Impiego Per la determinazione quantitativa in vitro del progesterone nel siero e nel plasma umani (EDTA o eparina).

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1 ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti Progesterone Prog Impiego Per la determinazione quantitativa in vitro del progesterone nel siero e nel plasma umani (EDTA o eparina). Compendio e spiegazione del dosaggio I principali siti di produzione del progesterone sono la corteccia surrenale, le ovaie, il corpo luteo dopo ovulazione e la placenta a partire dalla dodicesima settimana di gravidanza 1,2,3. Il progesterone in circolazione viene legato a diverse proteine sieriche comprese albumina e globulina legante corticosteroide. L ormone libero fisiologicamente attivo rappresenta circa il 3% della concentrazione totale di progesterone 4. La misura del progesterone sierico è utile nell esame della funzione ovarica dove i disordini ovulatori provocano infertilità nel 15-20% delle pazienti nonché per prevedere l ovulazione in cicli indotti dove i valori sono generalmente più elevati del normale 5. Le misurazioni del progesterone opportunamente condotte possono essere utilizzate a fini diagnostici nel caso di pazienti che presentano situazioni di minaccia di aborto o di aborto ricorrente durante le prime dieci settimane di gestazione 6,7. La disfunzione del corpo luteo è indicata da concentrazioni progesteroniche inferiori alla norma. Principi della procedura Il dosaggio del progesterone VITROS viene eseguito mediante la confezione di reagente per il Progesterone VITROS e i calibratori per il Progesterone per prodotti immunodiagnostici VITROS sul sistema immunodiagnostico VITROS. Il dosaggio del progesterone VITROS utilizza una tecnica d immunodosaggio competitiva, che si basa sulla competizione tra il progesterone presente nel campione e il progesterone marcato HRP (perossidasi da rafano) per un numero limitato di siti leganti su anticorpo anti-progesterone di coniglio biotinilato presente in fase liquida. Gli effetti delle proteine vincolanti sono eliminati dall uso di idoneo agente bloccante. L anticorpo anti-progesterone di coniglio biotinilato viene catturato dalla streptavidina che riveste i pozzetti. Il coniugato non legato viene eliminato mediante lavaggio. Il coniugato con perossidasi da rafano legato viene misurato mediante reazione luminescente 8. Un reagente contenente substrati luminogenici (derivato del luminolo e sale peracido) ed un agente di trasferimento di elettroni, viene aggiunto ai pozzetti. La perossidasi da rafano nel coniugato legato catalizza l ossidazione del derivato del luminolo, dando origine a produzione di luce. L agente di trasferimento di elettroni (acetanilide sostituita) provoca un aumento del livello di luce prodotta prolungandone l emissione. I segnali luminosi vengono letti dal Sistema VITROS. Il quantitativo di coniugato con perossidasi da rafano legato è indirettamente proporzionale alla concentrazione di Progesterone presente. Avvertenze e precauzioni Solo per uso diagnostico in vitro AVVERTENZA: Materiale potenzialmente infettivo I calibratori per Progesterone VITROS contengono emoderivati provenienti da donatori umani i quali sono stati sottoposti a test individuali usando metodi approvati (immunodosaggio enzimatico) e risultati negativi per quanto concerne la presenza dell antigene di superficie dell epatite di tipo B, di anticorpi del virus dell immunodeficienza umana (HIV 1+ 2) e del virus dell epatite C (HCV). Trattare come materiale potenzialmente infettivo. Si raccomanda di usare la dovuta cautela nel maneggiare i campioni di origine umana. Tutti i campioni sono da considerare come potenziale fonte di infezione. Nessun metodo sperimentale può garantire con assoluta certezza l assenza del virus dell epatite di tipo B, HCV, dell HIV 1+2 o di altri agenti infettivi. Campioni e componenti del dosaggio devono essere manipolati, conservati ed eliminati in forma solida o liquida in conformità alle procedure dettate dalle relative direttive e normative nazionali in materia di sicurezza biologica (per es. Direttiva M29 del NCCLS 9 ). Versione 1.0 Pubb. n. GEM1071_IT 1

