Recenti acquisizioni nel campo del miglioramento genetico della qualità nutraceutica del latte ovino.

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1 Recenti acquisizioni nel campo del miglioramento genetico della qualità nutraceutica del latte ovino. Antonello Carta, Sara Casu, S. Miari, T. Sechi, M.G. Usai, S. Salaris, S. Sechi, M.Addis, M. Colombino, G. B. Congiu, L. Crasta, M.Fiori, G. Mulas, A. Pernisa, S.Spada Settore Dipartimento per la Ricerca nelle Produzioni Animali

2 Ovini: nuove esigenze Consumatori: prodotti biologici e salubri Produttori: riduzione dei costi di produzione o Resistenza alle malattie o Mastiti sub-cliniche (CCS) o Nematodi e altri parassiti o Paratubercolosi o Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili oattitudine alla mungitura meccanica e longevità funzionale o Morfologia mammaria o Cinetica mungitura ovalore nutrizionale del latte o Profilo acidico del latte

3 Introduzione Perche ci siamo concentrati sul grasso del latte? o Il grasso caratterizza nel bene e nel male le produzioni casearie ovine conferendogli il tipico gusto e aroma ma anche un immagine di prodotto anti dietetico e dannoso per la salute o Migliorare la qualità nutrizionale del grasso del latte ovino può contribuire a caratterizzare positivamente le nostre produzioni

4 Introduzione E nota l azione positiva del pascolo e del nostro sistema di allevamento tradizionale Che ruolo può giocare la genetica?

5 Perché verificare la possibilità di un approccio genetico? Effetto genetico = ¼ effetto management

6 Approccio classico (modello genetico infinitesimale) AGRIS Sardegna o Caratteri quantitativi (variabilità continua; genotipo + ambiente) o Variabilità genetica: poligenica additiva o Numero elevato di geni diffusi in tutto il genoma, ciascuno con effetto infinitesimale

7 Necessità o Misure dei fenotipi di interesse su un gran numero di animali o Registrazione parentele o Altre informazioni (allevamento, età etc)

8 Non partiamo da zero Libro genealogico 8% della popolazione totale Controlli funzionali Fecondazione artificiale (FA) Monta naturale controllata (MN) Valutazione genetica Centro Arieti Arieti elite Madri ariete 600 giovani arieti 240,000 capi; 1,000 allevamenti 25 adulti testati 60 giovani in prova Diffusione progresso genetico attraverso arieti in monta naturale 3,600,000 capi; 13,000 allevamenti Un parto all anno in contro-stagione Popolazione commerciale Parti adulte tra Ottobre e Dicembre Parti primipare tra Febbraio e Marzo Agnelli macellati a 30 giorni età Latte trasformato in formaggi DOP (Pecorino Romano, Pecorino Sardo e Fiore Sardo)

9 Però..... Processo cieco : nessuna conoscenza geni, alleli, frequenze, effetti e localizzazione Numero elevato di misure individuali Numero elevato di misure individuali (costo prelievo e analisi gas-cromatografica)

10 Applicabilità approccio classico: medie e variabilità AG (n=1454) (mg/g of milk fat) C4:0 C6:0 C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C14:1 cis9 C15:0 C16:0 C16:1 cis9 C17:0 C18:0 C18:1trans11 C18:1 cis9 C18:2 cis9 cis12 C18:3 cis9 cis12 cis15 CLA cis9 trans11 Media 36,37 23,73 19,22 92,19 44,62 95,74 1,76 10,28 181,02 6,22 5,10 85,30 23,79 169,24 17,09 9,60 12,60 SD 3,32 3,43 4,77 19,97 10,84 9,32 0,46 0,98 16,85 1,42 1,26 12,89 6,14 44,49 3,43 1,75 3,51 MIN 26,22 13,00 7,11 35,82 20,58 57,79 0,67 5,09 129,97 3,22 2,78 30,69 10,75 76,41 4,95 4,82 4,50 MAX 47,32 32,94 32,42 139,85 84,65 129,70 4,54 14,03 259,11 11,36 9,46 130,89 47,25 305,30 29,86 17,62 25,74

11 Applicabilità approccio classico: relazioni Segno Classe Positive Negative Totale < (15.3) 71 (18.8) 129 (34.1) (9.3) 35 (9.3) 70 (18.5) (13.0) 56 (14.8) 105 (27.8) > (10.6) 34 (9.0) 74 (19.6) Total 182 (48.1) 196 (51.9) 378 (100)

12 Applicabilità approccio classico : variabilità individuale Repeatibility R2 statistic % C4 C6 C8 C10 C12 C14 C14:1 C15 C16 C16:1 C17 C18 C18:1t C18:1 C18:2 C18:3 CLA SCFA MCFA LCFA SFA UFA MUFA PUFA Variable CLA/C18:1t C14:1/C14 C16:1/C16 C18:1/C18

13 Prospettive approccio classico o Messa a punto di un protocollo di prelievo dei campioni latte nel LG o Messa a punto con i laboratori delle Associazioni Allevatori di protocolli analitici semplificati (infrarossi, laser?)

