Il ruolo della misura del monossido di azoto nell aria espirata in patologia

Vol. 96, N. 12, Dicembre 2005 Pagg. 634-640 Il ruolo della misura del monossido di azoto nell aria espirata in patologia Giovanni Rolla, Enrico Heffler, Luisa Bommarito, Roberta Bergia, Nicoletta Ferrero Riassunto. La possibilità di misurare in vivo la quantità di monossido di azoto (NO) prodotto dall apparato respiratorio mediante un sistema non invasivo ha aperto un nuovo e stimolante campo di ricerca, che ha già trovato applicazione clinica nel monitoraggio del paziente asmatico. Fisiologicamente il monossido di azoto svolge svariate e importanti funzioni, che spaziano dalla regolazione del tono bronchiale e vascolare, alla motilità ciliare, alla difesa anti microbica. La sede di maggior produzione di NO è nei seni paranasali, seguita dalle vie aeree e, infine, dal compartimento bronchiolo-alveolare. Una ridotta produzione sinusale di NO è associata alla discinesia ciliare, caratterizzata clinicamente da grave sinusite cronica e bronchiectasie. NO è prodotto in quantità nettamente superiori alla norma in alcune patologie caratterizzate da flogosi delle vie aeree, come l asma bronchiale, nella quale la sua concentrazione nell aria espirata è correlata con indici funzionali (iperreattività delle vie aeree) e citologici (eosinofilia nell escreato) di flogosi. La concentrazione di NO nell espirato nell asma è un indice sensibile di flogosi delle vie aeree, che varia rapidamente in risposta alla terapia anti-infiammatoria o all esacerbazione della malattia. L applicazione clinica della misurazione di NO nell espirato nell asma costituisce un importante mezzo per valutare nel tempo l aderenza alla terapia e la sua efficacia, l attività di malattia, la diagnosi e per predire le esacerbazioni. Altre patologie associate ad aumentata produzione di NO, ma in misura minore rispetto all asma, sono la BPCO, le bronchiectasie ed alcune connettiviti (LES e sclerosi sistemica). Una produzione aumentata di NO a livello alveolare, infine, sarebbe alla base delle anomalie dell ossigenazione riscontrabili nei pazienti affetti da epatopatie, soprattutto se complicate dalla sindrome epato-polmonare. Parole chiave. Asma, interstiziopatie polmonari, monossido di azoto esalato, sindrome epatopolmonare. Summary. Exhaled nitric oxide as a marker of diseases. Recently a method to measure nitric oxide (NO) concentration in exhaled air has been developed. The method is nonivasive and easy to perform and it provides information on a fascinating molecule, with such extensive respiratory functions, ranging from bronchial and vascular dilation to ciliary motion and antibacterial defense. Nasal and sinus cavities are the site of major NO production, followed by airway and alveolar compartment. A very low nasal NO production is associated with ciliary diskinesia, a disease characterized by severe chronic sinusitis and bronchiectasis. An increased concentration of NO in exhaled air has been reported in airway diseases, characterized by airway inflammation, such as bronchial asthma, where its concentration is related to bronchial hyperresponsiveness and sputum eosinophilia. Exhaled NO concentration in asthma is a sensitive marker of airway inflammation that reacts rapidly in response to treatment or exacerbation of disease. Clinical application of exhaled NO measurement include monitoring compliance and response to treatment, disease activity, diagnosis of asthma, and the prediction of acute exacerbations. Exhaled NO concentration may be increased also in other diseases, as COPD, bronchiectasis and some connective tissue diseases (SLE and systemic sclerosis). An increased NO production from alveolar source has been shown to be involved in oxygenation impairment of patients with liver disease, particularly in case of hepato-pulmonary syndrome. Key words. Asthma, exhaled nitric oxide, hepatopulmonary syndrome, interstitial lung diseases. Allergologia e Immunologia Clinica dell Università, Ospedale Mauriziano Umberto I, Torino. Pervenuto il 31 marzo 2005.