2 Prog ISTRUZIONI PER L USO Materiali forniti AVVERTENZA: Contiene Kathon Il reagenti contenente Kathon. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. R52/53: Nocivo per gli organismi acquatici, può provocare a lungo termine effetti negativi per l'ambiente acquatico. S24: Evitare il contatto con la pelle. S37: Usare guanti adatti. Materiali forniti 1 confezione dei reagenti contenente: 100 pozzetti rivestiti (streptavidina, legante 3 ng biotina/pozzetto). 10,0 ml di reagente coniugato (progesterone marcato HRP, 70 ng/ml) in tampone con agente antimicrobico. 10,0 ml di reagente anticorpo biotinilato (biotina-anti-progesterone di coniglio, legante 70 pmol di progesterone/ml) in tampone con agente antimicrobico. NOTA: Contiene sieroalbumina bovina e gammaglobulina bovina. Materiali richiesti, ma non forniti nel kit Sistema VITROS per immunodiagnostica oltre ai seguenti prodotti immunodiagnostici VITROS: Calibratori per Progesterone (comprese scheda di calibrazione lotti e scheda dei protocolli), reagente di segnale, reagente di lavaggio universale, diluente per campioni ad elevata concentrazione A, contenitore per la conservazione delle confezioni di reagenti (opzionale) con essiccante. Preparazione e conservazione dei reagenti La confezione dei reagenti viene fornita pronta per l uso. Conservare i reagenti in condizioni integre a 2-8 C. Non congelare. Una volta aperta, utilizzare la confezione dei reagenti entro 12 settimane dal primo caricamento sul sistema. Non usare oltre la data di scadenza. Conservare le confezioni di reagenti aperte direttamente sul sistema o a 2-8 C in apposito contenitore ermetico per la conservazione delle confezioni di reagenti sigillati con essiccante a secco. I calibratori per Progesterone VITROS vengono forniti liofilizzati. Conservare i calibratori in condizioni integre a 2-8 C. Non usare oltre la data di scadenza. Ricostituire con 1 ml di acqua distillata. Dopo l apertura conservare per un massimo di 13 settimane a 2-8 C o di 13 settimane a -20 C (è ammesso un solo ciclo di congelamento-scongelamento). Preparazione del paziente Non è necessaria alcuna preparazione specifica del paziente. Raccolta, preparazione e conservazione dei campioni Si possono usare campioni di siero o plasma (EDTA o eparina). Per la raccolta dei campioni ematici attenersi a procedure standard. I campioni di siero o plasma possono essere conservati fino ad un massimo di 7 giorni a 2-8 C o di 4 settimane a -20 C. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. Si è riscontrato che alcuni dispositivi di prelievo del campione biologico hanno determinato alterazioni all integrità di determinati analiti provocando interferenze nella determinazione analitica 10. Considerata la varietà di dispositivi per la raccolta dei campioni disponibili in commercio, la Ortho-Clinical Diagnostics non è in grado di definire con assoluta certezza le prestazioni dei propri prodotti con tutti i diversi dispositivi. Si raccomanda pertanto che i singoli utilizzatori verifichino che il sistema di prelievo da loro adottato venga usato nel rispetto delle istruzioni della Casa produttrice e sia compatibile con il sistema VITROS. Note sul controllo di qualità e sulla procedura Maneggiare la confezione dei reagenti con cura evitando la formazione di condensa sulla scatola, evitando la formazione di schiuma nei reagenti ed infine cercando di non agitare la scatola stessa. La calibrazione è specifica per i singoli lotti. Le confezioni di reagenti e i calibratori corrispondenti sono identificabili dal numero di lotto. Le confezioni di reagenti dello stesso lotto possono utilizzare la medesima calibrazione, che dev essere effettuata con calibratori aventi lo stesso numero di lotto. Mescolare perfettamente i campioni, i calibratori e i controlli per inversione e portarli a C prima dell uso. Manipolare i campioni, calibratori e controlli in contenitori chiusi al fine di evitare contaminazione ed evaporazione. Per evitare l evaporazione, limitare il numero di campioni, calibratori e controlli presenti sul sistema VITROS. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Dopo l uso, devono essere tempestivamente riportati a 2-8 C. In alternativa è possibile utilizzarne un aliquota sufficiente ad una singola determinazione. I calibratori possono essere aliquotati in altri contenitori resi identificabili mediante le etichette con codice a barre fornite nel kit. 2 Pubb. n. GEM1071_IT Versione 1.0

