12 MESI DALL INTRODUZIONE DEL TEST NELLA PRATICA CLINICA

12 MESI DALL INTRODUZIONE DEL TEST NELLA PRATICA CLINICA

01 L esito di PrenatalSafe Karyo e dello studio del cariotipo mediante Array CGH concordano su una delezione di 34 Mb sul cromosoma 5 (Del5p15.32p13.2). Gestante di 31 anni si sottopone a PrenatalSafe 5 a 12 settimane con esito negativo. Chr. 5 Chr. 5 12 W 31 anni 5 Esito negativo Al controllo ecografico morfologico a 20 settimane riceve diagnosi di anomalie ecografiche (ipoplasia del cervelletto, ventricolomegalia), si sottopone a PrenatalSafe Karyo e l esito è confermato dal referto dell amniocentesi (Array-CGH). 20 W Anomalie ecografiche Amniocentesi Array-CGH I test di screening prenatale non invasivi, che analizzano il DNA fetale libero (cfdna) da sangue materno per rilevare le aneuploidie comuni (sui cromosomi 21, 18, 13, X e Y), non possono individuare anomalie cromosomiche strutturali (duplicazioni/delezioni). La gestante ha dovuto eseguire interruzione della gravidanza oltre le 22 settimane. Non è sufficiente eseguire lo screening delle aneuploidie comuni, ma è necessario indagare anche tutti gli altri cromosomi del cariotipo fetale. 2 3

02 Gestante di 32 anni si sottopone a PrenatalSafe 5 alla 13 settimana con esito negativo. L esito di PrenatalSafe Karyo e dello studio del cariotipo mediante Array CGH concordano su due delezioni del cromosoma 18 rispettivamente di 3.8 Mb e 21.3 Mb. (Del18p11.32p11.31) (Del18q21.32q23) Chr. 18 Chr. 18 13 W 32 anni 5 Esito negativo Al controllo ecografico morfologico a 21 settimane riceve diagnosi di anomalie ecografiche (difetto interventricolare, piede torto, intestino iperecogeno e altre anomalie), si sottopone a PrenatalSafe Karyo e l esito è confermato dal referto dell amniocentesi (Array-CGH). 21 W Anomalie ecografiche Amniocentesi Array-CGH I test di screening prenatale non invasivi, che analizzano il DNA fetale libero (cfdna) da sangue materno per rilevare le aneuploidie comuni (sui cromosomi 21, 18, 13, X e Y), non possono individuare delezioni/duplicazioni segmentali anche se presenti sui cromosomi indagati. La gestante ha dovuto eseguire interruzione della gravidanza oltre le 23 settimane. Sui 5 cromosomi investigati di routine (13, 18, 21, X e Y), come su tutti gli altri cromosomi, è necessario indagare, non solo le aneuploidie, ma anche le anomalie strutturali come delezioni/duplicazioni segmentali. 4 5

03 CROMOSOMA 7 CROMOSOMA 9 Gestante di 32 anni portatrice consapevole di traslocazione reciproca si sottopone a PrenatalSafe Karyo alla 11 settimana con esito di traslocazione sbilanciata nel feto. 11W 32 anni (46, xx)(7;9)(p15;q22) La gestante a 12 settimane si sottopone a villocentesi. Il referto dello studio del cariotipo Array-CGH conferma la traslocazione sbilanciata rilevata da PrenatalSafe Karyo rispettivamente di 15 Mb sul cromosoma 7 e di 107.5 Mb sul cromosoma 9. I test di screening prenatale non invasivi, che analizzano il DNA fetale libero (cfdna) da sangue materno per rilevare le aneuploidie comuni (sui cromosomi 21, 18, 13, X e Y), non possono individuare anomalie cromosomiche strutturali, come le traslocazioni sbilanciate, presenti sui cromosomi non indagati. Villocentesi Array-CGH 6 12w La gestante ha potuto eseguire interruzione della gravidanza a 12 settimane. Non è sufficiente eseguire lo screening delle aneuploidie comuni, ma è necessario indagare anche tutti gli altri cromosomi del cariotipo fetale. 7