G. Rolla et al.: Il ruolo della misura del monossido di azoto nell aria espirata in patologia 635 Introduzione La storia della misura del monossido di azoto (NO) nell aria espirata è molto curiosa, in quanto l NO era misurato nell aria ambiente ben prima che fosse scoperto quale prodotto da molte cellule degli organismi, dove esercita importanti e svariate funzioni di mediatore. Il monossido di azoto, infatti, come altri ossidi di azoto (NO 2 e, più genericamente, NO x ) è un inquinante, generato prevalentemente dalla combustione dei motori a scoppio. La misura degli ossidi di azoto è inclusa da anni nel monitoraggio della qualità dell aria delle nostre città. Negli anni 80 gli studi di Robert Furchgott, Louis Ignaro e Ferid Murad portarono alla scoperta che l - NO era sintetizzato da molte cellule e svolgeva importanti funzioni di mediatore, tra le quali quelle di rilasciamento della muscolatura liscia vascolare, attribuite prima al fattore endoteliale di rilasciamento muscolare, attraverso l aumento del cgmp. Per questi studi i tre scienziati ricevettero il premio Nobel per la fisiologia nel 1998. Nel 1991 Gustafsson e collaboratori, al Karolinska Institut, riuscivano per la prima volta a misurare il monossido di azoto endogeno, prodotto nell apparato respiratorio, nell aria espirata di diversi animali e dell uomo 1 e, nel 1993, Alving e coll. trovavano che la concentrazione di NO nell aria espirata era più elevata nei pazienti asmatici rispetto ai controlli normali 2. Il monossido di azoto è un gas incolore ed inodore, sintetizzato a partire dall aminoacido L-arginina ad opera di una famiglia di enzimi, denominati NO-sintetasi (NOS), dei quali esistono almeno tre isoforme: due isoforme Ca ++ dipendenti, espresse in modo costitutivo su molte cellule (enos è l isoforma endoteliale e nnos quella neuronale) ed una isoforma Ca ++ indipendente (inos), espressa dalle cellule endoteliali, dai macrofagi, dalle cellule infiammatorie e dalle cellule epiteliali dell apparato respiratorio (figura 1). Le forme costitutive di NOS promuovono la sintesi continuativa di piccole quantità di NO, quantità adatte a svolgere funzioni fisiologiche. Tra le funzioni fisiologiche svolte dal monossido di azoto nell apparato respiratorio si annoverano: il rilasciamento della muscolatura liscia bronchiale e vascolare (esso è il più potente vasodilatatore endogeno del piccolo circolo), la motilità ciliare, l azione batteriostatica. La forma inducibile di NOS, invece, promuove la sintesi di notevoli quantità di NO, che, ad alte concentrazioni, esercita azioni lesive sulle cellule, soprattutto per la combinazione con i radicali dell ossigeno, dando luogo alla formazione di composti tossici, come ad esempio i perossinitriti. Figura 1. Reazione di sintesi del monossido di azoto (NO) per azione della No-sintetasi (NOS). L espressione della inos può essere indotta da numerosi stimoli, in particolare dalle citochine infiammatorie, attraverso, probabilmente, il fattore di trascrizione STAT-1 3. Misura della concentrazione di NO nell aria espirata Il metodo di misurazione della concentrazione di NO nell aria espirata più usato è quello a chemiluminescenza, basato sulla reazione dell ossido nitrico del campione con l ozono generato nella cella di misura dell apparecchio. Il metodo consente di rilevare concentrazioni di NO fino a 1 parte per bilione (ppb). NO è continuamente formato nelle vie aeree e la sua concentrazione misurata alla bocca varia con il variare del flusso espiratorio. È perciò della massima importanza registrare il flusso espiratorio al quale viene misurata la concentrazione. Le linee guida dell American Thoracic Society hanno fissato in 50 ml/s il flusso al quale deve essere misurata la concentrazione di NO 4. La misurazione di NO nell aria espirata è di solito fatta on-line su singola espirazione. La tecnica prevede che il soggetto inspiri aria priva di NO (< 5 ppb) attraverso un boccaglio fino a capacità polmonare totale e che quindi espiri completamente a flusso costante (50 ml/s) nello strumento di misura. Durante l espirazione viene creata una contro-pressione di 10-15 cmh 2O che, assicurando la chiusura del palato molle, previene la contaminazione del campione da parte di aria proveniente dalle cavità nasali. Questo è molto importante, perché nel naso vi sono concentrazioni di NO molto alte, fino a 100 volte più alte delle concentrazioni di NO presenti nelle vie aeree (figura 2 a pagina seguente).