3 ISTRUZIONI PER L USO Procedura Prog Verificare periodicamente il materiale a disposizione per assicurare una corretta gestione dei reagenti e la disponibilità di lotti di reagenti di Segnale, Reagenti di Lavaggio Universale e Reagenti calibrati sufficienti a condurre le analisi programmate. Dovendo eseguire una serie di dosaggi su un singolo campione, è opportuno accertarsi che il volume di campione sia sufficiente ad effettuare i dosaggi richiesti. La buona prassi di laboratorio prevede l esecuzione di controlli ai fini della verifica delle prestazioni del dosaggio eseguito. I controlli RE VITROS contengono 3 idonei livelli di Progesterone (bassi, medi, elevati). Si raccomanda di eseguire i controlli contestualmente all esecuzione di una calibrazione e, successivamente, almeno una volta ogni 24 ore e dopo l esecuzione delle procedure di controllo previste (Cfr. la Guida dell operatore del sistema VITROS). Se le procedure di controllo di qualità interne richiedono un uso più frequente dei controlli, è opportuno attenersi alle procedure previste. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell Operatore del Sistema VITROS. Il nome predefinito del dosaggio che appare sul referto del paziente è Progesterone. L abbreviazione predefinita che appare sui menu di selezione dei dosaggi e sui referti di laboratorio è Prog. Se necessario è possibile riconfigurare questi valori predefiniti dalla videata di configurazione degli analiti nelle Opzioni e Configurazioni. I risultati possono essere espressi come nmol/l o ng/ml. Tali opzioni sono configurabili dalla videata di configurazione degli analiti nelle Opzioni e Configurazioni. I campioni di siero o plasma (EDTA o eparina) con valori superiori all intervallo di calibrazione possono essere diluiti, prima del dosaggio, fino a 1/10 con diluente per campioni ad elevata concentrazione A. Fare riferimento alle istruzioni per l'uso del diluente per campioni ad elevata concentrazione A. Procedura Il dosaggio per Progesterone VITROS richiede 25 µl di campione, calibratore o controllo per una determinazione singola, indipendentemente dal volume minimo di riempimento del contenitore per campioni utilizzato. Il dosaggio per Progesterone VITROS dev essere calibrato ogni volta che si usa un nuovo lotto di reagenti e, successivamente, ad intervalli di 28 giorni. Il dosaggio per Progesterone VITROS dev essere calibrato anche dopo l esecuzione di alcune procedure di controllo oppure se i risultati del controllo qualità differiscono molto dal range accettabile. Per informazioni più dettagliate sul funzionamento del sistema si veda la Guida dell Operatore del Sistema immunodiagnostico VITROS, capitoli 4-7. In breve: 1. Effettuare la scansione della scheda dei protocolli per caricare un nuovo protocollo di analisi sul sistema. A questo punto viene visualizzato il pulsante relativo alle diverse determinazioni sulla videata di programmazione dei campioni. Effettuare la scansione della scheda di calibrazione dei lotti per ogni nuovo lotto di reagenti al fine di immettere i dati di scadenza e di calibrazione specifici per quel lotto. 2. Aprire la busta e prelevare la confezione dei reagenti. Caricare la confezione sull unità di autocaricamento o utilizzare il pulsante di scarico/carico nella videata di gestione dei reagenti (visualizzazione per reagente). NOTA: Non utilizzare prodotti danneggiati o non sigillati perfettamente. 3. Caricare i campioni nei settori portacampioni universali usando, se necessario, appositi adattatori (volendo, si possono identificare i campioni con codici a barre). Collocare un puntale monouso accanto ai singoli campioni e caricare i settori sul sistema. Definire i programmi dei campioni tramite la videata di programmazione dei campioni. Avviare la funzione di campionamento. Tutte le fasi di campionamento vengono effettuate automaticamente. 