04 Gestante di 40 anni si sottopone ad un test del cfdna nel sangue materno (studio dei 5 cromosomi) alla 13 settimana con esito di alto rischio per trisomia 21. L esito di PrenatalSafe Karyo evidenza la presenza di un picco di DNA sul cromosoma 21 che suggerisce la presenza di CNV (copy number variation) su cariotipo materno. CARIOTIPO MATERNO Chr. 21 Chr. 21 13 W 40 anni Test del cfdna fetale Trisomia 21 a 5 cromosomi Prima di sottoporsi a tecniche invasive, la paziente decide di confermare il risultato eseguendo un altro test di screening del cfdna, e sceglie di sottoporsi al Prenatalsafe Karyo. L'esito di questo esame è negativo per la presenza di Trisomia 21 nel feto, viene identificata una CNV (probabile origine materna). Il successivo studio del cariotipo della gestante conferma l origine materna della CNV. I test di screening prenatale non invasivi, che analizzano il DNA fetale libero (cfdna) da sangue materno per rilevare le aneuploidie comuni (sui cromosomi 21, 18, 13, X e Y), non possono individuare anomalie cromosomiche strutturali, quali le duplicazioni e le delezioni segmentali, su nessun cromosoma, nemmeno sui cromosomi indagati. Evitata indagine invasiva non necessaria I risultati di PrenatalSafe Karyo hanno evidenziato un anomalia riconducibile a CNV materna, e non a trisomia, e hanno permesso alla gestante di evitare un indagine invasiva. Sui 5 cromosomi investigati di routine(13, 18, 21, X e Y), come su tutti gli altri cromosomi, è necessario indagare non solo le aneuploidie, ma anche le anomalie strutturali anche allo scopo di evitare falsi positivi e falsi negativi dovuti a CNV materne. 8 9

COPY NUMBER VARIATION The New England Journal of Medicine Copy-Number Variation and false positive prenatal screening results. (Chudova et al., 2016 NEJM) Fenomeno per il quale una porzione di un cromosoma può essere deleta o ripetuta n volte, variando il numero di copie originale da 2 verso n. Le CNV possono essere innocue e avere solo significato di variabilità genetica. (Snyder et al., 2015 NEMJ) Una CNV materna può alterare l esito del test del cfdna fetale La presenza di una CNV materna in duplicazione può indurre il sistema a rilevare una maggiore presenza di DNA in corrispondenza del cromosoma portatore, e di conseguenza a rivelare un falso positivo nello stesso cromosoma fetale. La presenza di CNV materna in delezione potrebbe, allo stesso modo, indurre il sistema a rilevare una minore presenza di DNA, e quindi influenzare il sistema a produrre un esito falso negativo. Table 1. Algorithm Improvements and Reductions in False Positive Results. SAMPLE NO. Original Result (as Reported in CARE Study)* New Resul (current Algorithm) Explanation 1 Trisomy 13 Trisomy 13, female infant Complete chromosome 13 gain coonfirmed on reanalysis 2 Trisomy 13 Euploid 3 Trisomy 13 Euploid Material copy-number variant of approximately 5 Mb on chromosome 13q Material copy-number variant of approximately 8 Mb on chromosome 13q 4 Trisomy 18 Trisomy 18, female infant Complete chromosome 18 gain confirmed on renalysis Difference between fetal fraction determined by chromosomes X and 18 suggests chromosome 18 mosaicism 5 Trisomy 18 Euploid Material copy-number variant of approximately 2to 3 Mb on chromosome 18p 6 Trisomy 18 Euploid Reduce coverage variability given additional normalization steps in current algorithm 7 Trisomy 18 Euploid Reduce coverage variability given additional normalization steps in current algorithm 8 Trisomy 18 Trisomy 21, male infant Complete chromosome 21 gain confirmed on renalysis Difference between fetal fraction determined by chromosomes X and 21 suggests chromosome 21 mosaicism 9 Trisomy 18 Trisomy 21, male infant Complete chromosome 21 gain confirmed on renalysis Difference between fetal fraction determined by chromosomes X and 21 suggests chromosome 21 mosaicism 10 Trisomy 18 Trisomy 21, female infant Complete chromosome 21 gain confirmed on renalysis 11 Trisomy 21 and 18 Euploid Reduce coverage variability given additional normalization steps in current algorithm The New England Journal of Medicine Improving The Accuracy of Prenatal Screening with DNA Copy-Number Analysis (Strom et al., 2017 NEJM) Table 1. Identification of Maternal Microduplications as a Source of False Positive Results on Noninvasive Prenatal Screening.* CHROMOSOME Positive Trisomy Maternal Microduplication Confirmed on Microarray Analysis Improvement in Positive Predictive Value Number of patients percentage points 21 313 12 9 +4 (from 94% to 98%) 18 106 21 3 +20 (from 72% to 92%) 13 93 28 2 +30 (from 39% to 69%) 10 11