636 Recenti Progressi in Medicina, 96, 12, 2005 questa infiltrazione cellulare delle vie aeree consistono nel danneggiamento dell epitelio, nella contrazione e ipertrofia della muscolatura liscia bronchiale, nell edema della parete e nell aumento delle secrezioni bronchiali, che sono particolarmente tenaci. Figura 2. Disegno schematico che mostra i valori di NO misurabili nei diversi tratti dell apparato respiratorio. Le elevate concentrazioni di NO nei seni paranasali si pensa abbiano un importante ruolo di difesa anti-microbica. Nella discinesia ciliare, patologia caratterizzata da sinusiti e bronchiectasie, le concentrazioni di NO nasale sono basse, tanto che è stato proposto di usare la misurazione della concentrazione di NO nasale come esame di primo livello per accertare la presenza di discinesia ciliare. Un valore di NO nasale < a 250 ppb ha un valore predittivo positivo di 83% e un valore predittivo negativo di 97% nei confronti di questa patologia 5. La riproducibilità della misura di NO nell aria espirata è molto buona, quando vengano rispettate le procedure riportate nel documento ATS già citato 4. La deviazione standard di misure ripetute dallo stesso soggetto nella stessa seduta è stata calcolata essere 2,11 ppb, suggerendo così che una variazione di NO di almeno 4 ppb possa essere indicativa di una variazione dello stato di flogosi delle vie aeree 6. La misura del monossido di azoto può anche essere eseguita su un campione di aria espirata raccolto con metodo off-line in apposite sacche di mylar, impermeabili all aria ambiente, purché vengano rispettate le procedure codificate 4. La correlazione tra le concentrazioni di NO misurate con i due metodi, on-line e off-line, è ottima. I valori normali di NO nell aria espirata, a flusso espiratorio di 50 ml/s, sono compresi tra 10 e 20 ppb. NO e asma bronchiale L asma è una malattia infiammatoria cronica delle vie aeree, caratterizzata da una variabilità della pervietà delle vie aeree, evidenziabile o con test di provocazione bronchiale aspecifica o con test al broncodilatatore e da un complesso di sintomi (tosse, dispnea, sibilo toracico), a presentazione spesso accessionale ed evocabile da fattori scatenanti (freddo, emozione, infezione delle vie aeree, esercizio fisico etc.) 7. L infiammazione delle vie aeree è caratterizzata da un aumentato numero di eosinofili attivati, di mast cell e di linfociti, particolarmente del tipo Th2, presenti nella parete e nel lume delle vie aeree. Gli effetti di Pur essendo l asma una malattia infiammatoria, il clinico non dispone di un test ideale, semplice da eseguire, che rifletta il grado di infiammazione delle vie aeree e che possa essere pertanto di aiuto nel seguire il paziente asmatico e la risposta alla terapia anti-infiammatoria. La misura della concentrazione di NO nell aria espirata si sta rivelando un test con queste caratteristiche, tanto che la FDA americana, nel maggio 2004, ha approvato la misura dell NO nell espirato come test da impiegare nel monitoraggio clinico del paziente asmatico 8. È stato nel 1993 che per la prima volta un gruppo svedese di ricercatori dimostrò che i pazienti asmatici avevano livelli di NO nell aria espirata superiori a quelli riscontrati nei soggetti normali di controllo 2. L osservazione veniva presto confermata 9 anche in età pediatrica 10. La concentrazione di NO nell aria espirata dei pazienti asmatici, in diversi studi, risulta correlata con l iperreattività bronchiale, parametro funzionale anch esso correlato all infiammazione delle vie aeree, ma influenzato pure dal grado di ostruzione e di rimodellamento delle vie aeree. Questo può spiegare il diverso grado di correlazione trovato dai vari Autori. Una buona correlazione tra NO nell espirato e reattività bronchiale