TSH. ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti TSH
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- Annunziata Carbone
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1 ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti TSH TSH Impiego Per la determinazione quantitativa in vitro dell ormone tireostimolante (TSH) in siero e plasma (EDTA o eparina) umani quale ausilio nella diagnosi differenziale delle patologie tiroidee. Compendio e spiegazione del dosaggio La secrezione dell ormone tireostimolante (TSH) ad opera della pituitaria anteriore è controllata dall ormone rilasciante la tireotropina, un tripeptide prodotto dall ipotalamo. Il TSH stimola la produzione di tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) ad opera della ghiandola tiroidea. Le frazioni libere in circolo di T4 e T3 regolano, a loro volta, la secrezione di TSH mediante meccanismo di feedback negativo sulla pituitaria ed eventualmente sull ipotalamo 1. La diagnosi di ipotiroidismo in seguito al rilevamento di basse concentrazioni di T4 libera o totale viene prontamente confermata da un aumento nel livello di TSH 2. La misura di livelli di TSH bassi o non evidenziabili può essere d aiuto nella diagnosi di ipertiroidismo 3,4, dove si registrano elevati livelli di T4 e T3 ed è soppressa la secrezione di TSH. I dosaggi di TSH con livelli elevati di precisione e sensibilità funzionale di 0,01-0,02 miu/l sono stati denominati dosaggi di 3a generazione 5. Essi presentano il vantaggio di operare una discriminazione tra i livelli di TSH osservati in tireotossicosi e i livelli ridotti, seppure riscontrabili, che si verificano nell ipertiroidismo subclinico 6. Principi della procedura Il dosaggio TSH VITROS viene effettuato con la confezione di reattivi TSH VITROS e i calibratori TSH per prodotti immunodiagnostici VITROS sul Sistema VITROS per immunodiagnostica. Viene utilizzata una metodica immunometrica, che implica la reazione simultanea di TSH presente nel campione con anticorpo biotinilato (monoclonale da topo anti-tsh molecola intera) e un anticorpo coniugato marcato con perossidasi da rafano (HRP) (monoclonale da topo anti-subunità β del TSH). Il complesso antigene-anticorpo viene catturato ad opera di streptavidina sui pozzetti, mentre i materiali non legati vengono rimossi mediante lavaggio. Il coniugato con perossidasi da rafano legato viene misurato mediante reazione luminescente 7. Un reagente contenente substrati luminogenici (derivato del luminolo e sale peracido) ed un agente di trasferimento di elettroni vengono aggiunti ai pozzetti. La perossidasi da rafano del coniugato legato catalizza l ossidazione del derivato del luminolo, dando origine a produzione di luce. L agente di trasferimento di elettroni (acetanilide sostituita) provoca un aumento del livello di luce prodotta e prolungane l emissione. I segnali luminosi vengono letti dal Sistema VITROS. Il quantitativo di coniugato con perossidasi da rafano legato è direttamente proporzionale alla concentrazione di TSH presente. Avvertenze e precauzioni Solo per uso diagnostico in vitro AVVERTENZA: Materiale Potenzialmente Infettivo Si raccomanda di usare la dovuta cautela nel maneggiare i materiale di origine umana. Tutti i campioni sono da considerare come potenziale fonte di infezione. Nessun metodo sperimentale può garantire con assoluta certezza l assenza del virus dell epatite di tipo B, del virus dell epatite di tipo C, del virus dell immunodeficienza umana 1+2 o di altri agenti infettivi. Campioni e componenti del dosaggio devono essere manipolati, conservati ed eliminati in forma solida o liquida in conformità alle procedure dettate dalle relative direttive e normative nazionali in materia di sicurezza biologica (per es.direttiva M29 del NCCLS 8 ). AVVERTENZA: Contiene Kathon Il reagenti contenente del Kathon. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. R52/53: Nocivo per gli organismi acquatici, può provocare a lungo termine effetti negativi per l ambiente acquatico. S24: Evitare il contatto con la pelle. S37: Usare guanti adatti. Versione 2.0 Pubb. n. GEM1001_IT 1
