Trasporto e metabolismo dei lipidi in ambito extracellulare. Le lipoproteine plasmatiche

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1 Trasporto e metabolismo dei lipidi in ambito extracellulare. Le lipoproteine plasmatiche

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23 VLDL LDL CETP P col LCAT HDL

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29 sintesi colesterolo colesterolo intracellulare densità recettori per LDL

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33 TRASPORTO RETROGRADO DEL COLESTEROLO membrana cellulare ricca di colesterolo FEGATO

34 IPERTRIGLCERIDEMIA E IPERCOLESTEROLEMIA membrana cellulare ricca di colesterolo FEGATO In presenza di elevate concentrazioni di trigliceridi si ottiene dunque una più veloce scomparsa delle HDL. Si riduce parimenti la possibilità di riportare il colesterolo al fegato, che è l unico organo che può eliminarne l eccesso attraverso la formazione di acidi biliari (mentre i TG riportati al fegato tornano in circolo sotto forma di VLDL)

35 sintesi colesterolo colesterolo intracellulare Questa omeostasi perfetta non è osservabile nei macrofagi per la presenza di un diverso densità recettore per le LDL (recettore scavenger). recettori per LDL

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46 Apolipoproteina(a) L apo(a) è una glicoproteina ad alto peso molecolare altamente polimorfa prodotta principalmente dal fegato. La struttura è omologa a quella del plasminogeno, sia per la presenza del dominio proteasico (che tuttavia non può essere convertito nella forma attiva) che per la presenza di un dominio costituito da sequenze kringle. Questo ultimo dominio comprende un kringle omologo al kringle 5 del plasminogeno e diversi altri kringle simili tra loro e al kringle 4. Il numero di kringle 4 nella sequenza primaria è alla base del polimorfismo dell apo(a), nonché della variabilità del suo peso molecolare. La rilevanza dell apo(a) nel sistema lipoproteico deriva dal fatto che essa si associa, mediante la formazione di un ponte disolfuro, all apo B-100 a formare una lipoproteina denominata Lp(a). I livelli plasmatici della Lp(a) sono correlati al peso molecolare delle isoforme dell apo(a) e al rapporto tra kringle 4 e kringle 5.

47 La Lp(a) è considerata una lipoproteina aterogena e un fattore di rischio indipendente per l insorgenza di malattie coronariche. Essa si lega infatti ai glicosaminoglicani con una affinità molto superiore a quella delle LDL. Gran parte dell aterogenicità sembra dipendere da processi che hanno luogo nell intima dei vasi arteriosi. L omologia tra plasminogeno ed apo(a) suggerisce che la Lp(a) possa inibire il legame del plasminogeno alla fibrina e favorire così la trombosi. La mancata attivazione del plasminogeno impedisce, a sua volta, l attivazione della forma latente del TFG-beta (transforming growth factor-beta) con conseguente stimolazione della proliferazione delle fibre muscolari lisce.

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50 I fibrati sono farmaci ipolipidemizzanti. La la loro efficacia è rivolta principalmente sui trigliceridi e, in misura minore, sulle LDL e sulle HDL. L'azione dei fibrati è anche rivolta, almeno in parte, alla modulazione dei geni che codificano le lipoproteine. Infatti, i fibrati attivano fattori di trascrizione (fattori che controllano l'attività dei geni) appartenenti alla superfamiglia dei recettori nucleari degli ormoni, chiamati PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors). I fibrati inibiscono la sintesi e stimolano il catabolismo delle VLDL, con il risultato di una notevole riduzione della trigliceridemia e di una minore diminuizione della colesterolemia. In particolare, attraverso PPAR viene inibita la sintesi dei trigliceridi endogeni, mentre viene stimolata la sintesi della lipoproteinlipasi (l'enzima che catabolizza le VLDL, trasformandole in IDL). L'attivazione di PPAR-alfa media l'azione dei fibrati sulle HDL, in quanto induce la sintesi delle principali apolipoproteine delle HDL (APOA-I e APOA-II). Per la loro azione prevalente sui trigliceridi, i fibrati sono indicati soprattutto per il trattamento delle ipertrigliceridemie isolate e per le forme combinate di ipertrigliceridemia e ipercolesterolemia. La riduzione dei trigliceridi è di circa 20-50%, mentre la riduzione delle LDL di solito non va oltre il 25% e l'aumento delle HDL del 10-25%. In studi di prevenzione primaria e secondaria il gemfibrozil ha ridotto gli eventi coronarici.