05 CROMOSOMA 13 CROMOSOMA 20 Gestante di 32 anni portatrice inconsapevole di traslocazione reciproca si sottopone a PrenatalSafe Karyo alla 12 settimana con esito di traslocazione sbilanciata nel feto. 12W 32 anni (46, xx)(7;9)(p15;q22) (del13q33.1q34; dup20q13.33) La gestante riceve esito all ecografica di anomalie ecografiche (sacchi giugulari e igroma cistico) e a 15 settimane si sottopone a villocentesi. Il referto dello studio del cariotipo Array-CGH conferma la traslocazione sbilanciata rilevata da PrenatalSafe Karyo rispettivamente di 11,4 Mb sul cromosoma 13 e di 1,9 Mb sul cromosoma 20. I test di screening prenatale non invasivi, che analizzano il DNA fetale libero (cfdna) da sangue materno per rilevare le aneuploidie comuni (sui cromosomi 21, 18, 13, X e Y), non possono individuare anomalie cromosomiche strutturali (duplicazioni/delezioni) sui cromosomi non indagati. Anomalie ecografiche 12 Villocentesi Array-CGH La gestante ha potuto eseguire interruzione della gravidanza a 15 settimane. 15w Non è sufficiente eseguire lo screening delle aneuploidie comuni, ma è necessario indagare anche tutti gli altri cromosomi del cariotipo fetale, sia nel numero che nella struttura. 13

06 L esito di PrenatalSafe Karyo e dello studio del cariotipo mediante Array-CGH concordano su una duplicazione di 16 Mb sul cromosoma 11 (Dup11p15.1p15.4). Gestante di 38 anni si sottopone a PrenatalSafe Karyo a 10 settimane con esito di duplicazione sul braccio corto del cromosoma 11. Chr. 11 Chr. 11 10 W 38 anni A 16 settimane la gestante si sottopone ad amniocentesi che conferma la duplicazione sul braccio corto del cromosoma 11. I test di screening prenatale non invasivi, che analizzano il DNA fetale libero (cfd- NA) da sangue materno per rilevare le aneuploidie comuni (sui cromosomi 21, 18, 13, X e Y), non possono individuare anomalie cromosomiche su altri cromosomi. Amniocentesi Array-CGH La gestante ha ricevuto una diagnosi tempestiva. Non è sufficiente eseguire lo screening delle aneuploidie comuni, ma è necessario indagare anche tutti gli altri cromosomi del cariotipo fetale. 14 15

07 L esito di PrenatalSafe Karyo Plus e dello studio del cariotipo mediante Array- CGH concordano sulla presenza di una microdelezione del cromosoma 22 di 4 Mb riconducibile alla sindrome di DiGeorge. (Del22q11.21). Gestante di 31 anni si sottopone ad amniocentesi (studio citogenetico del cariotipo fetale) con esito negativo. Chr. 22 Chr. 22 31 anni Amniocentesi Cariotipo fetale 46, XY Studio citogenetico Al controllo ecografico morfologico a 20 settimane riceve diagnosi di anomalie ecografiche (quadro compatibile con sindrome di DiGeorge). Si sottopone a PrenatalSafe Karyo Plus e nuovamente ad amniocentesi (studio del cariotipo fetale Array-CGH). La presenza di sindrome di DiGeorge è confermata. 20 W Lo studio citogenetico del cariotipo rileva le anomalie numeriche (aneuploidie) e strutturali (delezioni/duplicazioni) del cariotipo fetale, ma non rileva le anomalie di piccole dimensioni come le microdelezioni. Anomalie ecografiche Plus Amniocentesi Array-CGH La gestante ha ricevuto la diagnosi dopo oltre 20 settimane. Non è sufficiente lo studio citogenetico del cariotipo fetale per escludere la presenza di sindromi da microdelezione. 16 17

08 L esito di PrenatalSafe Karyo e dello studio del cariotipo mediante Array-CGH concordano su una delezione di 58.5 Mb sul cromosoma X. (delxp22.33p11.1). Gestante di 35 anni si sottopone a PrenatalSafe Karyo a 12 settimane con esito di delezione sul braccio corto del cromosoma X. Chr. X Chr. X 12 W 35 anni A 16 settimane la gestante si sottopone ad amniocentesi che conferma la delezione sul braccio corto del cromosoma X. I test di screening prenatale non invasivi, che analizzano il DNA fetale libero (cf- DNA) da sangue materno per rilevare le aneuploidie comuni (sui cromosomi 21, 18, 13, X e Y), non possono individuare delezioni/duplicazioni segmentali anche se presenti sui cromosomi indagati. Amniocentesi Array-CGH La gestante ha ricevuto una diagnosi tempestiva. Sui 5 cromosomi investigati di routine (13, 18, 21, X e Y), come su tutti gli altri cromosomi, è necessario indagare, non solo le aneuploidie, ma anche le anomalie strutturali come delezioni/duplicazioni segmentali. 18 19

