Journal Club 14/6/2012 Dott.ssa Maria Elena Conidi CENTRO REGIONALE DI NEUROGENETICA
Malattia di Niemann-Pick di tipo C (NPC) è un disordine «neuroviscerale» (AR) con accumulo anomalo di colesterolo e glicosfingolipidi nel sistema endosoma-lisosoma (EL). Questi difetti di «sequestro» del colesterolo attivano un anormale funzione di fegato e milza così come deficit neurologici diffusi quali atassia, distonia, epilessia e demenza che possono portare a morte prematura. NPC è causata da mutazioni di tipo «loss of function» nel gene NPC1, che codifica per una glicoproteina transmembrana coinvolta nel trasporto intracellulare del colesterolo. Tali mutazioni sono accompagnate da perdita di neuroni nel cervelletto ma non nell ippocampo.
Evidenza 1 Modelli murinici Topi transgenici Ncp1 -/- si presentano asintomatici alla nascita ma sviluppano gradualmente tremore e atassia morendo prematuramente tra la 10-12 settimana di età. A livello cellulare: Accumulo di colesterolo non esterificato nel sistema EL; Attivazione della microglia e astrociti; Perdita del rivestimento mielinico in tutto il sistema nervoso centrale; Evidente perdita progressiva di neuroni anche nella corteccia prefrontale, talamo, tronco encefalico e cervelletto, ma meno nell ippocampo. Fenotipi simili a quelli osservati nella NPC nell uomo!!
Evidenza 2 Alterazioni nei livelli/distribuzione di colesterolo possono influenzare il sorting/processing di diverse proteine inclusa la «proteina precursore amiloide» (APP) da cui si originano i peptidi di Aβ amiloide. Gli Aβ peptidi sono coinvolti nella degenerazione delle sinapsi e neuroni nella malattia di Alzheimer che mostra similitudini con la NPC. - livelli/accumulo di colesterolo : di Aβ peptidi - Inibizione della sintesi del colesterolo: Aβ. - NPC alterata distribuzione di PS1 Aβ peptidi. Aβ 1-42 e βctf in regioni vulnerabili di cervelli NPC. APP Sebbene maturo (al questi centro) risultati è metabolizzato suggeriscono mediante un ruolo 2 pathways: per la Aβ nello sviluppo e progressione A) Il della pathway patologia -secretasi nella che NPC genera si sa molto sapp poco e C83 riguardo l origine cellulare o la sua B) Il associazione, pathway ß-secretasi esiste, che con genera la vulnerabilità sappß e C99. neuronale osservata nei cervelli con NPC Tutti i frammenti C-terminali (C83, C99) sono substrati per la -secretasi, generando il dominio intracellulare di APP (AICD) e, rispettivamente, il peptide p3 (non in figura) e Aß (a destra). Aß si aggrega in piccoli oligomeri (dimeri, trimeri, etc.).
. Quali sono i cambiamenti cellulari associati alla degenerazione di specifiche popolazioni neuronali nei topi Ncp1 -/-??? Scopo 1 Valutare i cambiamenti età-correlati nei livelli e distribuzione di APP, BACE1, ϒ-secretasi nell ippocampo e nel cervelletto dei topi Ncp1 -/- e di controllo. Scopo 2 Misurare l attività delle α- e β-secretasi, così come dei livelli di α- e β- CTF per stabilire se il processing dell APP è alterato nei topi Ncp1 -/- con conseguente aumento di Aβ peptidi.
Risultati (1) Distribuzione intracellulare alterata del colesterolo, perdita di neuroni ed attivazione della glia nei topi Ncp1 -/- di 4, 7, 10 settimane mediante FILIPIN STAINING e FLUORO-JADE C STAINING 1) Presenza di colesterolo in molti neuroni di ippocampo e cervelletto nei nei topi Ncp1 -/- di 10 settimane. 2) Grande numero di microglia attivata e alcuni astrociti reattivi sono marcati con filipin ed una up-regulation della microglia (verdi) ed astrociti (rossi) reattivi nell ippocampo e cervelletto. 3) Perdita di neuroni nel cervelletto(o-p) ma non nell ippocampo (M-N). 4-7 settimane. 4) Riduzione progressiva della densità delle fibre mielinate (4- e 10- settimane).
