Andrea Pulvirenti Detossificazione biologica delle ocratossine nei vini Sicura 2009 Modena 28 maggio
PRIN2007 Metodi di miglioramento dei lieviti vinari per il potenziamento della salubrità dei vini rossi in base all'attività di adsorbimento parietale Andrea Caridi Università Mediterranea di Reggio Calabria Giuseppe Blaiotta Università degli Studi di Napoli Federico II Andrea Pulvirenti Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia
La selezione di lieviti per la guida della fermentazione ha fornito, nel corso degli ultimi anni, numerosi e validi contributi per la produzione di vini caratterizzati da qualità, salubrità, stabilità elevata e riproducibilità.
.l 80% della produzione enologica mondiale è condotta con colture starter
Studi recenti sulla selezione di lieviti starter capaci di rimuovere l OTA durante la fermentazione alcolica hanno dimostrato la reale possibilità di decontaminare biologicamente i vini mediante l uso di ceppi che agiscono come spugne nel sequestrare la tossina
Ciò permette, quindi, di ripulire in vinificazione i mosti contaminati da OTA per semplice adsorbimento della stessa sulle pareti cellulari del lievito e sua successiva rimozione mediante allontanamento delle fecce con travaso.
LIEVITO OCRATOSSINA GLUCANI PRINCIPIO LIEVITO GLUCANI PARETE CELLULARE FERMENTATORE: VINO ASSORBIMENTO PARIETALE
FILTRO MOSTO FECCIA Rimozione lieviti+ocratossine VINO
Le nostre ricerche si sono focalizzate sulla selezione, nell ambito di ceppi di Saccharomyces sensu stricto già selezionati per uso enologico, di starter capaci di rimuovere l OTA durante la fermentazione alcolica. In particolare, I lieviti, saggiati in soluzione fisiologica ed in mosto d uva addizionati di OTA hanno dato risultati di grande interesse dato che i ceppi migliori sono stati capaci di adsorbire fi no al 90% dell OTA presente.
I microrganismi utilizzati come starter per le vinificazioni, generalmente ottenuti nell ambito della specie Saccharomyces cerevisiae, sono selezionati sia verso i più importanti caratteri tecnologici che verso altri, nuovi ed interessanti. L approfondimento di tali nuovi caratteri potrebbe rivelare che l interazione tra lieviti e vini sia ancor più stretta di quanto si pensi oggi. Ciò permetterebbe di potenziarne ulteriormente le caratteristiche peculiari.
L'uso di lieviti selezionati per la guida della vinificazione ha fornito molteplici contribuiti alla salubrità dei vini, tra cui: - la stabilizzazione dei vini con basse dosi di SO2 ; -la detossificazione dei vini dai metalli pesanti derivanti dai trattamenti in vigneto; - la produzione di vini con basso contenuto di etilcarbammato e ammine biogene.
Un interessante caratteristica dei lieviti selezionati, tuttora non pienamente sfruttata, è la differente capacità di adsorbire sullo strato più esterno della parete cellulare differenti sostanze presenti nel mosto e nel vino. Questo strato è costituito dal 35 al 40% da mannoproteine, in una certa misura rilasciate nel vino sia durante che dopo la fermentazione alcolica, internamente connesse ad una matrice amorfa di glucani. Esse conferiscono alla parete cellulare del lievito proprietà importanti nel controllo della sua porosità regolando, in tal modo, il movimento da e verso lo spazio periplasmatico
Inoltre, le mannoproteine contengono O-glicani neutri ed N- glicani carichi negativamente per la presenza di fosfato, acido glucuronico o piruvato che rendono possibile o meno le interazioni elettrostatiche ed ioniche con diversi componenti del mosto e del vino. In particolare, è proprio la quantità di mannosilfosfato, variabile da ceppo a ceppo, che rende maggiore o minore la capacità di adsorbimento del lievito.
L'attività di adsorbimento parietale differisce considerevolmente da lievito a lievito secondo le caratteristiche strutturali e la composizione chimica dello strato più esterno della parete cellulare. Come per altri processi di adsorbimento, la struttura fisica delle mannoproteine - carica totale, distribuzione della carica ed area superficiale accessibile - è il più importante carattere che determina le differenze di adsorbimento tra i ceppi.
La presenza di cariche negative negli oligosaccaridi acidi modifica le interazioni ioniche con i componenti del vino. É ragionevole ipotizzare che anche i lieviti vinari mostrino variabilità nel rapporto tra oligosaccaridi neutri ed acidi che costituiscono le mannoproteine parietali.
Gli effetti enologici di questa diversità strutturale forniscono una buona ragione per proporre una selezione specifica di lieviti vinari, basata sul grado di mannosilfosforilazione, che dipende anche dalle condizioni colturali. I composti fenolici interagiscono con le mannoproteine prodotte dai lieviti; la quantità di mannoproteine rilasciate durante la vinificazione dipende dal ceppo di lievito e dal mosto d'uva. Le mannoproteine possono diminuire l'indice dei polifenoli totali del vino mediante interazioni deboli e reversibili, principalmente tra antocianine e pareti cellulari
Molte ricerche sono state condotte per studiare gli effetti della selezione del lievito sui composti fenolici dei vini. É stato dimostrato che il lievito vinario influenza la concentrazione e la composizione dei composti fenolici nel vino, dato che i lieviti, solitamente, diminuiscono i composti fenolici, soprattutto mediante il loro adsorbimento sulle pareti cellulari.