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56 IPERLIPEMIE Circa l 80% delle iperlipemie sono classificabili secondo quanto proposto da Fredrickson in modo accurato e con poca spesa, interpretando correttamente il livello di colesterolo e di trigliceridi ematici o esaminando semplicemente l aspetto del campione di siero o di plasma dopo averlo lasciato una notte in frigorifero. Se il campione appare chiarificato con uno strato cremoso in superficie, è indice che sono presenti dei chilomicroni e la dislipidemia è probabilmente di tipo I o V o, più raramente, di tipo III. Se il campione si mantiene opalescente, è indice che sono presenti delle VLDL e la dislipidemia è probabilmente di tipo IIb, IV o V. Se si verificano entrambe le condizioni (presenza di uno strato cremoso in superficie ed opalescenza del campione), siamo verosimilmente in presenza di una dislipidemia tipo V.

57 DOSAGGIO DEL COLESTEROLO I numerosi metodi proposti per la determinazione della colesterolemia, molti dei quali tuttora in uso, rappresentano ancora oggi dei tentativi non del tutto soddisfacenti per venire incontro all esigenza di economicità, semplicità e rapidità nell esecuzione e di maggiore accuratezza e precisione nei risultati. Essi si basano su reazioni colorimetriche non enzimatiche (reazione di Liebermann-Burchard, reazione al FeCl3-H2SO4, reazione all acido p- toluensulfonico) o sull uso della reazione enzimatica catalizzata dalla colesterolo ossidasi.

58 Reazione di Liebermann-Burchard Avviene in un mezzo reso fortemente acido in presenza di acido solforico, acido acetico e anidride acetica e consiste nella graduale ossidazione del colesterolo fino a formare un cromoforo dell acido colesta-esaene-sulfonico. Malgrado sia la metodica non enzimatica più frequentemente usata, la reazione di Liebermann-Burchard risente di numerose variabili quali la concentrazione dei reagenti, la quantità d acqua presente nella miscela finale, la temperatura e il tempo di reazione e la lunghezza d onda della luce utilizzata per la misura del prodotto finale. Il colore che si sviluppa nella reazione è instabile nel tempo ed è più intenso quando il colesterolo è esterificato rispetto a quando è libero. Infine alcune sostanze presenti nel campione biologico (bilirubina, retinolo) o aggiunte nella miscela di reazione (digitonina - utilizzata per precipitare il colesterolo non esterificato) possono interferire nel dosaggio dando luogo ad una sovrastima dell analita.

59 Reazione al FeCl3-H2SO4 Dà luogo ad un colore più intenso e costante nel tempo rispetto a quanto osservato con la reazione di Liebermann-Burchard per l effetto stabilizzante del metallo sulla formazione del catione enilico ad alte concentrazioni di acido solforico, cosa che rende questa procedura particolarmente adatta per lo sviluppo di micrometodi. Inoltre, quando l acido solforico è aggiunto nella miscela di reazione separatamente dagli altri reagenti (ma non quando viene premescolato a questi), il colesterolo libero e quello esterificato sviluppano un colore di medesima intensità, rendendo superflua una preventiva saponificazione dell analita. L azide sodica (a volte usata per inibire la crescita batterica), gli alogeni, i perossidi e certi farmaci e vitamine possono interferire con la reazione al FeCl3-H2SO4. E inoltre preferibile deproteinizzare il campione prima di far sviluppare il colore. Ciò può essere fatto indifferentemente per aggiunta di un solvente organico o per precipitazione in acido. Questo secondo metodo è apparentemente più semplice, ma può determinare una rimozione del ferro con le proteine, causando così un insufficiente sviluppo del colore, o rendere più difficoltosa una eventuale, successiva rimozione della bilirubina dall estratto.

60 Reazione all acido p-toluensulfonico Ha i seguenti vantaggi rispetto alla reazione di Liebermann-Burchard: i reagenti sono più stabili, il colore del prodotto di reazione non si modifica nel tempo, il colore sviluppato dal colesterolo libero e quello sviluppato dal colesterolo esterificato hanno la medesima intensità. Tuttavia in questo caso la bilirubina interferisce notevolmente nella determinazione del colesterolo dando luogo spesso ad una sovrastima dell analita.

61 METODO ENZIMATICO La determinazione enzimatica del colesterolo prevede 1) l idrolisi del colesterolo esterificato, 2) l ossidazione del colesterolo libero a colest-4-en-3-one a spese dell ossigeno atmosferico con produzione di perossido di idrogeno 3) e il dosaggio di quest ultimo composto mediante reazioni enzimatiche e/o colorimetriche. Questo metodo presenta il vantaggio di un elevata specificità per cui la reazione può essere seguita direttamente nel siero. Il principale problema risiede nel fatto che l idrolisi degli esteri del colesterolo è spesso solo parziale e che quindi la concentrazione del colesterolo totale può essere sottostimata. Si è visto inoltre che il grado di idrolisi raggiungibile nel corso della reazione enzimatica dipende sia dalla natura dell acido organico esterificante (gli esteri dell acido arachidonico e dell acido acetico sono particolarmente resistenti all azione delle esterasi) sia dal tipo di enzima usato (le esterasi di origine microbica hanno maggiore difficoltà, rispetto alle esterasi di origine animale, ad idrolizzare gli esteri del colesterolo con acidi grassi polinsaturi a catena lunga). Ciò pone seri problemi all affidabilità del metodo.