2 TSH ISTRUZIONI PER L USO Materiali forniti Materiali forniti 1 confezione di reagenti contenente: 100 pozzetti rivestiti (streptavidina, lega 3 ng di biotina/pozzetto). 6,2 ml di reagente coniugato (HRP-monoclonale da topo anti subunità β del TSH, lega 608,4 µiu di TSH/mL) in tampone con agente antimicrobico. 9,1 ml di reagente anticorpo biotinilato (biotina-anticorpo monoclonale da topo anti-tsh, lega 202,8 µiu di TSH/mL) in tampone con agente antimicrobico. NOTA: Contiene sieroalbumina bovina e gammaglobulina bovina. Materiali richiesti, ma non forniti nel kit Sistema VITROS per immunodiagnostica oltre ai seguenti prodotti immunodiagnostici VITROS: Calibratori per TSH (comprese scheda di calibrazione lotti e scheda dei protocolli), reagente di segnale, reagente di lavaggio universale, diluente A per campioni ad elevata concentrazione, contenitore per la conservazione delle confezioni di reagenti (opzionale) con essiccante. Preparazione e conservazione dei reagenti Le Confezioni di Reagenti per Prodotti Immunodiagnostici VITROS contengono reagenti liquidi omogenei che non devono essere agitati né mescolati prima di essere caricati sul Sistema. Come tutte le soluzioni per dosaggi immunologici a base di proteine, una manipolazione scorretta della confezione di reagente può provocare la formazione di schiuma sulla superficie del reagente stesso. La confezione dei reagenti viene fornita pronta per l uso. Conservare i reagenti in condizioni integre a 2-8 C. Non congelare. Una volta aperta, utilizzare la confezione dei reagenti entro 8 settimane dal primo caricamento sul Sistema. Non usare oltre la data di scadenza. Conservare le confezioni di reagenti aperte direttamente sul Sistema o a 2-8 C in apposito contenitore ermetico per la conservazione delle confezioni di reagenti con essiccante. I calibratori per TSH VITROS vengono forniti pronti per l uso. Conservare i calibratori in condizioni integre a 2-8 C. Non usare oltre la data di scadenza. Dopo l apertura conservare per un massimo di 13 settimane a 2-8 C o di 13 settimane a -20 C (è ammesso un solo ciclo di congelamento-scongelamento). Preparazione del paziente Non è necessaria alcuna preparazione specifica del paziente. Raccolta, preparazione e conservazione dei campioni Si possono usare campioni di siero o plasma (EDTA o eparina). Per la raccolta dei campioni ematici attenersi a procedure standard. I campioni devono essere perfettamente separati dal materiale cellulare. Diversamente c è il rischio di ottenere risultati falsamente elevati. I campioni di siero o plasma possono essere conservati fino ad un massimo di 7 giorni a 2-8 C o di 4 settimane a -20 C. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. Si è riscontrato che alcuni dispositivi di prelievo del campione biologico hanno determinato alterazioni all integrità di determinati analiti provocando interferenze nella determinazione analitica 9. Considerata la varietà di dispositivi per la raccolta dei campioni disponibili in commercio, la Ortho-Clinical Diagnostics non è in grado di definire con assoluta certezza le prestazioni dei propri prodotti con tutti i diversi dispositivi. Si raccomanda pertanto che i singoli utilizzatori verifichino che il Sistema di prelievo da loro adottato venga usato nel rispetto delle istruzioni della Casa produttrice e sia compatibile con questo dosaggio VITROS. Note sul controllo di qualità e sulla procedura Maneggiare la confezione dei reagenti con cura evitando la formazione di condensa sulla scatola, evitando la formazione di schiuma nei reagenti ed infine cercando di