09 L esito di PrenatalSafe Karyo e dello studio del cariotipo mediante Array-CGH concordano su una duplicazione di 15.4 Mb sul cromosoma 18. (dup18p11.32p11.21). Gestante di 40 anni si sottopone a PrenatalSafe Karyo a 11 settimane con esito di duplicazione sul braccio corto del cromosoma 18. 11 W 40 anni A 12 settimane la gestante si sottopone a villocentesi che conferma la duplicazione sul braccio corto del cromosoma 18. Chr. 18 I test di screening prenatale non invasivi, che analizzano il DNA fetale libero (cfdna) da sangue materno per rilevare le aneuploidie comuni (sui cromosomi 21, 18, 13, X e Y), non possono individuare delezioni/duplicazioni segmentali anche se presenti sui cromosomi indagati. Villocentesi Array-CGH La gestante ha ricevuto una diagnosi tempestiva. Sui 5 cromosomi investigati di routine (13, 18, 21, X e Y), come su tutti gli altri cromosomi, è necessario indagare, non solo le aneuploidie, ma anche le anomalie strutturali come delezioni/duplicazioni segmentali. 20 21

10 L esito di PrenatalSafe Karyo e dello studio del cariotipo tradizionale concordano su una Trisomia 9 (a mosaico). 46,XX[80]/47,XX,+9[20] Gestante di 42 anni si sottopone a PrenatalSafe Karyo a 14 settimane con esito di Trisomia 9. Chr. 9 14 W 42 anni A 16 settimane la gestante si sottopone ad amniocentesi che conferma la Trisomia 9 (mosaico 20%). I test di screening prenatale non invasivi, che analizzano il DNA fetale libero (cfdna) da sangue materno per rilevare le aneuploidie comuni (sui cromosomi 21, 18, 13, X e Y), non possono individuare aneuploidie cromosomiche sui cromosomi non indagati. Il PrenatalSafe Karyo ha permesso di rilevare un'aneuploidia a mosaico. Amniocentesi Cariotipo Tradizionale La gestante ha ricevuto una diagnosi tempestiva ed ha deciso di interrompere la gravidanza. Non è sufficiente eseguire lo screening delle aneuploidie comuni, ma è necessario indagare anche tutti gli altri cromosomi del cariotipo fetale 22 23

11 L esito di PrenatalSafe Karyo e dello studio del cariotipo tradizionale concordano su una Trisomia 22 (a mosaico). 46,XY[42]/47,XY,+22[8] STUDIO TRADIZIONALE DEL CARIOTIPO Gestante di 40 anni si sottopone a PrenatalSafe Karyo a 10 settimane con esito di Trisomia 22. Chr. 22 10 W 40 anni A 16 settimane la gestante si sottopone ad amniocentesi che conferma la Trisomia 22 (mosaico 16%). I test di screening prenatale non invasivi, che analizzano il DNA fetale libero (cfdna) da sangue materno per rilevare le aneuploidie comuni (sui cromosomi 21, 18, 13, X e Y), non possono individuare aneuploidie cromosomiche sui cromosomi non indagati. Il PrenatalSafe Karyo ha permesso di rilevare una aneuploidia a mosaico. Amniocentesi Cariotipo Tradizionale La gestante ha ricevuto una diagnosi tempestiva ed ha deciso di interrompere la gravidanza. Non è sufficiente eseguire lo screening delle aneuploidie comuni, ma è necessario indagare anche tutti gli altri cromosomi del cariotipo fetale. 24 25

12 L esito di PrenatalSafe Karyo e dello studio del cariotipo tradizionale concordano su una Trisomia 7 (a mosaico). 46,XX[48]/47,XX,+7[2] STUDIO TRADIZIONALE DEL CARIOTIPO Gestante di 31anni si sottopone a PrenatalSafe Karyo a 12 settimane con esito di Trisomia 7. Chr. 7 12 W 31 anni A 16 settimane la gestante si sottopone ad amniocentesi che conferma la Trisomia 7 (mosaico 4%). I test di screening prenatale non invasivi, che analizzano il DNA fetale libero (cfdna) da sangue materno per rilevare le aneuploidie comuni (sui cromosomi 21, 18, 13, X e Y), non possono individuare anomalie cromosomiche sui cromosomi non indagati. Il PrenatalSafe Karyo ha permesso di rilevare una aneuploidia a mosaico. Amniocentesi Cariotipo Tradizionale La gestante ha ricevuto una diagnosi tempestiva e ha deciso di continuare nella gravidanza. Non è sufficiente eseguire lo screening delle aneuploidie comuni, ma è necessario indagare anche tutti gli altri cromosomi del cariotipo fetale 26 27