Risultati (2) Livelli ed espressione di APP nei topi Ncp1 -/- IMMUNOBLOTTING ED IMMUNOSTAINING I livelli di APP nell ippocampo: significativamente aumentato solo a 10 settimane mentre nel cervelletto era evidente già a 7 settimane. L espressione totale dell APP risulta poco incrementata nei neuroni dell ippocampo e cervelletto. Mentre sono stati identificati astrociti reattivi che esprimono elevati livelli di APP nelle regioni dell ippocampo e cervelletto a 4-, 7- e 10 settimane (43% degli astrociti ippocampali; 54% degli astrociti cerebellari) La microglia attivata non esprime APP nel cervello dei topi Ncp1 -/- a nessuna età.
Risultati (3) Livelli e distribuzione di BACE1 e ϒ-secretasi nei topi Ncp1 -/- IMMUNOBLOTTING ED IMMUNOSTAINING L eliminazione di Npc1: aumenta significativamente i livelli di BACE1 nell ippocampo e cervelletto a 10 e 7 settimane aumenta i livelli dei componenti delle ϒ-secretasi a 7 sett nell ippocampo e cervelletto Aumenta i livelli di PSEN1 nell ippocampo e nel cervelletto a 10 settimane. Rispetto ai controlli, la loro espressione aumenta in modo modesto nell ippocampo e cervelletto a partire dalla 7 settimana e l incremento è parzialmente evidente anche nelle cellule del Purkinje cerebellari.
Risultati (4) Livelli e distribuzione di BACE1 e ϒ-secretasi nei topi Ncp1 -/- IMMUNOBLOTTING ED IMMUNOSTAINING Nell ippocampo e nel cervelletto è stato osservato un sottogruppo di astrociti reattivi esprimere BACE1 e le ϒ-secretasi, anche se il numero relativo di astrociti esprimenti BACE1 e le ϒ-secretasi sono considerevolmente più alti nel cervelletto. La microglia attivata non esprime BACE1 e le ϒ- secretasi né nell ippocampo né nel cervelletto a nessuna età esaminata
Risultati (4) Attività delle α-secretasi + β-secretasi nei topi Ncp1 -/- mediante IMMUNOBLOTTING L attività delle α-secretasi non viene alterata dalla eliminazione di Npc1 L attività di BACE1 è significativamente più alta sia nell ippocampo che nel cervelletto in tutti i gruppi di età. I livelli di α- e β-ctf sono marcatamente elevati nel cervelletto a 10 settimane e non alterati nell ippocampo.
CONCLUSIONI Questo studio dimostra che alterati livelli/distribuzione del colesterolo nel cervello dei topi Ncp1 -/- è associato con livelli/espressioni incrementati di APP e β-secretasi nel cervelletto e delle Υ secretasi anche nell ippocampo. Considerando che una parte dell APP cellulare, così come β-ϒ secretasi sono localizzati in domini ricchi di colesterolo, è verosimile che un incremento o un alterata distribuzione del colesterolo aumenta il pathway amiloidogenico dell APP. In linea con quanto detto, questo studio ha evidenziato significativi aumenti nei livelli/espressione dell APP e dei suoi enzimi di processamento (es. BACE1) nell ippocampo ed in particolare nel cervelletto suggerendo un incremento del potenziale amiloidogenico colesterolomediato. Anche gli astrociti reattivi, che giocano un ruolo critico nella patogenesi della NPC esprimono elevati livelli di APP, β e ϒ secretasi. Sebbene l attività delle β-secretasi è notevolmente aumentata nel cervello dei topi Npc1 -/- nei diversi gruppi di età, i frammenti α- e β-ctf aumentano solo nel cervelletto di topi Npc1 -/- a 10 settimane. Mentre l aumento dei livelli di β-ctf può rappresentare l incremento di produzione/accumulo nei neuroni cerebellari, è possibile che l aumento delle α-ctf rifletta la riduzione della clearance lisosomiale di questo polipeptide in assenza di NCP1. L alterata distribuzione del colesterolo può aumentare i livelli/espressione di APP e degli enzimi coinvolti nel suo processamento sia nei neuroni che negli astrociti reattivi, contribuendo sia direttamente che indirettamente alle caratteristiche patologiche associate alla NPC.