all istamina 11,12 e alla metacolina 13 è stata trovata in giovani adulti atopici con asma, ma non in bambini con asma lieve intermittente 14 e in asmatici con asma di lunga durata 15. È interessante che la concentrazione di NO nell espirato correli meglio con l iperreattività bronchiale all adenosina, test che meglio riflette l infiammazione eosinofila dell asma 16. La concentrazione di NO nell aria espirata correla infatti con l eosinofilia dell escreato indotto sia nell asma stabile in trattamento con soli β2-agonisti 17, sia durante l esacerbazione della malattia, indotta dalla riduzione della terapia corticosteroidea inalatoria 18 o dal test di provocazione con aspirina negli asmatici con ipersensibilità all aspirina 19. Uno degli aspetti clinici più interessanti della misura della concentrazione di NO nell aria espirata nell asma è la sua modificazione a seguito del trattamento anti-infiammatorio, offrendo così al clinico un parametro obiettivo per monitorare l effetto del trattamento. I corticosteroidi inibiscono l induzione della inos sia in vitro che in vivo, e questo sembra essere il motivo della riduzione di NO nell espirato, che avviene in genere già dopo 3 giorni di trattamento 20, secondo una modalità dose-dipendente, almeno nell intervallo di dosi tra 100 e 800 µg di beclometasone dipropionato 21,22.

G. Rolla et al.: Il ruolo della misura del monossido di azoto nell aria espirata in patologia 637 Anche il trattamento con montelukast, un inibitore recettoriale dei cisteinil-leucotrieni riduce i livelli di NO nell espirato dei pazienti asmatici 23, pure in quelli che siano già in terapia con steroidi inalatori 24, suggerendo una azione anti-infiammatoria che si aggiunge a quella esplicata dai corticosteroidi. La misurazione seriata dei livelli di NO nel follow-up del paziente asmatico si è rivelata molto utile nel predire le esacerbazioni dell asma. Le linee guida del trattamento dell asma suggeriscono che, una volta ottenuto il completo controllo dei sintomi e la normalizzazione della funzione respiratoria, la dose di corticosteroide per inalazione possa essere ridotta. Un aumento dei livelli di NO oltre 15 ppb, dopo riduzione dei corticosteroidi inalatori, predice la esacerbazione dell asma con un valore predittivo positivo di 88% 25. Molto recentemente, in bambini asmatici nei quali lo steroide inalatorio era stato sospeso perché, da 6 mesi, erano in completa remissione, è stato dimostrato che un valore cut-off di NO di 49 ppb, ottenuto 4 settimane dopo la sospensione dello steroide, aveva un valore predittivo negativo di 93% e predittivo positivo di 71 % nei confronti dell esacerbazione asmatica 26. In conclusione, i livelli di NO nell aria espirata sono elevati nei pazienti con asma e sono indicativi della flogosi delle vie aeree. Concentrazione di NO nell aria espirata e diagnosi di asma La possibilità di utilizzare il test della concentrazione di NO nell aria espirata per la diagnosi di asma è stata esplorata in diversi studi clinici. In 240 pazienti inviati per il sospetto di asma, Dupont e coll. 34 trovano che un cut-off di 16 ppb ha una specificità per la diagnosi di asma del 90%, con un valore predittivo positivo superiore al 90%. Smith e coll. 35 suggeriscono che nella valutazione di pazienti con sospetto di asma il valore di NO nell espirato e la conta degli eosinofili nell escreato indotto sono i due test con la maggiore accuratezza diagnostica, ben superiore ai test convenzionali come la spirometria, il monitoraggio del picco di flusso espiratorio e le loro modificazioni dopo ciclo di corticosteroidi. Nel valutare pazienti con tosse cronica, Chatkin e coll. 36 trovano che la misura di NO nell espirato, utilizzando un cut-off di 30 ppb, ha una sensibilità e una specificità