Sono state riportate considerevoli correlazioni tra i ceppi di lievito impiegati per la vinificazione ed i composti fenolici presenti nel vino, dimostrando che il comportamento del ceppo può modificare le proprietà cromatiche, il profilo fenolico ed il potere antiossidante del vino. É interessante notare che l'interazione tra cultivar di uva e lievito è stretta ed importante in quanto la varietà d'uva, dovuto alla sua composizione fenolica, condiziona l'attività adsorbente del ceppo di lievito
Le mannoproteine parietali del lievito e la sua attitudine ad adsorbire svolgono varie funzioni enologiche con risvolti sulle caratteristiche del vino. Il comportamento adsorbente del lievito in vinificazione riguarda composti che influiscono sulla qualità e sulla salubrità del vino, come i polifenoli e l ocratossina A (OTA). Adsorbire o meno tali sostanze, caratteristica legata a ciascun ceppo, risulta in grado di condizionare fortemente la composizione finale di un vino.
Le ocratossine rappresentano un gruppo di metaboliti secondari prodotti da funghi appartenenti ai generi Penicillium e Aspergillus. L'ocratossina A (OTA) è la più abbondante e la più tossica nell'ambito di questo gruppo di micotossine, esercitando svariati effetti tossici. L'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro ha classificato l'ota come possibile carcinogeno nell'uomo includendolo nella categoria 2B. L'OTA è un comune contaminante di granaglie come l'orzo, il mais, la segale, il frumento e l'avena ma è stata altresì segnalata in altri prodotti vegetali, incluso chicchi di caffè, spezie, noci, olive, uva, fagioli e fichi. Inoltre, l'ota può "sopravvivere" ai tipici processi produttivi alimentari ed è stata riscontrata in pane prodotto da frumento contaminato, così come in birra e vino.
La ricorrenza di OTA in campioni di vino è stata evidenziata da numerosi studi e sembra predominante in vini Europei come in vini di altre zone del Mondo. Generalmente, i vini rossi presentano livelli superiori di contaminazione da OTA rispetto ai vini bianchi e rosè, e alcune ricerche suggeriscono che le regioni a sud sono più soggette al rischio di contaminazione da OTA. Differenze sono, inoltre, attribuite a fattori climatici, alla tipologia di vitigno, alla tecnologia di vinificazione nonché alle condizioni di conservazione
le mannoproteine parietali dei lieviti si rivelano capaci di adsorbire sostanze presenti nei mosti o nei vini sullo strato più esterno della parete cellulare
Da quanto detto, il ruolo svolto dai lieviti selezionati mediante la loro differente attività di adsorbimento parietale è di grande interesse per l ottenimento di vini dalle sempre migliorate caratteristiche
Selezione clonale.utile per ottenere materiale biologico da impiegare per i processi di miglioramento genetico. Scarsa probabilità di trovare tout court il ceppo di lievito che fa al caso nostro..
I LIEVITI NON HANNO UNA VISIONE ANTROPOCENTRICA DELL UNIVERSO!!!
Miglioramento genetico: approcci diversi -Mutagenesi SELEZIONE -Ibridazione -Ingegneria metabolica - Genome Shuffling
Riproduzione Vegetativa (Agamica o Gemmazione) Interessa sia le cellule aploidi che quelle diploidi è la via preferenziale ed avviene in condizioni ottimali di sviluppo.
