C, i C 3 sarebbero quartetti, i C 2 sarebbero tripletti, i C sarebbero doppietti, ed i C non protonati singoletti. Esiste un esperimento multiimpulso, detto DEPT, che permette di recuperare queste informazioni. In questi esperimenti i nuclei 13 C sono eccitati da una serie di impulsi sia a frequenza 13 C che 1, ed il risultato è che i C 3, i C 2, i C ed i C non protonati sono eccitati in maniera diversa l uno dall altro. In particolare esistono due versioni di questo esperimento, che differiscono per la durata di uno degli impulsi e sono dette: DEPT90: nello spettro appaiono esclusivamente i C DEPT135: Nello spettro appaiono i C 3, ed i C normalmente, mentre i C 2 compaiono dalla parte opposta dello spettro (come se fossero segnali negativi; si dice che hanno fase opposta)
Esperimenti DEPT Dalla combinazione dei dati forniti da spettro 13 C disaccoppiato, DEPT90 e DEPT135 è possibile determinare con sicurezza se un carbonio è un C 3, un C 2, un C o un C non protonato. Inoltre l esperimento DEPT è addirittura più sensibile del normale spettro 13 C disaccoppiato.