Corso di Laurea Magistrale in BIOLOGIA CELLULARE e MOLECOLARE E SCIENZE BIOMEDICHE A.A. 2016 2017 BIOCHIMICA MOLECOLARE CLINICA Principi e tecniche molecolari per la diagnosi di patologie umane Prof. Patrizia Malaspina Dipartimento di Biologia Università di Roma Tor Vergata patrizia.malaspina@uniroma2.it
Individuazione di alterazioni patologiche nel DNA RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) PCR (Reazione a catena della polimerasi) RealTime PCR (PCR in tempo reale) Sequenziamento
Enzimi di restrizione 1) Sequenza di riconoscimento (da 4 a 8 basi) detta palindrome: rispetto ad un asse di simmetria esiste la stessa sequenza di basi su entrambi i filamenti quando questi vengono letti in direzione 5-3 ; 2) Sporgenze al 5 o al 3 ; 3) Estremità coesive o non coesive; 4) Isoschizomeri (enzimi diversi che riconoscono la stessa sequenza); 5) Enzimi con sequenze di riconoscimento diverse ma che creano estremità compatibili (isoschizomeri) (es: BamHI e MboI).
Enzimi di restrizione
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Polimorfismo per lunghezza di frammenti di restrizione
Identificazione di RFLP attraverso Southern blot 1. Digestione del DNA genomico con enzimi di restrizione 2. Separazione dei frammenti per elettroforesi su agarosio 3. Immobilizzazione DNA con trasferimento su membrana 4. Ibridazione con sonda marcata 5. Identificazione dell RLFP
Identificazione di RFLP attraverso Southern blot
Ibridazione con una sonda molecolare
Identificazione del peso molecolare delle bande dopo corsa elettroforetica DNA I: 19 mm = ~ 6,5 Kb 37 mm = ~ 1,2 kb DNA II: 20 mm = ~ 5 Kb 35 mm = ~ 1,6 kb 37 mm = ~ 1,2 kb
Identificazione di RFLP dopo corsa elettroforetica Dimensioni bande Non digerito: 15 kb EcoRI: 4, 5, 6 kb BamHI: 3, 5, 7 kb EcoRI + BamHI: 1, 3, 5 kb 3B 4E 5E 7B 6E 5B 3 B E E B 1 5 1 5
Southern blot, Northern, Western
Anemia falciforme
L anemia falciforme: 2 tipi di globuli rossi (a) Eritrociti contenenti emoglobina normale (A): Hb A Hb A (b) Eritrociti contenenti solo emoglobina mutate (S): Hb S Hb S Portatori Hb A Hb S :g. rossi a falce solo in condizioni di bassa concentrazione ossigeno
Gli alleli A e S sono codominanti Corsa elettroforetica
Identificazione dell allele S per la falcemia attraverso un RFLP nel gene beta della globina: quando la mutazione altera il sito di restrizione
Identificazione della segregazione di un allele patologico attraverso un RFLP quando la mutazione altera il sito di restrizione
APPLICAZIONI DELLA PCR Amplificazione a partire da 1 cellula umana = 6 pg DNA - Identificazione cellule tumorali, infezioni batteriche e virali; - diagnosi prenatale; - analisi del DNA antico; - analisi popolazionistiche (radice capello, cartellino con sangue, cellule mucosa buccale); - analisi medico-legali da tracce Amplificazione prima del clonaggio Studio di RFLP successivo all amplificazione del tratto genomico da analizzare; Individuazione delle mutazioni geniche con PCR allele specifica; Studio di loci di tipo VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) (microsatelliti)
PCR allele specifica Diagnosi patologie con alterazione di Singolo Nucleotide (SNP)
VNTR: MICROSATELLITI o STR (SHORT TANDEM REPEATS) Simple tandem repeats (1-5 bp) disperse nel genoma (blocchi inferiori a 100 bp) Variabilità inter individuale per numero di ripetizioni in tandem
Microsatelliti analizzati con PCR e gel di acrilammide
ESEMPIO DI ALLELI DI UN LOCUS MICROSATELLITE NEL GENOMA Nel genoma umano ci sono circa: 130.000 STR dinucleotidici 8.700 STR trinucleotidici 23.700 STR tetranucleotidici 4.300 STR pentanlucleotidici 230 STR esanucleotidici
Microsatelliti analizzati con PCR e gel di acrilammide
Tre loci microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati con sequenziatore Marcatura di un primer di ogni PCR con diverso fluoroforo
Microsatelliti amplificati con PCR multiplex e analizzati con sequenziatore Prodotti di ogni singola PCR marcati con coloranti fluorescenti
Microsatelliti analizzati con sequenziatore Tutti gli alleli noti per ogni locus microsatellite marcati con fluorofori
Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Esempio: un soggetto eterozigote C/T Coppia di cromosomi omologhi In quella particolare posizione del genoma (locus) gli individui possono essere classificati con 3 possibili genotipi: omozigoti C/C, omozigoti T/T, o eterozigoti C/T