Trasduzione dei segnali del TCR
TCR: trasduzione del segnale I segnali trasdotti dal TCR inducono l espressione coordinata di numerosi geni (silenti nelle cellule naive) proliferazione differenziamento funzioni effettrici La trasduzione del segnale del TCR è indotta dalla stimolazione di più recettori per l antigene e corecettori Il risultato del riconoscimento dell antigene è determinato dalla durata e dalla affinità dell interazione TCR-complesso peptide MHC
Gli eventi precoci in risposta al riconoscimento dell antigene comportano il raggruppamento di diversi recettori di membrana, la fosforilazione in tirosina di numerose proteine e il reclutamento di molecole adattatrici
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2013/2014 I segnali indotti dal recettore per l antigene attivano diverse vie di trasduzione
Eventi di trasduzione del segnale attivazione tirosine chinasi/fosfatasi coinvolgimento di molecole adattatrici generazione di secondi messaggeri DAG, IP 3, Ca 2+, camp, cgmp amplificazione attraverso cascate di enzimi attivazione di serina/treonina chinasi/fosfatasi attivazione di fattori di trascrizione attivazione trascrizione di geni
TCR: trasduzione del segnale TCR ha una bassa affinità per complessi MHC-peptide K d 10-5 -10-7 M Off rate veloce Singoli TCR inducono un segnale debole Poche delle molecole MHC espresse da APC presentano peptide riconoscibile da un determinato TCR Solo 10-100 complessi MHC-peptide (in un totale di 10 4-10 5 ) necessitano di essere riconosciuti da TCR per indurre attivazione Lo stesso TCR può essere attivato più volte L intero processo può durare ore
Sinapsi Immunologica Questa prolungata interazione è permessa dalla costituzione della SINAPSI IMMUNOLOGICA nell area di contatto tra cellula T e APC Il raggruppamento di raft è un evento necessario per la formazione della IS A seguito di stimolazione TCR monomerici vengono reclutati in raft e formano dei cluster Anche molecole adattatrici e di trasduzione del segnale sono reclutate nei raft (ZAP70, Vav, Grb2)
I raft I raft sono strutture lipidiche organizzate, ricche in lipidi saturi, colesterolo e GM1 Compartimentalizzano molecole importanti per la trasduzione del segnale che sono reclutate nei raft attraverso modifiche posttraduzionali aggiunta di acido miristico: p56 lck e p59 fyn aggiunta di acido palmitico: p56 lck, LAT e PLCg 1, H-Ras L integrità dei raft è richiesta per trasdurre segnali indotti da TCR In risposta a TCR/CD28 i raft muovono all IS
La stimolazione di TCR e CD28 polarizza i raft verso il sito di contatto Linfocita T non stimolato Stimolazione TCR Stimolazione TCR e CD28
Sinapsi Immunologica (3) Inizialmente cellula T e APC interagiscono attraverso molecole di adesione LFA-1 ICAM In questa fase TCR controlla complessi MHC-peptide se non riconosce complessi, l interazione cellula T-APC cessa Se TCR riconosce complessi MHC-peptide invia segnale: aumento affinità LFA-1 stabilizzazione interazione arresto migrazione (segnale di stop), ritiro uropode meccanismo che ritiene cellule T in organi linfatici secondari
Ruolo di integrine e TCR in interazione cellule T - APC TCR non riconosce complesso Ag-MHC Dissociazione APC cellula T Adesione debole Indipendente da Ag TCR riconosce Complesso Ag-MHC Forte adesione APC cellula T Risposta funzionale