4. Analizzare i calibratori analogamente ai campioni. Non è necessario programmare la calibrazione se si usano etichette con codici a barre. Caricare i calibratori nell ordine voluto: la calibrazione parte automaticamente. Risultati Per costruire la curva di calibrazione principale codificata sulla scheda di calibrazione dei lotti si usa una funzione di aggiustamento di curva logistica a quattro parametri modificata. Il processo di calibrazione riposiziona la curva di calibrazione principale definendo una curva valida che viene memorizzata nel sistema. Per maggiori informazioni leggere le istruzioni per l uso dei calibratori. I risultati vengono calcolati automaticamente dal Sistema VITROS. Controllo di qualità I risultati di calibrazione vengono confrontati con un range di parametri di che appaiono in dettaglio nella videata dei parametri di calibrazione alla quale si accede dalle Opzioni e Configurazioni (videata di revisione/calibrazioni utente). Se non vengono rispettati tutti i range dei parametri di qualità definiti, sul rapporto di calibrazione appare un codice d identificazione. Per le operazioni da eseguire successivamente ad una calibrazione non andata a buon fine si veda il capitolo 8 della Guida dell Operatore (Revisione dei risultati). I valori dei campioni dei pazienti che non rientrano nell intervallo di riferimento vengono identificati con un codice basso o elevato LO o HI. I valori dei controlli vengono identificati se 2 DS rispetto alla media della linea di base definita. Non esistono parametri individuali in grado di descrivere completamente la qualità dell aggiustamento della curva. Il rapporto di calibrazione dev essere utilizzato in abbinamento a valori di controllo ai fini della determinazione della validità della calibrazione. Se i risultati di controllo differiscono di molto dal range accettabile, indagarne la causa prima di decidere se annotare i risultati del paziente. Versione 1.0 Pubb. n. GEM1071_IT 3

4 Prog ISTRUZIONI PER L USO Limiti della procedura Limiti della procedura I risultati ottenuti con questo o altri kit diagnostici devono essere utilizzati ed interpretati esclusivamente nel contesto del quadro clinico generale. Gli anticorpi eterofili nei campioni di siero o di plasma possono provocare interferenze negli immunodosaggi 11. Questi anticorpi possono essere presenti nei campioni di sangue provenienti da individui a contatto con animali o che sono stati curati con prodotti derivati da siero animale. I risultati che sono contraddittori con le osservazioni cliniche indicano che sono necessari altri test. I campioni contenenti trioleina (5,65 mmol/l), emoglobina (5,0 g/l),bilirubina (0,342 mmol/l) o dipirona (28,5 mmol/l) interferiscono in ragione di meno del 10%. Non usare campioni torbidi. I livelli di biotina nel siero restano elevati fino a 24 ore dopo somministrazione orale o endovenosa di biotina. I campioni contenenti 20 ng/ml di biotina interferiscono in ragione di meno del 10%. Valori attesi Ogni laboratorio dovrebbe confermare la validità degli intervalli di riferimento rispetto alla popolazione afferente. A titolo di guida, i valori di progesterone sono stati determinati in campioni provenienti di pazienti appartenenti a diverse categorie cliniche. La media dei valori e gli intervalli di riferimento ottenuti sono mostrati nella tabella 1 - Intervalli di riferimento del progesterone. Tabella 1: Intervalli di riferimento del progesterone (nmol/l) Intervalli di riferimento Media Intervallo n Cicli di ovulazione Follicolare 2,57 0,44-6,47 96 Periovulatoria 6,00 1,27 14,2 56 Media luteale 39,5 16,6 72,2 66 Luteale 22,1 4,53 52,9 62 Donne gravide 1 trimestre 62,9 da 20,9 a (4-12 settimane di gestazione) 2 trimestre 114 da 30,7 a (13-24 settimane di gestazione) 3 trimestre 288 da 77,9 a (25-36 settimane di gestazione) Donne in post-menopausa 1,27 da 0,49 a 3,31 48 Maschi normali 2,28 da 0,66 a 4,89 50 Prestazioni metodologiche Calibrazione e modalità per ricostruirla L'intervallo di calibrazione del dosaggio del progesterone VITROS è nmol/l (ricavabile da calibratori di riferimento interni che sono stati avvalorati per essere messi in correlazione con un altro dosaggio disponibile in commercio). Le concentrazioni di progesterone sono espresse in nmol/l o ng/ml. La conversione da un unità all altra viene effettuata mediante la formula: Risultato in ng/ml = risultato in nmol/l x 0,3145 Accuratezza Si è ottenuta una correlazione tra il dosaggio Progesterone VITROS e un dosaggio del commercio (X) misurando un pannello di 210 campioni di pazienti appartenenti a diverse categorie cliniche. Il range di campioni utilizzato andava da 0, nmol/l con dosaggio Progesterone VITROS a 0, nmol/l con il dosaggio del commercio: Dosaggio Progesterone VITROS = 0,976 x X +1,23 (nmol/l), con coefficiente di correlazione di 0, Pubb. n. GEM1071_IT Versione 1.0