non agitare la scatola stessa. Se le Confezioni di Reagenti VITROS vengono capovolte o agitate, piccole quantità di schiuma sottile possono risultare impossibili da rilevare dal Sistema VITROS. Le Confezioni di Reagenti contenenti una schiuma sottile che non viene rilevata possono mostrare una deriva negativo. Se dovete utilizzare una confezione di reagente che è stata capovolta o agitata prima che abbia avuto la possibilità di depositarsi, dovrete verificarne le prestazioni eseguendo campioni in duplicato ai fini del controllo qualità dopo aver caricato la confezione sul Sistema. La calibrazione è specifica per i singoli lotti. Le confezioni di reagenti e i calibratori corrispondenti sono legati da un numero di lotto. Le confezioni di reagenti dello stesso lotto possono utilizzare la medesima calibrazione, che deve essere effettuata con calibratori aventi lo stesso numero di lotto. Mescolare perfettamente i campioni, i calibratori e i controlli per inversione e portarli a C prima dell uso. Manipolare i campioni, i calibratori e i controlli in contenitori chiusi al fine di evitare contaminazione ed evaporazione. Per evitare l evaporazione, limitare il numero di campioni, calibratori e controlli presenti sul Sistema VITROS. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell Operatore del Sistema VITROS. Dopo l uso, devono essere tempestivamente riportati a 2-8 C. In alternativa è possibile utilizzarne un aliquota sufficiente ad una singola determinazione. I calibratori possono essere aliquotati in altri contenitori resi identificabili mediante le etichette con codice a barre fornite nel kit. 2 Pubb. n. GEM1001_IT Versione 2.0
3 ISTRUZIONI PER L USO Procedura TSH Verificare periodicamente il materiale a disposizione assicurando la corretta gestione dei reagenti ed assicurarsi che la disponibilità di lotti di reagenti di Segnale, Reagenti di Lavaggio Universale e Reagenti calibrati sia sufficiente a condurre le analisi programmate. Dovendo eseguire una serie di dosaggi su un singolo campione, è opportuno accertarsi che il volume di campione sia sufficiente ad effettuare i dosaggi richiesti. La buona prassi di laboratorio prevede l esecuzione di controlli ai fini della verifica delle prestazioni del dosaggio eseguito. I controlli tiroide totale o controlli tiroide libere VITROS contengono 3 idonei livelli di TSH (basso, medio e alto). Si raccomanda di eseguire i controlli contestualmente ad una calibrazione e, successivamente, almeno una volta ogni 24 ore e dopo l esecuzione delle procedure di controllo previste (Cfr. la Guida dell Operatore del Sistema VITROS). Se le procedure di controllo di qualità interne al vostro laboratorio richiedono un uso più frequente dei controlli, è opportuno attenersi alle procedure previste. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del Sistema VITROS. Il nome predefinito del dosaggio che appare sul referto del paziente è TSH, poichè è l abbreviazione predefinita che appare sui menu di selezione dei dosaggi e sui referti di laboratorio. Se necessario è possibile riconfigurare questi nomi predefiniti. I risultati possono essere espressi come miu/l o µiu/ml. Tali opzioni sono configurabili dalla videata di configurazione degli analiti nelle Opzioni e Configurazioni. I campioni di siero o plasma (EDTA o eparina) con valori superiori all intervallo di calibrazione possono essere diluiti prima di eseguire il dosaggio fino a 1/10 con diluente A VITROS per campioni ad elevata concentrazione. Fare riferimento al foglietto illustrativo del diluente A per campioni ad elevata concentrazione. Procedura Il dosaggio TSH VITROS richiede 80 µl di campione, calibratore o controllo per una determinazione singola. Questo non tiene conto del volume minimo di riempimento del contenitore per campioni utilizzato. Il dosaggio TSH VITROS dev essere calibrato ogni