per la diagnosi di asma rispettivamente del 75 e dell 87%, con valori predittivi positivo e negativo rispettivamente di 60 e 93%. Gli Autori concludono che un paziente con tosse cronica e valore basso di NO nell espirato difficilmente concluderà l iter diagnostico con una diagnosi di asma, definita sulla base di iperreatti- I livelli di monossido di azoto nell aria espirata rappresentano un sensibile marker di infiammazione, che, variando rapidamente per effetto della terapia anti-infiammatoria, si stanno dimostrando un utile test da impiegare nel monitoraggio della risposta alla terapia anti-asmatica e nel predire le recidive della malattia. vità alla metacolina (PC20FEV-1 < 8mg/ml) o di significativa variazione del FEV-1 dopo salbutamolo (+12 % del valore basale). NO nell aria espirata in altre malattie infiammatorie delle vie aeree L asma è, come detto sopra, la malattia infiammatoria delle vie aeree che si associa ai più elevati livelli di NO nell aria espirata. Nella BPCO i valori di NO nell aria espirata sono generalmente nella norma 27 o di poco superiori 28, oppure addirittura inferiori nel caso di cuore polmonare associato 29. È interessante che tra i pazienti con ostruzione fissa delle vie aeree, quelli con anamnesi di asma bronchiale e maggiore eosinofilia nell escreato, nel BAL e nei campioni bioptici di mucosa bronchiale abbiano valori di NO nell aria espirata significativamente maggiori 30. Valori di NO nell aria espirata più elevati della norma, ma inferiori rispetto a quelli osservabili negli asmatici, sono stati riportati nei pazienti con bronchiectasie 31 e con tubercolosi 32. Per contro, i pazienti con fibrosi cistica hanno valori di NO nell aria espirata ridotti rispetto ai valori normali, corrispondenti mediamente alla metà circa 33. La ragione della riduzione della concentrazione di NO nell espirato di questi pazienti sembra risiedere nello stress ossidativo, con trasformazione dell ossido nitrico in nitrocomposti. NO nell aria espirata nelle connettiviti e nelle interstiziopatie Il modello murino di LES è caratterizzato da aumentata escrezione urinaria di nitriti, da aumentata produzione di NO da parte dei macrofagi e da un aumentata attività NO-sintetasica nella milza e nel rene. Nello stesso modello, la somministrazione orale di un inibitore della NOS (L- NMMA) riduce la proteinuria e migliora lo score patologico della biopsia renale 37. Una correlazione tra escrezione urinaria di nitriti e attività di malattia è stata descritta anche nel LES umano 38. Concentrazioni di NO nell aria espirata più elevate nei pazienti rispetto ai controlli sono state descritte dal nostro gruppo 39. Benché nessuno dei nostri pazienti avesse manifestazioni clinicamente evidenti di malattia dell apparato respiratorio (pleurite, polmonite, interstiziopatia), ben 15 pazienti su 27 avevano una significativa riduzione della diffusione, e 17 una riduzione del

638 Recenti Progressi in Medicina, 96, 12, 2005 MEF 25, che presentava una correlazione inversa con la concentrazione di NO nell espirato, suggerendo un rapporto tra aumento della concentrazione di NO e flogosi bronchiolo-interstiziale. Anche nei pazienti affetti da sindrome di Sjögren è stata dimostrata un aumentata concentrazione di NO nell espirato, correlata all età e ai livelli sierici di lipocalina, una proteina contenuta nei granuli dei polimorfonucleati, mentre non lo era con l iperreattività bronchiale 40. Gli elevati livelli di NO potrebbero derivare dall infiltrazione linfocitaria della mucosa delle vie aeree. Nella sclerosi sistemica i livelli di NO nell espirato sono mediamente più elevati che nei controlli normali 41,42, con l eccezione dei pazienti con associata ipertensione polmonare, nei quali i valori di NO risultano normali o