CONFRONTO SCREENING CFDNA SU 5 CROMOSOMI VS. Conventional cfdna screening No. of pregnancies assessed 12.114 12.114 Clinical relevant chromosomal abnormalities detected - no. 166 196 P-value PERFORMANCE Trisomy 21 (n=12.114) Trisomy 18 (n=12.114) Trisomy 13 (n=12.114) SCA (n=12.114) Rare Trisomy (n=12.114) CNV (n=12.114) False positive - no. 1 1 1 12 7 5 False negative - no. 0 0 0 0 0 0 True positive - no 88 15 12 36 10 8 True negative - no. 12.025 12.098 12.101 12.066 12.097 12.101 Pregnancies confirmed as chromosomally abnormal - no. 151 169 Sensitivity ( 95% CI ) - % Specificity ( 95% CI ) - % (95.89%-) 99.99% (99.95%-) (78.20%-) 99.99% (99.95%-) (73.54%-) 99.99% (99.95%-) (90.26%-) 99.90% (99.82%-9995%) (69.15%-) 99.94% (99.88%-99.98%) (63.06%-) 99.96% (99.90%-99.99%) False Positive 15 27 False Negative 12* 0 True Positive 151 169 Positive Predictive Value ( 95% CI ) - % Negative Predictive Value ( 95% CI ) - % 98.88% (92.54%-) (99.95%-) 93.75% (67.88%-99.07%) (99.95%-) 92.31% (62.83%-98.84%) (99.95% to ) 75.00% (63.02%-84.08%) (99.95%-) 58.82% (40.52%-74.97%) (99.95%-) 61.54% (39.98%-79.35%) (99.95%-) Fiorentino et al., submitted True Negative 11.936 11.918 Sensitivity 92.64% <0.001 Specificity 99.87% 99.77% 0.064 Positive Predictive Value (PPV) 90.96% 86.22% 0.161 Negative Predictive Value (NPV) 99.90% <0.001 ^ Clinically relevant chromosomal abnormalities, not detected by conventional cfdna screening, potentially resulting in the birth of babies with chromosomal anomalies, have been considered as false negative. A P-value of less than 0.05 was considered to indicate statistical significance RIASSUMENDO PrenatalSafe Karyo rappresenta la tecnologia non invasiva più sensibile, e che rileva il più ampio livello d informazione, oggi disponibile in epoca prenatale. PrenatalSafe Karyo : validazione pre-clinica su 1419 casi, con sensibilità e specificità del 100%. PrenatalSafe Karyo : studio prospettico su 12.000 casi clinici, con sensibilità del 100% e specificità del 99.77%. I casi clinici presentati dimostrano l importanza di ampliare la ricerca d informazione a tutto il cariotipo fetale, e la necessità di NON limitare lo studio alle aneuploidie comuni, ma estenderlo alle aneuploidie rare ed alle anomalie cromosomiche strutturali. 28 29

PLUS RILEVA IL 99.1% DELLE ANOMALIE CROMOSOMICHE RISCONTRATE ALLA NASCITA PLUS RILEVA IL 99.5% DELLE ANOMALIE CROMOSOMICHE RILEVABILI IN EPOCA PRENATALE Aneuploidie rilevabili con PrenatalSafe 5 Anomalie non rilevabili 52.5% Trisomia 21 13.3% Trisomia 18 5.2% Trisomia 13 7.5% Monosomia X 4.6% Trisomie dei cromosomi sessuali 16.9% Anomalie cromosomiche non rilevabili Un livello di approfondimento d indagine possibile fino a oggi solo con l analisi del cariotipo fetale, mediante tecniche invasive di diagnosi prenatale Cariotipo Tradizionale Cariotipo Molecolare Plus Plus Incidenza aneuploidie cromosomiche aggiunte rilevabili con 3 5 16.9% 71.0 % 83.1 % 86.0 % 92.6 % 4.2 % Delezioni 2.9 % Microdelezioni 2.1 % Traslocazioni Sbilanciate 1.6 % Duplicazioni 1.0 % Markers 0.6 % Altre Trisomie 2.8 % Triploidie 0.8 % Trisomie Mosaico 0.6 % Trisomie Mosaico 0.1 % Triploidie 0.2 % Altro 95.5 % 96.9 % 99.8 % Rilevate in diagnosi prenatale Rilevate alla nascita Aneuploidie rilevabili con PrenatalSafe Karyo Anomalie non rilevabili (non compatibili con la vita) Anomalie non rilevabili 30 31

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