14 C è un altra strada. o Costo del prelievo campioni (personale) o Apporto pubblico alla selezione o Costi delle applicazione della genetica molecolare (DNA - chip technology-basso costo unitario per informazione) Può la genomica aiutare a superare i limiti descritti?

15 Obbiettivi Identificazione geni e polimorfismi In pratica approccio Scrapie

16 Polimorfismi identificati nel gene PrnP ovino UTR 3 UTR codoni A/V A R/H R Q/R/H R RESISTENTE 2 A R H 3 A R Q 4 A H Q 5 V R Q SENSIBILE

17 GAS negli ovini: la resistenza alla Scrapie Prima applicazione della selezione molecolare (GAS) negli ovini: la resistenza alla Scrapie o Approccio gene candidato: locus PrnP o Identificazione del polimorfismo al locus PrnP che modula la suscettibilità/resistenza alla malattia o Tecniche molecolari high throughput per l analisi dei genotipi o Nessuna misurazione fenotipica o Facilità della verifica di effetti pleiotropici su altri caratteri

18 Insegnamenti dalla selezione per la resistenza alla Scrapie Aspetti pratici o o o o o Organizzazione della raccolta di campioni biologici (sangue e bulbi piliferi) e dell identificazione degli animali Creazione di una banca del DNA (bulbi piliferi nella razza Sarda) Educazione degli allevatori all impiego dei risultati della genetica molecolare e alla gestione di piani di accoppiamento Modellizzazione della selezione simultanea per caratteri quantitativi e caratteri influenzati da un solo gene Collaborazione fra istituzioni sanitarie (aziende sanitari e istituti zooprofilatici) e associazione degli allevatori

19 Approccio sperimentale: Genome Scan Consente di identificare ampie regioni genomiche (QTL) dove sono contenuti i geni di interesse Necessaria la disponibilità di mappe genetiche basate su marcatori anonimi (microsatelliti, SNP)

20 QTL detection: Acidi Grassi Soglie di significatività a livello del cromosoma FA < TOT 1 2 C4:0 0 C6:0 4 b -6 c C8:0 2 a -4 b C10: b 12 5 C12: b 4 C14:0 11 C14:1 cis9 2b-3 a -6 a -7 b a 7 C15: a 3 C16:0 6 b 11 C16:1 cis9 7 b a 3 C17: C18:0 22 a 1 C18:1 trans11 7 a 1 C18:1 cis9 3 b -13 b c 4 C18:2 cis9 cis a 2 C18:3 cis9 cis12 cis15 6 c a CLA cis9 trans11

21 QTL detection: Acidi Grassi Chromosome threshold FA < TOT SCFA 6 c b MCFA 1 1 LCFA 19 6 c 2 SFA c 4 UFA 17 6 c MUFA 13 b 19 6 c 3 PUFA 4 a 19 2 CLA/C18:1 trans11 4 a -22 a 2 C14:1 cis9 /C14:0 2 b -3 c -6 b -7 b -13 a a 7 C16:1 cis9 /C16: a 3 C18:1 cis9 /C18:0 3 b -22 a 2

22 QTL detection: Rapporto CLA/Acido Vaccenico AGRIS Sardegna Variabile CLA/VACC OAR LT(cM) LTA(cM) NM INF 73 BMS0651 BMS4505 BMS882 McM LRT Soglia Map position (cm)

23 QTL detection: Rapporto CLA/Acido Vaccenico Variabile CLA/VACC BMS BMS907 OAR LT(cM) LTA(cM) NM HEL11 INF 73 INRA81 BMS332 BMS882 MAF36 McM373 BMS4505 TGLA429 Soglia 0,01 LRT Soglia 1 Map position (cm)

24 Origine del CLA nel latte dei ruminanti Rumine Tessuto mammario cis-9, cis -12 C 18:2 (acido linoleico) trans-10, cis-12 C 18:2 (trans-10 CLA) cis-9, trans-11 C 18:2 (acido rumenico) cis-9, trans-11 C 18:2 (acido rumenico) trans-10 C 18:1 (acido octadecenoico) trans-11 C 18:1 (acido vaccenico) trans-11 C 18:1 (acido vaccenico) C 18:0 (acido stearico)

25 QTL detection: Rapporto CLA/Acido Vaccenico Variabile CLA/VACC BMS BMS907 OAR LT(cM) LTA(cM) NM HEL11 INF 73 INRA81 SCD BMS332 BMS882 MAF36 McM373 BMS4505 TGLA429 Soglia 0,01 LRT Soglia 1 Map position (cm)

26 Polimorfismi identificati nel gene SCD ovino Nel nostro laboratorio 1627 C>A 8641 A>C C>T In bibliografia 5262 A>G 5809 T>C 8641 A>C 1627 C>A 2831G>A 7636 G>A 8685 G>T 204 G>A 2648 G>A C>T

