ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti Estradiolo
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- Rosangela Santini
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1 ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti Estradiolo E Impiego Per la determinazione quantitativa in vitro dell estradiolo in siero o plasma umani (eparina o EDTA). Compendio e spiegazione del dosaggio L estradiolo viene prodotto dalle ghiandole surrenali, dalla placenta e dai testicoli ed è il principale estrogeno secreto dalle ovaie. Oltre il 98% dell estradiolo in circolazione è legato a proteine sieriche, essenzialmente alla globulina legante gli ormoni sessuali (SHBG). La clearance metabolica dell estradiolo avviene per trasformazione in estrone e per idrossilazione e coniugazione con solfato o glucuronide 1-3. In genere, l estradiolo esercita un controllo a feedback negativo sul rilascio di gonadotropina, però, dal momento che la produzione di estradiolo accelera con la rapida crescita del follicolo dominante, il feedback diventa positivo provocando un innalzamento della secrezione di LH, e ha luogo l ovulazione 4. La misura dell estradiolo è di utilità nella valutazione di numerose disfunzioni mestruali, comprese pubertà ritardata, amenorrea e menopausa. Principi della procedura Il dosaggio Estradiolo VITROS viene effettuato usando la confezione di reattivi per estradiolo VITROS e calibratori estradiolo per prodotti immunodiagnostici VITROS sul sistema VITROS per immunodiagnostica. Viene utilizzata una metodica d immunodosaggio che si basa sulla competizione tra l estradiolo presente nel campione e un coniugato estradiolo marcato con perossidasi da rafano (HRP) per un numero limitato di siti di legame di una miscela di anticorpi biotinilati (anti-estradiolo da pecora e da coniglio). Il complesso antigene-anticorpo viene catturato sui pozzetti ad opera della streptavidina, mentre il materiale non legato viene rimosso mediante lavaggio. Il coniugato con perossidasi da rafano legato viene misurato mediante reazione luminescente 5. Un reagente contenente substrati luminogenici (derivato del luminolo e sale peracido) ed un agente di trasferimento di elettroni, viene aggiunto ai pozzetti. La perossidasi da rafano del coniugato legato catalizza l ossidazione del derivato del luminolo, dando origine a produzione di luce. L agente di trasferimento di elettroni (acetanilide sostituita) provoca un aumento del livello di luce prodotta e prolungane l emissione. I segnali luminosi vengono letti dal Sistema VITROS. Il quantitativo di coniugato con perossidasi da rafano legato è indirettamente proporzionale alla concentrazione di Estradiolo presente. Avvertenze e precauzioni Solo per uso diagnostico in vitro AVVERTENZA: Materiale potenzialmente infettivo Gli emoderivati contenuti nella presente confezione e nei calibratori per Estradiolo VITROS provengono da donatori umani i quali sono stati sottoposti a test individuali usando metodi approvati (immunodosaggio enzimatico) e risultati negativi per quanto concerne la presenza dell antigene di superficie dell epatite di tipo B, di anticorpi del virus dell immunodeficienza umana (HIV 1+2) e del virus dell epatite C (HCV). Trattare come materiale potenzialmente infettivo. Si raccomanda di usare la dovuta cautela nel maneggiare materiale di origine umana. Tutti i campioni sono da considerare come potenziale fonte di infezione. Nessun metodo sperimentale può garantire con assoluta certezza l assenza del virus dell epatite di tipo B, HCV, dell HIV 1+2 o di altri agenti infettivi. Campioni e componenti del dosaggio devono essere manipolati, conservati ed eliminati in forma solida o liquida in conformità alle procedure dettate dalle relative direttive e normative nazionali in materia di sicurezza biologica (per es. Direttiva M29 del NCCLS 6 ). Versione 1.0 Pubb. n. GEM1050_IT 1