volta si usi un nuovo lotto di reagenti e, successivamente, ad intervalli di 28 giorni. Il dosaggio per TSH VITROS dev essere calibrato anche dopo l esecuzione di alcune procedure di controllo oppure se i risultati del controllo qualità differiscono molto dal range accettabile. Per informazioni più dettagliate sul funzionamento del Sistema si veda la Guida dell Operatore del Sistema VITROS per immunodiagnostica, capitoli 4-7. In breve: 1. Effettuare la scansione della scheda dei protocolli per caricare un nuovo protocollo di analisi sul Sistema. A questo punto viene visualizzato il pulsante relativo al dosaggio sulla videata di programmazione dei campioni. Effettuare la scansione della scheda di calibrazione dei lotti per ogni nuovo lotto di reagenti al fine di immettere i dati di scadenza e di calibrazione specifici per quel lotto. 2. Aprire la busta e prelevare la confezione dei reagenti. Caricare la confezione sull unità di autocaricamento o utilizzare il pulsante di scarico/carico nella videata di gestione dei reagenti (visualizzazione per reagente). NOTA: Non utilizzare prodotti danneggiati o non sigillati perfettamente. 3. Caricare i campioni nei settori portacampioni universali usando, se necessario, appositi adattatori (volendo, si possono identificare i campioni con codici a barre). Collocare un puntale monouso accanto ai singoli campioni e caricare i portacampioni sul Sistema. Definire i programmi dei campioni tramite la videata di programmazione dei campioni. Avviare la funzione di campionamento. Tutte le fasi operative sul campione verranno eseguite automaticamente. 4. Trattare i calibratori analogamente ai campioni. Non è necessario programmare la calibrazione se si usano etichette con codici a barre. Caricare i calibratori nell ordine voluto: la calibrazione parte automaticamente. Risultati Per costruire la curva di calibrazione principale codificata sulla scheda di calibrazione dei lotti si usa una funzione di interpolazione di curva logistica a quattro parametri modificata. Il processo di calibrazione riposiziona la curva di calibrazione principale definendo una curva valida che viene memorizzata per il Sistema. Per maggiori informazioni leggere le istruzioni per l uso dei calibratori. I risultati vengono calcolati automaticamente dal Sistema VITROS. Versione 2.0 Pubb. n. GEM1001_IT 3
4 TSH ISTRUZIONI PER L USO Controllo di qualità Controllo di qualità I risultati di calibrazione vengono confrontati con un range di parametri di qualità che appaiono in dettaglio nella videata dei parametri di calibrazione alla quale si accede dalle Opzioni e Configurazioni (videata di revisione/calibrazioni utente). Sul rapporto di calibrazione verrà evidenziato se gli intervalli dei parametri di qualità definiti non vengono rispettati. Per le operazioni da eseguire successivamente ad una calibrazione non andata a buon fine si veda il capitolo 8 della Guida dell Operatore (Revisione dei risultati). I valori dei campioni dei pazienti che non rientrano nell intervallo di riferimento vengono identificati con l indicazione basso o elevato LO o HI. I valori dei controlli vengono evidenziati se 2 DS rispetto alla media di base definita. Non esistono singoli parametri in grado di descrivere completamente la qualità dell interpolazione della curva. Il rapporto di calibrazione dev essere utilizzato in abbinamento a valori di controllo per la determinazione della validità della calibrazione. Se i risultati di controllo differiscono di molto dall intervallo di accettabilità, indagarne la causa prima di decidere se annotare i risultati del paziente. Limiti della procedura I risultati ottenuti con questo o altri kit diagnostici devono essere utilizzati ed interpretati esclusivamente nel contesto del quadro clinico generale. Gli anticorpi eterofili nei campioni di siero o di plasma possono provocare