62 Reazione tra H 2 O 2 e metanolo in presenza di perossidasi, si formano acqua e formaldeide, la quale reagisce con il reattivo acetilacetoneammoniaca a formare la 3,5-diacetil-1,4-diidrolutidina che è rilevabile allo spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 415 nm. La sua concentrazione è direttamente proporzionale a quella iniziale di colesterolo.

63 HDL-COLESTEROLO E LDL-COLESTEROLO Una volta identificata in un soggetto la necessità di eseguire l analisi delle lipoproteine, l interesse si sposta dal colesterolo totale all LDL-colesterolo. Il fine ultimo della identificazione occasionale e dello screening è quello di individuare i soggetti con elevati livelli di LDL-colesterolo e l obiettivo specifico del trattamento è la riduzione di tale livello. Ne consegue che l LDL-colesterolo servirà come indice-chiave per le decisioni cliniche da prendere in merito al trattamento ipocolesterolemizzante. Il dato riguardante l HDL-colesterolo è utile soprattutto nei soggetti che presentano una trigliceridemia normale e una colesterolemia al limite dei valori di riferimento, dove il riscontro di un HDL-colesterolo anormalmente elevato o basso può costituire un criterio importante per decidere il trattamento più appropriato da intraprendere.

64 Anche il metodo utilizzante il fosfotungstato di sodio sottostima l HDL-colesterolo, ma in misura minore rispetto al metodo utilizzante il destrano. Esso è particolarmente utile per precipitare le VLDL e le LDL in sieri ipertrigliceridemici. Il suo principale svantaggio è di essere molto sensibile a variazioni di temperatura o di concentrazione dei reagenti. Metodi di determinazione I metodi più frequentemente usati nella determinazione del HDL-colesterolo si basano sulla precipitazione selettiva delle VLDL e delle LDL e sul dosaggio del colesterolo sul supernatante così ottenuto. Gli agenti precipitanti maggiormente usati sono l eparina-cloruro di manganese, il destrano solfato-cloruro di calcio o magnesio e il fosfotungstato di sodio. Il metodo basato sull uso dell eparina-cloruro di manganese non è con gran parte dei metodi enzimatici utilizzati per la determinazione del colesterolo mentre può essere accoppiato alla reazione di Liebermann-Buchard. Le VLDL e le LDL precipitano solo parzialmente in campioni con un contenuto di trigliceridi superiore a 4 g/l. La precipitazione delle lipoproteine con destrano solfato e sali di calcio o magnesio permette un successivo dosaggio del colesterolo mediante il metodo enzimatico. Tuttavia molte delle procedure utilizzanti il destrano tendono a sottostimare l HDLcolesterolo.

65 L LDL-colesterolo è ricavato indirettamente utilizzando i dati (espressi in mg/l) del colesterolo totale, dell HDL-colesterolo e dei trigliceridi mediante la formula: [LDL-colesterolo] = [colesterolo totale] [HDL-colesterlo] [trigliceridi] x 0,2 La formula presuppone che la maggior parte dei trigliceridi si trovi nelle VLDL e che vi sia un rapporto di 5:1 tra trigliceridi e colesterolo nella frazione VLDL. Per questa ragione la formula non è valida nei soggetti con dislipidemia tipo III o con trigliceridemia superiore a 4 g/l. In alternativa, l LDL-colesterolo può essere determinato direttamente utilizzando in sequenza due detergenti, in modo da dissolvere, in un primo momento, tutte le lipoproteine diverse dalle LDL (chilomicroni, VLDL, IDL, HDL) e, in un secondo momento, le sole LDL. Il colesterolo, che si libera per aggiunta dei detergenti, viene cimentato in presenza di una esterasi e una ossidasi specifica in modo da produrre perossido di idrogeno. Il perossido di idrogeno, prodotto dal colesterolo liberato per aggiunta del primo detergente, è decomposto mediante una catalasi o fatto reagire con 4- aminoantipirina in presenza di una perossidasi in modo da formare un prodotto di reazione incolore. Il perossido di idrogeno, prodotto dal colesterolo liberatosi dalle LDL dopo l aggiunta del secondo detergente, è fatto invece reagire con un cromogeno in presenza di perossidasi e il prodotto di reazione è dosato spettrofotometricamente