2 E2 ISTRUZIONI PER L USO Materiali forniti AVVERTENZA: Contiene Kathon Il reagenti contenente del Kathon. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. R52/53: Nocivo per gli organismi acquatici, può provocare a lungo termine effetti negativi per l ambiente acquatico. S24: Evitare il contatto con la pelle. S37: Usare guanti adatti. Materiali forniti 1 confezione di reagenti contenente: 100 pozzetti rivestiti (streptavidina, lega 2 ng biotina/pozzetto). 13,3 ml reagente coniugato (estradiolo-hrp, 80 ng/ml) in tampone con agente antimicrobico. 8,4 ml reagente anticorpo biotinilato (biotina-anti-estradiolo da coniglio e biotina-anti-estradiolo da pecora, lega 7 pmol estradiolo/ml) in tampone con siero umano e agente antimicrobico. NB: Contiene sieroalbumina bovina. Materiali richiesti, ma non forniti nel kit Sistema VITROS per immunodiagnostica oltre ai seguenti prodotti immunodiagnostici VITROS: Calibratori per Estradiolo (comprese scheda di calibrazione lotti e scheda dei protocolli), reagente di segnale, reagente di lavaggio universale, diluente per campioni ad elevata concentrazione A, contenitore per la conservazione delle confezioni di reagenti (opzionale) con essiccante. Preparazione e conservazione dei reagenti Le Confezioni di Reagenti per Prodotti Immunodiagnostici VITROS contengono reagenti liquidi omogenei che non devono essere agitati né mescolati prima di essere caricati sul sistema. Come tutte le soluzioni per dosaggi immunologici a base di proteine, una manipolazione scorretta della confezione di reagente può provocare la formazione di schiuma sulla superficie del reagente stesso. La confezione dei reagenti viene fornita pronta per l uso. Conservare i reagenti in condizioni integre a 2-8 C. Non congelare. Una volta aperta, utilizzare la confezione dei reagenti entro 8 settimane dal primo caricamento sul sistema. Non usare oltre la data di scadenza. Conservare le confezioni di reagenti aperte direttamente sul sistema o a 2-8 C in apposito contenitore ermetico per la conservazione delle confezioni di reagenti con essiccante. I calibratori per Estradiolo VITROS vengono forniti pronti per l uso. Conservare i calibratori in condizioni integre a 2-8 C. Non usare oltre la data di scadenza. Dopo l apertura conservare per un massimo di 13 settimane a 2-8 C o di 13 settimane a -20 C (è ammesso un solo ciclo di congelamento-scongelamento). Preparazione del paziente Non è necessaria alcuna preparazione specifica del paziente. Raccolta, preparazione e conservazione dei campioni Si possono usare campioni di siero o plasma (eparina o EDTA). Per la raccolta dei campioni ematici attenersi a procedure standard. I campioni possono essere conservati fino ad un massimo di 2 giorni a 2-8 C o di 4 settimane a -20 C. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. Si è riscontrato che alcuni dispositivi di prelievo del campione biologico hanno determinato alterazioni all integrità di determinati analiti provocando interferenze nella determinazione analitica 7. Considerata la varietà di dispositivi per la raccolta dei campioni disponibili in commercio, la Ortho-Clinical Diagnostics non è in grado di definire con assoluta certezza le prestazioni dei propri prodotti con tutti i diversi dispositivi. Si raccomanda pertanto che i singoli utilizzatori verifichino che il sistema di prelievo da loro adottato venga usato nel rispetto delle istruzioni della Casa produttrice e sia compatibile con questo dosaggio VITROS. 2 Pubb. n. GEM1050_IT Versione 1.0
3 ISTRUZIONI PER L USO Note sul controllo di qualità e sulla procedura E2 Note sul controllo di qualità e sulla procedura Maneggiare la confezione dei reagenti con cura evitando la formazione di condensa sulla scatola, evitando la formazione di schiuma nei reagenti ed infine cercando di non agitare la scatola stessa. Se le Confezioni di Reagenti VITROS vengono capovolte o agitate, piccole quantità di schiuma sottile possono risultare impossibili da rilevare dal Sistema VITROS. Le Confezioni di Reagenti contenenti una schiuma sottile che non viene rilevata possono mostrare un bias positivo. Se dovete utilizzare una confezione di reagente che è stata capovolta o agitata prima che abbia avuto la possibilità di depositarsi, dovrete verificarne le prestazioni eseguendo campioni in duplicato ai fini del controllo qualità dopo aver caricato la confezione sul sistema. La calibrazione è specifica per i singoli lotti. Le confezioni di reagenti e i calibratori corrispondenti sono legati da un numero di lotto. Le confezioni di reagenti dello stesso lotto possono utilizzare la medesima calibrazione, che dev essere effettuata con calibratori aventi lo stesso numero di lotto. Mescolare perfettamente i campioni, i calibratori e i controlli per inversione e portarli a C prima dell uso. Manipolare i campioni, calibratori e controlli in contenitori chiusi al fine di evitare contaminazione ed evaporazione. Per evitare l evaporazione, limitare il numero di campioni, calibratori e controlli presenti sul sistema VITROS. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Dopo l uso, devono essere tempestivamente riportati a 2-8 C. In alternativa è possible utilizzarne un aliquota sufficiente ad una singola determinazione. I calibratori possono essere aliquotati in altri contenitori resi identificabili mediante le etichette con codice a barre fornite nel kit. Verificare periodicamente il materiale a disposizione assicurando la corretta gestione dei reagenti ed assicurarsi che la disponibilità di lotti di reagenti di Segnale, Reagenti di Lavaggio Universale e Reagenti calibrati sia sufficiente a condurre le analisi programmate. Dovendo eseguire una serie di dosaggi su un singolo campione, è opportuno accertarsi che il volume di campione sia sufficiente ad effettuare i dosaggi richiesti. La buona prassi di laboratorio prevede l esecuzione di controlli ai fini della verifica delle prestazioni del dosaggio eseguito. I controlli RE VITROS contengono 3 idonei livelli di Estradiolo (basso, medio e alto). Si raccomanda di eseguire i controlli contestualmente all esecuzione di una calibrazione e, successivamente, almeno una volta ogni 24 ore e dopo l esecuzione delle procedure di controllo previste (Cfr. la Guida dell operatore del sistema VITROS). Se le procedure di controllo di qualità interne al vostro laboratorio richiedono un uso più frequente dei controlli, è opportuno attenersi alle procedure previste. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Il nome predefinito del dosaggio che appare sul referto del paziente è Estradiol. L abbreviazione predefinita che appare sui menu di selezione dei dosaggi e sui referti di laboratorio è E2. Se necessario è possibile riconfigurare questi nomi predefiniti. I risultati possono essere espressi come pmol/l o pg/ml. Tali opzioni sono configurabili dalla videata di configurazione degli analiti nelle Opzioni e Configurazioni. I campioni di siero con valori superiori all intervallo di calibrazione possono essere diluiti fino a 1/5 con diluente per campioni ad elevata concentrazione A precedentemente al dosaggio. Fare riferimento al foglietto illustrativo del diluente per campioni ad elevata concentrazione A. Procedura Il dosaggio Estradiolo VITROS richiede 25 µl di campione, calibratore o controllo per una determinazione singola. Questo non tiene conto del volume minimo di riempimento del contenitore per campioni utilizzato. Il dosaggio Estradiolo VITROS dev essere calibrato ogni volta si usi un nuovo lotto di reagenti e, successivamente, ad intervalli di 28 giorni. Il dosaggio per Estradiolo VITROS dev essere calibrato anche dopo l esecuzione di alcune procedure di controllo oppure se i risultati del controllo qualità differiscono molto dal range accettabile. Per informazioni più dettagliate sul funzionamento del sistema si veda la Guida dell Operatore del Sistema VITROS per immunodiagnostica, capitoli 4-7. In breve: 1. Effettuare la scansione della scheda dei protocolli per caricare un nuovo protocollo di analisi sul sistema. A questo punto viene visualizzato il pulsante relativo al dosaggio sulla videata di programmazione dei campioni. Effettuare la scansione della scheda di calibrazione dei lotti per ogni nuovo lotto di reagenti per immettere i dati di scadenza e di calibrazione specifici per quel lotto. 2. Aprire la busta e prelevare la confezione dei reagenti. Caricare la confezione sull unità di autocaricamento o utilizzare il pulsante di scarico/carico nella videata di gestione dei reagenti (visualizzazione per reagente). NOTA: Non utilizzare prodotti danneggiati o non sigillati perfettamente. 3. Caricare i campioni nei settori portacampioni universali usando, se necessario, appositi adattatori (volendo, si possono identificare i campioni con codici a barre). Collocare un puntale monouso accanto ai singoli campioni e caricare i portacampioni sul sistema. Definire i programmi dei campioni tramite la videata di programmazione dei campioni. Avviare la funzione di campionamento. Tutte le fasi operative sul campione verranno eseguite automaticamente. 4. Processare i calibratori analogamente ai campioni. Non è necessario programmare la calibrazione se si usano etichette con codici a barre. Caricare i calibratori nell ordine voluto. La calibrazione parte automaticamente. Versione 1.0 Pubb. n. GEM1050_IT 3