Riproduzione Sessuale Si verifica solo con cellule diploidi ed in presenza di un substrato povero di sostanze nutritive 2n
sulla base dell analisi genetica di ceppi parentali di lievito e della loro progenie, il carattere adsorbimento del colore del vino è stato definito ereditabile e poligenico
YPDA ACETATO AGAR x 24 h a 28 C x 12 gg a 28 C
.l incrocio è una tecnica per modificare gli organismi eucarioti, applicata con successo nel generare diversità fra gli animali domestici e tra le piante coltivate. C. Darwin 1859
Ibridazione Intraspecifica Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces cerevisiae
Ibridazione Interspecifica Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces uvarum Ibridi sterili
Caratteri di Base Caratteri di fitness - Basso tempo di generazione - Alta energia di fermentazione - Alta resistenza all anidride solforosa - Ampio range di temperature di crescita - Alta osmotolleranza - Resistenza alla disidratazione/reidratazione Caratteri di qualità - Bassa produzione di acidi volatili - Assenza di off flavour - Assenza di produzione di composti fenolici - Alta produzione di etanolo - Moderata produzione di alcoli superiori - Capacità autolitica - Liberazione di composti glicosilati Altri caratteri - Fattore Killer Caratteri Specifici Vini rossi di alta qualità - Alta produzione di etanolo - Capacità di degradazione dell acido malico - Alta produzione di glicerolo Spumantizzazione in autoclave - Elevato potere schiumogeno Spumantizzazione in bottiglia - Alto potere autolisogeno - Crescita flocculenta Vini fortificati (tipo sherry) - Potere filmogeno
IBRIDAZIONE DIRETTA Genitore A Genitore B Ibrido
IBRIDAZIONE MEDIANTE STUDIO DEI CARATTERI Genitore A Genitore B Coltura da Singola spore Ibrido
2n Asco eppendorf n spore
Micromanipolatore
Rappresentazione schematica del sistema di micromanipolazione obbiettivo Piastra Petri capovolta spore Ago di vetro Sistema di manopole
Immagine delle piastre al micromanipolatore: capostipiti Y I settore Spore ceppo A II settore Spore ceppo B y 1 Spore durante la coniugazione x1 III settore X
capostipiti + Capostipiti (ibridi) (Ibridi) YPDA (sottile)
PCR/RFLP delle regioni ITS NTS2 ITS 1 2 1 2 26 S 5 S 18 S 5.8 S 26 S
RFLP of the ITS regions with HaeIII restriction enzymes S. uvarum Hybrid S. cerevisiae 500 bp 320 bp 220 bp 180 bp 145 bp
Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) of chromosomal DNA of hybrids and their parental strains S. uvarum hybrid S. cerevisiae 2200 kb 365 kb 225 kb
Verifica Molecolare dell avvenuta coniugazione INTRASPECIFICA Amplificazione regioni inter-d
Amplificati inter-d dei genitori AT2-8, 16003 e dei rispettivi ibridi AT2-8 16003 1 2 3 4 5 6 7 8 Secondo gruppo 16003 AT2-8 1= AT2-8 x 16003-1 2= AT2-8 x 16003-2 3= AT2-8 x 16003-3 4= AT2-8 x 16003-4 5= AT2-8 x 16003-5 6= AT2-8 x 16003-6 7= AT2-8 x 16003-7 8= AT2-8 x 16003-8
0,01 % Ceppi esaminati Morfologia Gemmazione Sporificazione N di spore 0,1 % glucosio saccarosi galattosio maltosio lattosio raffinosio trealosio melibioc glucosio saccarosi galattosio maltosio lattosio raffinosio trealosiosio melibioc xilosio L-aabinosio eritritolo D-ribosio cadaverina L-lisina etilammina NO2 NO3 Alofilia Tolleranza Resistenza alla cicloesimide Phenotipic identification Fermentazione Assimilazione Fonti di Azoto NaCl 10% Ac. 1% Lat 4% CTP1 eli UP + 2 + - + - - + + + - - - - - + + - + - + - - - - - - - - - - - CTP2 eli UP - 2 + - + - - + + + - - - - - + + - + - + - - - - - - - - - - - GF3B cil MP - 0 + + + - - - - - - - - - - + - - - - - - - + - - - + + + - - ISA3 sfe UP - 0 + - + - - + + + - - - + - + + + - - + + - - - - - - - - - - ISA8 sfe UP - 0 + - + - - + + + - - - + - + + + - - + + - - - - - - - - - - ISB9 sfe UP - 0 + - + - - + + + - - - + - + + + - - + + - - - - - - - - - - MTS2 eli UP - 0 + - + - - + + + - - - + - + + + - - + + - - - - - - - - - - MTS5 api UP - 0 + - + + - + + + - - - + - + + + - - + + - - - - - - - - - - MZC1 eli MP + 4 - - + + - + + + - - - + - + + + - - + + - - - - - - - - - - CTP3 eli UP + 2 - - + + - + + + - - - - - + + - + - + - - - - - - - - - - - GF3A cil MP - 0 + + + + - - - - - - - - - + - - - - - - - + - - - + + + - - GF3F cil MP - 0 + + + - - - - - - - - - - + - - - - - - - + - - - + + + - - GF2N eli MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - GF5A eli MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - GF5D eli MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - GF5E eli MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - GF5G eli MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - GF7B sfe MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - MTS1 sfe MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - MZC5 sfe MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - MZC6 sfe MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - MZD3 sfe MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - MZD8 sfe MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - MZE1 sfe MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - MZE3 sfe MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - PA1 eli MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - PA9 eli MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - PA5 eli MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - MZD5 sfe MP + 4 - - + - - + + + + - - - - + + + + - + + - - w - - - - - - - Abbreviazioni: Cil = cilindrica; eli = elipsoidale; sfe = sferica; MP = multipolare, UN = unipolare; Ac = acido acetico; Lat = acido lattico.
PROGRAMMA DI RICERCA P.R.I.N. 07/10 E RISLTATI PRELIMINARI Screening su 300 ceppi di lievito di interesse enologico 26 ceppi scelti per il carattere adsorbimento delle OTA in vitro Ottenimento delle colture da singola spora per lo studio della segregazione del carattere adsorbimento OTA Costituzione di ibridi intraspecifici ad alta capacità adsorbente delle OTA ed elevati standard enologici
GRAZIE PER L ATTENZIONE