Sinapsi Immunologica (4) Stimolazione di TCR e LFA-1 induce polarizzazione cellula T in direzione della APC Riorganizzazione citoscheletro filamenti di actina e talina sono reclutati nei pressi della IS MTOC (MicroTubule Organising Center) si sposta dall uropode a IS questi eventi favoriscono il reclutamento di recettori e molecole di trasduzione alla IS LFA-1 migra verso la porzione esterna dello SMAC mentre i TCR muovono al centro il blocco nella formazione di questo cluster centrale blocca l attivazione dei linfociti T La riorganizzazione è in parte condizionata dalle dimensioni dei complessi recettori-ligandi
LFA-1 Linfocita T CD2 TCR CD28 LFA-1 15 nm ICAM CD58 MHC B7 ICAM APC
Supra-Molecular Activation Cluster LFA-1 TCR CD28 Overlay csmac psmac
A seguito di attivazione PKCq è reclutata nella IS A seguito di attivazione CD45 non è reclutata nella IS
CD3 catene g, d, e Complesso del TCR omologhe l una con l altra singolo dominio Ig 1 eterodimero e/d 1 eterodimero g/e catena z omodimero z/z in 90% CD3 eterodimero z/h in 10% CD3 h splicing alternativo z le catene z sono associate anche ad altri recettori durante la maturazione dei timociti le proteine del CD3 e z sono espresse prima del TCR ma saranno presenti sulla membrana cellulare solo dopo il corretto assemblaggio con le catene a/b del TCR
Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif ITAM ITAM: Tyr-x-x-Leuxxxxxx(xx)Tyr-x-x-Leu 1 ITAM in catene g, d, e 3 ITAM in catene z ITAM in altre molecole Le sequenze ITAM del CD3/catene z collegano funzionalmente il riconoscimento dell antigene avvenuto con il TCR alla trasduzione del segnale
ITAM La fosforilazione delle ITAM del CD3 e delle catene z avviene pochi secondi dopo la stimolazione del TCR Due famiglie di PTK fosforilano e interagiscono con le ITAM Src e Syk Inibitori delle PTK inibiscono gli effetti della stimolazione del TCR
Il corecettore CD4 Membrana cellulare APC TCR MHC II Membrana cellulare linfocita T CD4 Composto da 1 catena 4 domini Ig extracellulari riconosce dominio b2 di MHC II CD4 lega p56lck in porzione intracitoplasmatica Topi KO per CD4 non hanno linfociti T ristretti da MHC II se transfettati con CD4 normale sviluppano linfociti T ristretti da MHC II se transfettati con CD4 privo del sito di legame per p56lck mancano di linfociti T ristretti da MHC II Espresso da timociti, linfociti Tab periferici (ca. 65%), alcune cellule dendritiche
Il corecettore CD8 Composto da 2 catene legate da ponte disolfuro eterodimero CD8a/CD8b omodimero CD8a/CD8a 1 dominio Ig extracellulare/catena riconosce dominio a3 di MHC I CD8 lega p56lck in porzione intracitoplasmatica Topi KO per CD8 non hanno linfociti T ristretti da MHC I
La Src chinasi p56 lck N-terminale C-terminale Unique, sequenza caratteristica della famiglia, lega CD4 e CD8 SH3, lega sequenze specifiche ricche in prolina SH2, lega P-Tyr all interno di specifiche sequenze Kinase, dominio catalitico R, dominio regolatorio Unique SH3 SH2 Kinase R Y Y
Dominio SH2 SH2, Src Homology 2 Dominio proteico strutturalmente conservato contenuto in Src ed altre proteine che trasducono segnali SH2 lega residui di Tyr fosforilati nel contesto di specifcihe sequenze peptidiche Dominio SH2 di p56 Lck NH2 COOH
L attività catalitica di Lck è regolata da cambiamenti conformazionali SH3 SH2 PTPase Stimolazione TCR Y Y Csk CD45 P Y P Y Y Dominio catalitico Dominio regolatorio Fosforilazione di Y in dominio catalitico induce cambiamento conformazionale che permette accesso del substrato La fosforilazione della Tyr nel dominio regolatorio induce una conformazione chiusa SH2 interagisce con il C-terminale