4 E2 ISTRUZIONI PER L USO Risultati Risultati Per costruire la curva di calibrazione principale codificata sulla scheda di calibrazione dei lotti si usa una funzione di interpolazione di curva logistica a quattro parametri modificata. Il processo di calibrazione riposiziona la curva di calibrazione principale definendo una curva valida che viene memorizzata per il sistema. Per maggiori informazioni leggere le istruzioni per l uso dei calibratori. I risultati vengono calcolati automaticamente dal Sistema VITROS. Controllo di qualità I risultati di calibrazione vengono confrontati con un range di parametri di qualità che appaiono in dettaglio nella videata dei parametri di calibrazione alla quale si accede dalle Opzioni e Configurazioni (videata di revisione/calibrazioni utente). Sul rapporto di calibrazione verrà evidenziato se i range dei parametri di qualità definiti non vengono rispettati. Per le operazioni da eseguire successivamente ad una calibrazione non andata a buon fine si veda il capitolo 8 della Guida dell Operatore (Revisione dei risultati). I valori dei campioni dei pazienti che non rientrano nell intervallo di riferimento vengono identificati con l indicazione basso o elevato LO o HI. I valori dei controlli vengono evidenziati se 2 DS rispetto alla media di base definita. Non esistono singoli parametri in grado di descrivere completamente la qualità dell interpolazione della curva. Il rapporto di calibrazione dev essere utilizzato in abbinamento a valori di controllo per la determinazione della validità della calibrazione. Se i risultati di controllo differiscono di molto dal range accettabile, indagarne la causa prima di decidere se annotare i risultati del paziente. Limiti della procedura I risultati ottenuti con questo o altri kit diagnostici devono essere utilizzati ed interpretati esclusivamente nel contesto del quadro clinico generale. Gli anticorpi eterofili nei campioni di siero o di plasma possono provocare interferenze negli immunodosaggi 8. Questi anticorpi possono essere presenti nei campioni di sangue provenienti da individui venuti a contatto con animali o che sono stati curati con prodotti derivati da siero animale. I risultati che sono contraddittori con le osservazioni cliniche indicano che sono necessari altri test. I campioni contenenti trioleina (36,1 mmol/l), emoglobina (1,3 g/l) o bilirubina (0,17 mmol/l) interferiscono con questo dosaggio meno del 9%, 7% e 3% rispettivamente. Non usare campioni torbidi. I livelli di biotina nel siero restano elevati fino a 24 ore in seguito a somministrazione di biotina per via orale o intravenosa. I campioni contenenti 5 ng di biotina/ml interferiscono meno del 5%. Risultati non accurati possono essere derivare da trattamento steroideo o da condizioni fisiologiche che danno luogo a forti variazioni nelle concentrazioni di proteine sieriche. I livelli di estradiolo possono risultare elevati a seguito di difetti nel metabolismo steroideo non dipendente dall asse ipotalamico-pituitario-gonadico. Valori attesi Ogni laboratorio dovrebbe confermare la validità degli intervalli di rifermento rispetto alla popolazione afferente. A titolo informativo, indichiamo i seguenti intervalli che sono stati determinati da 15 cicli mestruali normali, per la fase follicolare, il picco pre-ovulatorio e la fase luteinica: da 97,5 a 592 pmol/l (59 campioni), da 685 a pmol/l (15 campioni) e da 120 a 738 pmol/l (156 campioni), rispettivamente. Da 46 donne in post-menopausa è stato ottenuto un intervallo fra 19,7 e 141 pmol/l; da 46 individui maschi normali si è ottenuto un intervallo fra 19,7 e 242 pmol/l. Prestazioni metodologiche Calibrazione e modalità per ricostruirla L intervallo di calibrazione del dosaggio Estradiolo VITROS è pmol estradiolo/l (ricavabile da calibratori di riferimento interni che sono stati avvalorati per essere messi in correlazione con i campioni analizzati mediante diluizione con isotopigascromatografia/ spettrometria di massa, ID-GC/MS). Le concentrazioni di estradiolo vengono indicate in unità di pmol/l o pg/ml. La conversione tra le unità viene effettuata mediante la formula: Risultato in pg estradiolo/ml = Risultato in pmol estradiolo/l x 0,2724 Accuratezza Si è ottenuta una correlazione tra il dosaggio Estradiolo VITROS e un dosaggio in commercio (X) misurando un pannello di 199 campioni di pazienti appartenenti a diverse categorie cliniche. Il range di campioni utilizzato andava da 16, pmol/l con dosaggio Estradiolo VITROS e 52, pmol/l con il dosaggio in commercio: Dosaggio Estradiolo VITROS = 0,909 x X - 22,3 (pmol/l), con coefficiente di correlazione di 0, Pubb. n. GEM1050_IT Versione 1.0