lievemente ridotti. Una correlazione inversa tra NO espirato e valori di pressione arteriosa polmonare stimata all ecocardiogramma è stata riportata in un gruppo di 47 pazienti affetti da sclerosi sistemica 42. Nei pazienti con fibrosi polmonare associata a sclerosi sistemica i valori di NO risultano correlati con il quadro di attività cellulare presente nel lavaggio broncoalveolare, definito in base alla presenza di linfociti >14%, di neutrofili > 4% e/o di eosinofili >3%. Anche nella fibrosi polmonare idiopatica i valori di NO nell espirato sarebbero più elevati che nei controlli 43 e correlati alla conta linfocitaria del lavaggio broncoalveolare. Nella sarcoidosi l infiammazione polmonare è sostenuta da citochine, quali il TNF-α e l IFN-γ, in grado di sovraregolare la inos. È pertanto ipotizzabile che la concentrazione di NO nell espirato possa essere aumentata in questa malattia. In accordo con tale ipotesi, Moodley e coll. 44 hanno trovato valori di NO più elevati rispetto ai controlli in 12 pazienti affetti da sarcoidosi di recente diagnosi, valori che si riducevano dopo trattamento steroideo. Dati discordanti sono stati riportati da altri autori 45. cirrosi, complicata da SEP, sono stati riportati da più Autori 51-53, che hanno potuto dimostrare anche come la sede dell aumentata produzione sia a livello alveolare 53,54. Il nostro gruppo ha descritto che nei pazienti affetti da SEP, dopo trapianto di fegato, la normalizzazione della ossigenazione è accompagnata dalla normalizzazione della concentrazione di NO nell aria espirata 55, a rinforzare il nesso causale tra aumentata produzione di NO e alterata ossigenazione esistente in questa sindrome. Figura 3. Aumento della produzione di NO a livello alveolare nella cirrosi epatica con sindrome epato-polmonare, per la sovra-regolazione combinata della inos macrofagica ad opera di prodotti batterici circolanti (LPS) e della enos, secondariamente alla aumentata espressione del recettore B dell endotelina 1 (ET-B). Modificata da ref. 56. NO nell aria espirata nella sindrome epato-polmonare La sindrome epato-polmonare (SEP) è definita dalla presenza di alterata ossigenazione (almeno un aumento di oltre 20 mmhg del gradiente alveolo-arterioso di O 2 ), dovuta ad abnorme vasodilatazione intrapolmonare, solitamente documentata dall ecocardiografia con contrasto, in un paziente affetto da epatopatia cronica, solitamente da cirrosi epatica 46. Modelli murini di SEP 47,48 e osservazioni cliniche 49,50 hanno dimostrato l importanza patogenetica dell aumentata produzione di NO nel determinare la sindrome. L aumentata produzione di NO deriverebbe dalla sovraregolazione della inos dei macrofagi alveolari ad opera di prodotti batterici (es. LPS), la concentrazione dei quali è aumentata nella cirrosi, e dalla sovraregolazione della enos endoteliale, dipendente, tra l altro, da una aumentata espressione del recettore B dell endotelina sui vasi polmonari (figura 3). Aumentati livelli di NO nell aria espirata dei pazienti affetti da Conclusioni 1. La misura del monossido di azoto nell aria espirata è un test semplice, del tutto non invasivo, che consente di avere informazioni sullo stato infiammatorio delle vie aeree e del compartimento alveolare. 2. Tale misura costituisce un importante mezzo di ricerca che ha contribuito, ad esempio, a chiarire il ruolo svolto dalla iper-produzione di NO a livello alveolare nel causare l ipossiemia nella cirrosi epatica complicata dalla sindrome epatopolmonare. 3. Sul piano clinico, infine, la misura del monossido di azoto nell aria espirata si sta dimostrando un utile test da impiegare nel monitoraggio della risposta alla terapia anti-asmatica e nel predire le recidive della malattia.

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