27 Polimorfismi identificati nel gene SCD ovino: risultati o Il polimorfismo in posizione C>T è stato rilevato nel padre risultato più significativo alla QTL detection o Successive analisi hanno confermato una stretta associazione tra lo SNP identificato e il rapporto tra CLA e acido vaccenico o Lo SNP è localizzato in una porzione non codificante per cui la conclusione più probabile è che la mutazione trovata sia in stretto linkage con la mutazione causale

28 QTL detection: Risultati sul Cromosoma 11 HEL10 IDVGA46 BM17132 MAP2C MCM120 ETH FASN LRT chromosome-wise threshold Cromosoma Ovino 11 (cm) LRT C14:0 LRT C16:0

29 Polimorfismi identificati nel gene FASN ovino 5380 A>G 5518 T>G 5521 G>A 5549 C>T Exon 3 Exon G>A C>T G>A T>C Exon 12 Exon 13 Exon 15 Exon C>A G>C G>A C>T Exon 38 Exon 42 3 UTR

30 Polimorfismi identificati nel gene FASN ovino 7358 G>C 7363 G>A Exon 42 G>C G>A Pathernal Chr Mathernal Chr CAAGATGGGCGGTGCCTA CAAGATGGCCGGTACCTA C>T 3 UTR C>T Pathernal Chr Mathernal Chr CTGTGAGGCCGGCGCACGCG CTGTGAGGCTGGCGCACGCG

31 Nuove Prospettive Incrementare in misura considerevole i risultati fin qui ottenuti attraverso l utilizzo di un innovativo strumento molecolare

32 Nuove Prospettive: The OvineSNP50 BeadChip Risultato della collaborazione tra Illumina e AgResearch, Baylor UCSC, CSIRO e USDA International Sheep Genomics Consortium AGRIS ha partecipato al consorzio e ha ottenuto i primi 672 chip a un prezzo concordato precommerciale Tipizzazione contemporanea di polimorfismi di un singolo nucleotide (SNPs( SNPs) per 12 campioni alla volta.

33 Popolazione sperimentale Az. Monastir arieti lacaune 184 pecore sarde ML AL ML AL X 1997 MS AS MS AS 10 arieti F pecore sarde 1998 ML AL MS AS X MS AS MS AS n=968 Pecore BC ML MS AL AS X 18 arieti sardi MS MS AS AS X Pecore BC MS MS AS AS Famiglie di arieti incrociati per genome scan (628 analizzati con DNAchip) n=800 Figlie delle BC ML MS AL AS 17 arieti sardi MS MS AS AS Figlie delle BC MS MS AS AS Famiglie di arieti sardi per genome scan

34 Popolazione sperimentale Az. Monastir: arieti sardi MS MS X MS MX AS AS AS AX n=787 ML AL MS AS MS AS X Nipoti delle BC MS MS AS AS arieti sardi/ anno MS MS MS AS X MS AS MS AS Famiglie di arieti sardi per genome scan Entro il 2010 le prime 3 generazioni saranno analizzate con DNAchip AS AS n=230/year MX AX MX AX MX AX MX AX MX AX MX AX MX AX MX AX arieti sardi FA 2010 n=300 MX AX MX AX X MX AX MS AS MX AX MX AX MS AS MX AX X MX AX MX AX 26 arieti sardi FA per la valutazione genetica e la conferma di geni

35 Prospettive o DNA - Chip su tutta la popolazione sperimentale o Fine sequenziamento geni candidati o Valutazione genetica quantitativa per arieti FA in azienda sperimentale Monastir

36 Finanziamenti o Identificazione di QTL o geni implicati nel determinismo genetico dei caratteri di produzione, qualità e sicurezza alimentare nella popolazione ovina sarda (APQ P5a, RAS-CRP, ) o Ricerca di QTL per il tenore in grasso e proteina nel latte ovino e valutazione del potenziale impatto della selezione assistita da marcatori nella razza ovina Sarda (Selmol, MIPAF, ) o Sustainable Solutions for Small Ruminants (3SR, 7PQ-UE, )

37 Collaborazioni o Porto Conte Ricerche o Assonapa

38 Conclusioni In futuro, sia l approccio quantitativo classico che quello basato sulle informazioni genomiche saranno opzioni realistiche per il miglioramento genetico del profilo acidico del grasso del latte La strategia da adottare prevede lo sviluppo sia di metodiche high-throughput per la determinazione del contenuto in AG che delle tecniche di genetica molecolare Particulare attenzione dovrebbe essere posta sulle relazioni genetiche tra i diversi AG.

39 Conclusioni La disponibilità delle nuove tecnologie di genetica molecolare non deve tuttavia indurre a ritenere che gli schemi attualmente in atto possano essere smantellati o in qualche misura ridimensionati. L esperienza della selezione per la resistenza alla Scrapie ha infatti dimostrato come la struttura selettiva costruita per il miglioramento dei caratteri produttivi costituisca ancora il pilastro fondamentale per l applicazione delle nuove conoscenze genomiche.