N-terminale La Syk chinasi ZAP-70 C-terminale SH2 SH2 Y Kinase Y z chain-associated protein 70 292 493 Espressa esclusivamente in linfociti T e NK 2 domini SH2 legano ITAM fosforilate con affinità elevata La fosforilazione di Y292 ad opera della stessa ZAP-70 inibisce l attività catalitica autoregolazione negativa La fosforilazione di Y493 nel dominio catalitico attiva l enzima Y493 fosforilata da p56lck
MHCII-Ag TCR TCR CD4 CD4 CD3 CD3 zz MHCII-Ag, TCR e CD4 interagiscono ZAP CD4 avvicina Lck a TCR-CD3 p56 lck fosforila le ITAM di CD3 e z ZAP-70 si lega alle ITAM fosforilate attraverso 2 domini SH2 p56 lck fosforila Y493 di ZAP-70
LAT, Linker for Activation of T cells (1) Molecola adattatrice che permette di reclutare enzimi e altri adattatori Permette l attivazione di almeno3 vie di trasduzione Ras Raf Mek Erk Elk Fos SLP76 Vav Rac Mekk JNK Jun PLCg1 IP3 Ca 2+ DAG PKC Localizzato nei raft attraverso modifica post-traduzionale (palmitoilazione) Viene fosforilato da ZAP70
LAT, Linker for Activation of T cells (2) In assenza di LAT molti degli eventi indotti dalla trasduzione del segnale del TCR sono compromessi: flusso di calcio attivazione ERK e altre MAP chinasi attivazione NF-AT attivazione AP-1 produzione IL-2 LAT è richiesto anche per lo sviluppo dei linfociti T nel timo Topi LAT KO non producono cellule T mature
LAT PLC LAT PLCg 1 abtcr CD4 CD3 lck ZAP PIP 2 DG PKC q IP 3
LAT PLC CD3 abtcr CD4 LAT PLCg 1 Ca 2+ CRAC lck ZAP PIP 2 DG IP 3 Ras PKC q Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Attivazione fattori trascrizione
L aumento di Ca 2+ libero intracitoplasmatico è transiente
LAT LAT SOS Ras MAP chinasi abtcr CD4 CD3 lck ZAP Grb 2 Sos Shc Raf MEK ERK Attivazione fattori trascrizione
LAT PLC LAT SLP76 VAV CD3 abtcr CD4 CD28 lck ZAP vav Attivazione fattori trascrizione
Attivazione fattori di trascrizione De novo sintesi c-fos componente di AP-1 trascrizione indotta da stimolazione TCR Assemblaggio dimerizzazione STAT fosforilazione da parte di Jak Modificazioni covalenti Localizzazione
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2013/2014 Attivazione di fattori trascrizione
Famiglia NFkB Primo sito di legame individuato in gene catena leggera k Presente come dimero omodimero eterodimero rel homology domain (RHD) Membri di NFkB espressi in tutte le cellule RelB espresso in linfociti e poche altre cellule In cellule quiescenti dimeri NFkB sono legati a inibitori di kb (IkB)
Famiglia c-rel/nf-kb p65 RelA c-rel RelB NFkB1 P105/p50 NFkB2 P100/p52
Famiglia I-kB IkBa IkBb IkBe BCL3
NF-kB Induttori dell attivazione di NF-kB TCR/CD28 TNFa, IL-1 LPS Mitogeni dsrna H 2 O 2 Nitric Oxide Geni inducibili da NF-kB (coinvolti in risposte immunitarie) p50 TNFa, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-8, IL-12 IL2Ra ICAM-1, VCAM-1, E-selectin MHC classe I e II p50 RelA IKK P P IkBa IkBa p50 RelA RelA p50 fosforilazione Ub Ub Ub Ub P P Ub Ub Ub Ub IkBa poliubiquitinazione NLS RelA trascrizione p50 RelA degradazione (proteasoma) Ub P P IkBa Ub
IKK, IkB Kinase IKKa, IKKb attività chinasica IKKg attività regolatoria NEMO NFkB essential modulator
Cinetica di espressione in linfociti stimolati da antigene
Geni espressi dopo attivazione Geni immediati c-fos, c-jun, nf-at, c-myc, nf-kb < 30 Geni precoci IFNg IL-3, IL-2Ra IL-6 GM-CSF < 1h 1-2 h 4-6 h 20 h Geni tardivi VLA-4 VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-5 4 g 7-14 g