5 ISTRUZIONI PER L USO Bibliografia E2 Precisione La precisione è stata valutata secondo il protocollo EP5-T2 9 del National Committee for Clinical Laboratory Standards. Sono stati utilizzati quattro sieri di controllo liofilizzati. Un replicato del controllo 1 e due replicati dei controlli 2, 3 e 4 sono stati dosati in due differenti sedute giornaliere per 20 giorni. L esperimento è stato ripetuto con due lotti di reagenti su sistemi diversi. I dati risultanti sono rappresentativi delle prestazioni del prodotto. Tabella 1: Precisione Siero di Concentrazione Giornaliera Intracalibrazione Intralaboratorio controllo tipica pmol/l DS* CV(%)* DS* CV(%)* DS* CV(%)* ,3 6,1 13,4 7,1 15,8 7, ,84 3,7 18,2 7,7 21,4 8, ,4 1,8 59,6 4,5 66,7 4, ,5 1, , ,2 * Quadratica media Giornaliera: Precisione fra un duplicato e l altro, con media ottenuta su tutte le sedute. Intracalibrazione: Precisione totale, con componenti ponderati di variabilità intra-seduta, fra più sedute e da giorno a giorno. Intralaboratorio: Misura dell effetto della ricalibrazione sulla precisione totale, calcolata nell ambito di un singolo lotto di reagenti, utilizzando dati di 4 calibrazioni. Sensibilità La sensibilità analitica viene definita come la concentrazione pari a 2 deviazioni standard rispetto alla media di un campione che non contiene analiti, sul quale vengono determinati 20 replicati. Tipicamente, la sensibilità del dosaggio Estradiolo VITROS è 10 pmol/l. Specificità La cross-reattività percentuale al 50% di legame dello standard zero era <0,5% per l estriolo e <3,1% per l estrone. La crossreattività percentuale a 1,9 µmol/l di estrone-3-solfato era 0,02%, non rilevabile a 201 nmol/l di estradiolo-17-glucuronide, 0,0006% a 3,4 µmol/l di 5α-diidro-testosterone, non rilevabile a 347 nmol/l di testosterone, non rilevabile a 2,3 µmol/l di DHEA-solfato, non rilevabile a 3,5 µmol/l di androstenedione, non rilevabile a 3,2 µmol/l di progesterone, non rilevabile a 1,7 µmol/l di clomifene citrato e 0,11% a 750 nmol/l di estradiolo-3-solfato. Bibliografia 1. Abraham GE. In Taymer ML & Green TH (eds), Progress in Gynaecology 1. Grune & Stratton, New York: (1975). 2. Gower DB & Fotherby K. In Makin HLJ (ed), Biochemistry of Steroid Hormones. Blackwell, Oxford: (1975). 3. Gupta D (ed), Radioimmunoassay of Steroid Hormones, 2nd ed. Verlag Chemie, Basel (1980). 4. Yen SSC & Lein A. Am J Obstet Gynecol 126: (1976). 5. Summers M et al. Clin Chem 41. S73 (1995). 6. NCCLS. Protection of laboratory Workers from Instrument biohazards and Infectious Diseases Transmitted by Blood, Body Fluids and tissue; Approved guideline. NCCLS Document M29-A (ISBN ). NCCLS, Wayne, PA 19087; Calam RR. J Clin Immunoassay 11: (1988). 8. Levinson SS. J Clin Immunoassay 15: (1992). 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Order Code EP5-T2. (1992). Versione 1.0 Pubb. n. GEM1050_IT 5
6 E2 ISTRUZIONI PER L USO Glossario dei simboli Glossario dei simboli Revisioni Data revisione Versione Modifiche tecniche apportate* Nuovo formato, tecnicamente equivalente a PIGEM1050/101.0 con le seguenti variazioni minori: Sezione Simboli usati sostituita dalla tabella Glossario dei simboli Aggiunta la casella per la firma della sezione Revisioni * Le barre delle modifiche indicano la posizione del testo aggiornato rispetto alla versione precedente del documento. Quando le presenti Istruzioni per l uso saranno sostituite da quelle aggiornate, apporre la propria firma e la data e conservare in base alle direttive locali o ai regolamenti del laboratorio. Firma Data Condizioni di fornitura: tutte le forniture sono soggette ai termini e alle condizioni di vendita della ditta Ortho-Clinical Diagnostics e dei suoi distributori. Copie di tali condizioni saranno disponibili su richiesta. Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson Holmers Farm Way High Wycombe Buckinghamshire HP12 4DP United Kingdom VITROS è un marchio di Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Pubb. n. GEM1050_IT Versione 1.0
Trattare come prodotto potenzialmente infettivo.
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