interferenze negli immunodosaggi 10. Questi anticorpi possono essere presenti nei campioni di sangue provenienti da individui venuti a contatto con animali o che sono stati curati con prodotti derivati da siero animale. I risultati che sono contraddittori con le osservazioni cliniche indicano che sono necessari altri test. I campioni contenenti trioleina (33,9 mmol/l), emoglobina (0,310 mmol/l) o bilirubina (0,342 mmol/l) interferiscono con questo dosaggio meno del 10%. Non usare campioni torbidi. I livelli di biotina nel siero restano elevati fino a 24 ore dopo somministrazione orale o endovenosa di biotina. I campioni contenenti 5 ng di biotina/ml interferiscono meno del 10%. Gli autoanticorpi degli ormoni tiroidei nei campioni possono causare interferenza con questo dosaggio 11. I risultati incongrui con le osservazioni cliniche indicano che è necessario eseguire dei dosaggi addizionali. Non sono state stabilite le prestazioni di questo dosaggio con campioni neonatali. Il dosaggio TSH VITROS non mostra effetto gancio fino a miu/l. Valori attesi Ogni laboratorio dovrebbe confermare la validità degli intervalli di riferimento rispetto alla popolazione afferente. A titolo informativo, da 525 pazienti in stato eutiroideo, non in trattamento tiroideo, si è ottenuto un intervallo di riferimento normale tra 0,465 e 4,68 miu/l (2,5 e 97,5 percentili), con una media di 1,48 miu/l. Su 114 pazienti ipotiroidei analizzati, tutti presentavano concentrazioni di TSH >4,68 miu/l. Su 100 pazienti ipertiroidei analizzati, tutti presentavano concentrazioni di TSH <0,465 miu/l. Prestazioni metodologiche Calibrazione e modalità per ricostruirla L intervallo di calibrazione del dosaggio TSH VITROS è miu TSH/L (ricavabile da calibratori di riferimento interni che sono stati avvalorati per essere messi in correlazione con un altro dosaggio disponibile in commercio, con riferimento alla Seconda Preparazione Internazionale di Riferimento 80/558). Diluizione Studi di diluizione hanno dimostrato che campioni con valori più alti dell intervallo di calibrazione danno risultati accettabili quando vengono diluiti prima del dosaggio fino a 1/10 con il Diluente VITROS per campioni ad alta concentrazione A. La media del recupero da tutte le diluizioni è del 103,9%, con un intervallo da 96,5% a 115,6%. Accuratezza Si è ottenuta una correlazione tra il dosaggio TSH VITROS e un dosaggio in commercio (X) misurando un pannello di 133 campioni di siero di pazienti appartenenti a diverse categorie cliniche. Il range di campioni utilizzato andava da 0,015-96,4 miu/l con dosaggio TSH VITROS e da 0, miu/l con il dosaggio in commercio: Dosaggio TSH VITROS = 0,974 x X + 0,252 (miu/l), con coefficiente di correlazione di 0, Pubb. n. GEM1001_IT Versione 2.0
5 ISTRUZIONI PER L USO Bibliografia TSH Precisione La precisione è stata valutata secondo il protocollo EP5-T2 12 del National Committee for Clinical Laboratory Standards. Sono stati analizzati due replicati, ognuno dei quali costituito da 3 campioni di siero di controllo liofilizzato in due diverse sedute giornaliere per 20 giorni. L esperimento è stato ripetuto con due lotti di reagenti su sistemi diversi. I dati risultanti sono rappresentativi delle prestazioni del prodotto. Tabella 1: Precisione Concentrazione Giornaliera Intracalibrazione Intralaboratorio tipica miu/l DS* CV(%)* DS* CV(%)* DS* CV(%)* 0,167 0, ,5 0,0110 6,7 0,0132 8,0 2,20 0,0273 1,2 0,0775 3,5 0,0886 4,1 39,0 0,505 1,3 1,76 4,7 1,78 4,6 * Quadratica media Giornaliera: Precisione fra un duplicato e l altro, con media ottenuta su tutte le sedute. Intracalibrazione: Precisione totale, con componenti ponderati di variabilità intra-seduta, fra più sedute e da giorno a giorno. Intralaboratorio: Misura dell effetto della ricalibrazione sulla precisione totale, calcolata nell ambito di un singolo lotto di