66 La determinazione dei trigliceridi ematici può essere utile nelle seguenti circostanze: 1) per valutare il metabolismo lipidico nel suo insieme nell analisi dei fattori di rischio per la malattia coronarica; 2) per stimare la concentrazione del colesterolo contenuto nelle VLDL, per una misura indiretta dell LDL-colesterolo; 3) per determinare se un basso livello di HDL-colesterolo sia correlabile ad una ipertrigliceridemia; 4) per evidenziare una ipertrigliceridemia secondaria all uso di antiipertensivi, di farmaci che diminuiscono la colesterolemia o hanno altre funzioni (ad esempio, estrogeni); 5) per seguire l efficacia della dieta, dell esercizio fisico o di farmaci che diminuiscono la trigliceridemia. 6) per valutare il rischio di insorgenza di una pancreatite acuta attribuibile all ipertrigliceridemia; 7) per vedere se i xantomi eruttivi, i xantomi palmari e la lipemia retinalis del paziente sono da attribuirsi effettivamente ad un aumento delle lipoproteine ricche in trigliceridi.

67 Metodi di determinazione Il livello dei trigliceridi può essere misurato mediante la determinazione quantitativa del glicerolo in essi contenuto mediante reazioni colorimetriche o metodi enzimatici. In tutti i casi la misura deve essere corretta per il glicerolo contenuto inizialmente nel campione. Un aumento del glicerolo può essere osservato nelle condizioni di stress, dopo infusione di mannitolo o trattamento di pazienti coronaropatici con nitroglicerina, nel diabete mellito, in alcune epatopatie, nel corso di emodialisi o a seguito dell uso di siringhe o provette lubrificate con glicerolo.

68 Reazioni colorimetriche La procedura prevede quattro tappe successive: (1) estrazione dei trigliceridi, (2) loro saponificazione, (3) ossidazione del glicerolo a formaldeide, (4) determinazione quantitativa della formaldeide. L estrazione viene comunemente fatta in metanolo, etanolo, isopropanolo o cloroformio e serve per denaturare le lipoproteine e liberare così il trigliceride che può essere purificato per partizione in solventi organici (esano, nonano) o con l uso di adsorbenti (zeolite, silicato di magnesio attivato). La saponificazione del trigliceride avviene generalmente a caldo in presenza di potassa alcolica

69 Il glicerolo viene quindi ossidato a formaldeide in presenza di periodato. La formaldeide viene infine misurata per mezzo di una reazione colorimetrica (reazione di Eegriwe, di Schryver o di Pay) o al fluorimetro dopo condensazione con acetilacetone eammoniaca (reazione di Hantzsch). Reazione di Hantzsch

70 Metodi enzimatici I metodi enzimatici richiedono l iniziale idrolisi del trigliceride ad opera di una lipasi. Generalmente, alla miscela di reazione viene aggiunto un enzima proteolitico (achimotripsina) per disgregare le lipoproteine. Sono stati descritti diversi metodi per il dosaggio del glicerolo che prevedono l utilizzo di uno, due o tre reazioni enzimatiche. Infatti il glicerolo può essere ossidato direttamente a diidrossiacetone in presenza di NAD+.

71 In alternativa il glicerolo può essere fosforilato a glicerolo-3-fosfato e quest ultimo composto può essere a sua volta ossidato a diidrossiacetonefosfato a spese dell NAD + o a spese dell ossigeno atmosferico.

72 Un ulteriore metodo, infine, prevede di determinare enzimaticamente non il glicerolo-3-fosfato (come nei due casi precedenti), ma l ADP che si è formato nella reazione catalizzata dalla glicerolo chinasi.

73 Preparazione del campione ed intervalli di riferimento Il paziente deve essere a digiuno. Infatti, se il paziente ha mangiato, non solo non è più possibile interpretare il significato dell ipertrigliceridemia, ma la presenza di chilomicroni nel campione può interferire sia con il saggio colorimetrico sia nella determinazione dei volume del campione. Il paziente deve inoltre astenersi dal bere alcool per almeno 36 ore prima dell analisi in quanto questo composto determina una brusca e transiente elevazione della trigliceridemia. La determinazione può essere fatta sia sul plasma (reso incoagulabile per aggiunta di EDTA) che sul siero. I valori nel plasma sono inferiori del 2-4% rispetto ai valori del siero in quanto gli anticoagulanti (in particolare il fluoruro, il citrato e l ossalato) determinano una fuoriuscita di acqua dai globuli rossi. Valori di trigliceridi inferiori a 2,5 g/l sono da considerarsi normali, anche se soggetti con questi valori possono presentare ugualmente altre importanti alterazioni delle lipoproteine e delle apolipoproteine. Livelli di trigliceridi a digiuno compresi fra 2,5 g/l e 5 g/l si associano ad un aumento del rischio di malattia cardiovascolare (il doppio rispetto la norma) e richiedono ulteriori indagini cliniche sul paziente. Valori superiori a 5 g/l portano invece ad un aumento del rischio per la pancreatite acuta.