5 ISTRUZIONI PER L USO Bibliografia Prog Precisione La precisione è stata valutata secondo il protocollo EP5-T2A 12 del National Committee for Clinical Laboratory Standards. Due replicati di ciascuno dei 3 controlli VITROS per RE e un 'Precision Pool' sono stati dosati in 2 differenti occasioni ogni giorno per almeno 20 giorni. L esperimento è stato eseguito usando tre diversi lotti di reagenti su tre Sistemi differenti. I dati presentati sono rappresentativi delle prestazioni del prodotto. Tabella 2: Precisione Concentrazione Giornaliera Intracalibrazione Intralaboratorio tipica nmol/l DS* CV(%)* DS* CV(%)* DS* CV(%)* 3,41 0,112 3,3 0,242 6,9 0,304 9,0 6,27 0,177 2,8 0,320 5,0 0,381 6,2 24,2 0,360 1,5 0,880 3,6 0,960 4,1 54,2 0,630 1,2 1,77 3,2 1,83 3,4 * Quadratica media Giornaliera: Precisione fra un duplicato e l altro, con media ottenuta su tutti i replicati. Intracalibrazione: Precisione totale, con componenti ponderati di variazione infra-replicato, tra un replicato e l altro e da un giorno all altro. Intralaboratorio: Misura dell effetto della ricalibrazione sulla precisione totale, calcolata nell ambito di un singolo lotto di reagenti, utilizzando dati di 4 calibrazioni. Sensibilità La sensibilità analitica viene definita come la concentrazione di 2 deviazioni standard rispetto alla media di un campione che non contiene analiti, dove vengono determinati 20 replicati. Tipicamente, la sensibilità del dosaggio Progesterone VITROS è inferiore a 0,25 nmol/l. Specificità La percentuale di cross-reattività a 3,03 µmol/l l 11-deossicorticosterone era 4,1%, a 2,89 µmol/l il corticosterone era 3,3%, a 3,03 µmol/l 17α-l idrossiprogesterone era 2,4%, 0,16% a 3,47 µmol/l il testosterone allo 0,18%, a 6,90 µmol/l il cortisolo al 0,15% a 3,16 µmol/l il pregnenolone, 0,43% a 2,89 µmol/l l 11-deossicortisolo, 0,01% a 3,16 µmol/l il 20α-diidroprogesterone, 5,2% a 0,316 µmol/l il 5α-pregnan-3,20-dione, 0,01% a 25,6 µmol/l DHEA-SO 4 e non rilevabile a 29,6 µmol/l danazolo, 2,77 µmol/l prednisolone, 3,67 µmol/l estradiolo, 3,47 µmol/l estriolo, 0,167 µmol/l clomifene e 0,133 µmol/l bromocriptina. Bibliografia 1. Siiteri PK & Febres F. In DeGroot et al. (Eds), Endocrinolgy 3: (1980). 2. Laufer N et al. Am J Obstet Gynecol 143: (1982). 3. Abdulla U et al. Br J Obstet Gynaecol 90: (1983). 4. Dunn JF et al. J Clin Endocrinol 53: (1981). 5. Hull MGR et al. Fertil Steril 37: (1982). 6. Hensleigh PA & Fainstat T. Fertil Steril 32: (1979). 7. Radwanska E et al. Fertil Steril 30: (1978). 8. Summers M et al. Clin Chem 41. S73 (1995). 9. NCCLS. Protection of laboratory Workers from Instrument biohazards and Infectious Diseases Transmitted by Blood, Body Fluids and tissue; Approved guideline. NCCLS Document M29-A (ISBN ). NCCLS, Wayne, PA 19087; Calam RR. J Clin Immunoassay 11: (1988). 11. Levinson, SS. J Clin Immunoassay 15: (1992). 12. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Order Code EP5-A. (1999). Versione 1.0 Pubb. n. GEM1071_IT 5

6 Prog ISTRUZIONI PER L USO Glossario dei simboli Glossario dei simboli 6 Pubb. n. GEM1071_IT Versione 1.0

7 ISTRUZIONI PER L USO Revisioni Prog Revisioni Data revisione Versione Modifiche tecniche apportate* Nuovo formato, tecnicamente equivalente a PIGEM1071/100.0 con le seguenti variazioni minori: Sezione Simboli usati sostituita dalla tabella Glossario dei simboli Aggiunta la casella per la firma della sezione Revisioni * Le barre delle modifiche indicano la posizione del testo aggiornato rispetto alla versione precedente del documento. Quando le presenti Istruzioni per l uso saranno sostituite da quelle aggiornate, apporre la propria firma e la data e conservare in base alle direttive locali o ai regolamenti del laboratorio. Firma Data Versione 1.0 Pubb. n. GEM1071_IT 7

8 Prog ISTRUZIONI PER L USO Condizioni di fornitura: tutte le forniture sono soggette ai termini e alle condizioni di vendita della ditta Ortho-Clinical Diagnostics e dei suoi distributori. Copie di tali condizioni saranno disponibili su richiesta. Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson Holmers Farm Way High Wycombe Buckinghamshire HP12 4DP United Kingdom VITROS è un marchio di Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Pubb. n. GEM1071_IT Versione 1.0