reagenti, utilizzando dati di 4 calibrazioni. Sensibilità La sensibilità analitica viene definita come la concentrazione pari a 2 deviazioni standard rispetto alla media di un campione che non contiene analiti, sul quale vengono determinati 20 replicati. Tipicamente, la sensibilità del dosaggio TSH VITROS è 0,003 miu/l. La sensibilità funzionale viene definita come la concentrazione che corrisponde al 20% del coefficiente di variazione interdosaggi sul profilo dose-precisione 13. La sensibilità funzionale del dosaggio TSH VITROS è stata calcolata mediante una singola calibrazione in un intervallo di 28 giorni. Usando una matrice di siero umano, la sensibilità funzionale è tipicamente di 0,015 miu/l. Specificità I potenziali cross-reagenti sottoindicati hanno provocato interferenze inferiori a 10% nel dosaggio TSH VITROS (le concentrazioni effettive analizzate sono indicate fra parentesi): hcg ( IU/L), FSH (1 000 IU/L), LH (1 000 IU/L). Bibliografia 1. Evered D.: Diseases of the Thyroid Gland. Clinics in Endocrinology and Metabolism 3: (1974). 2. Evered DC et al.: Grades of hypothyroidism. British Medical Journal 1: (1973). 3. Caldwell G et al.: A new strategy for thyroid function testing. Lancet 1: (1985). 4. Kerr DJ & Alexander WD.: Is the TRH test usually unnecessary? Lancet 2: (1984). 5. Spencer CA.: Thyroid profiling for the 1990 s: free T4 estimate or sensitive TSH measurement. Journal Clinical Immunology 12: (1989). 6. Nicoloff JT & Spencer CA.: The use and misuse of the sensitive thyrotropin assays. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 71: (1990). 7. Summers M et al.: Luminogenic Reagent Using 3-Chloro 4-Hydroxy Acetanilide to Enhance Peroxidase/Luminol Chemiluminescence. Clinical Chemistry 41. S73 (1995). 8. NCCLS. Protection of laboratory Workers from Instrument biohazards and Infectious Diseases Transmitted by Blood, Body Fluids and tissue; Approved guideline. NCCLS Document M29-A (ISBN ). NCCLS, Wayne, PA 19087; Calam RR.: Specimen Processing Separator Gels: An Update. J Clin Immunoassay 11: (1988). 10. Levinson SS.: The Nature of Heterophillic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J Clin Immunoassay 15: (1992). 11. Keefer JH. Preanalytical considerations in testing thyroid function. Clinical Chemistry 42: (1996). 12. Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices - Second Edition. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Order Code EP5-T2. (1992). 13. Spencer CA et al. Clin Chem 41: (1995). Versione 2.0 Pubb. n. GEM1001_IT 5
6 TSH ISTRUZIONI PER L USO Glossario dei simboli Glossario dei simboli 6 Pubb. n. GEM1001_IT Versione 2.0
7 ISTRUZIONI PER L USO Revisioni TSH Revisioni Data revisione Versione Modifiche tecniche apportate* Nuovo formato, tecnicamente equivalente a PIGEM1001/101.0 con le seguenti variazioni minori: Sezione Simboli usati sostituita dalla tabella Glossario dei simboli Aggiunta la casella per la firma della sezione Revisioni * Le barre delle modifiche indicano la posizione del testo aggiornato rispetto alla versione precedente del documento. Quando le presenti Istruzioni per l uso saranno sostituite da quelle aggiornate, apporre la propria firma e la data e conservare in base alle direttive locali o ai regolamenti del laboratorio. Firma Data Versione 2.0 Pubb. n. GEM1001_IT 7
8 TSH ISTRUZIONI PER L USO Condizioni di fornitura: tutte le forniture sono soggette ai termini e alle condizioni di vendita della ditta Ortho-Clinical Diagnostics e dei suoi distributori. Copie di tali condizioni saranno disponibili su richiesta. Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson Holmers Farm Way High Wycombe Buckinghamshire HP12 4DP United Kingdom VITROS è un marchio di Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Pubb. n. GEM1001_IT Versione 2.0
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