IL MIGLIORAMENTO GENETICO ANIMALE E LA GENETICA MOLECOLARE

Transcript

1 IL MIGLIORAMENTO GENETICO ANIMALE E LA GENETICA MOLECOLARE

2 Il miglioramento genetico delle produzioni animali, realizzato sino ad ora, è frutto dell elaborazione elaborazione e applicazioni della teoria della genetica quantitativa alle popolazioni animali di interesse zootecnico. Schemi operativi di selezione basati sui L.G. e controlli funzionali Diffusione I.S. Modelli statistici sofisticati

3 1900: con la riscoperta delle Leggi di Mendel si inizia a comprendere la natura genetica della trasmissione dei caratteri 1900: Galton introduce il procedimento statistico per lo studio dell eredit eredità dei caratteri quantitativi 1918: Fisher attua il collegamento tra la genetica mendeliana e l approccio l statistico della scuola biometrica ponendo le basi della moderna teoria della genetica quantitativa

4 LA TEORIA DELLA GENETICA QUANTITATIVA I caratteri quantitativi sono ad eredità poligenica e la variazione continua è dovuta all azione azione degli alleli di numerosi loci distribuiti nel genoma degli animali e agli effetti dei fattori ambientali. I singoli geni e alleli esercitano su questi caratteri effetti molto piccoli e di tipo additivo. NON è possibile conoscere il GENOTIPO direttamente dal FENOTIPO. Modelli matematico-statistici per stima valore genetico dei riproduttori.

5 Nell allevamento animale il miglioramento genetico è attuato con: selezione: : sfrutta la variabilità genetica additiva e consente di ottenere un miglioramento cumulativo permanente e trasmissibile. Miglioramento razze animali. incrocio: : utilizza la variabilità non additiva che sta alla base dell eterosi eterosi e non è trasmissibile. Migliora le produzioni.

6 La selezione fenotipica è efficace per caratteri produttivi: - si manifestano precocemente - facilmente misurabili - si esprimono in entrambi i sessi - non sono troppo influenzati da fattori ambientali In tal caso: - elevata intensità di selezione - buona accuratezza stima valore genetico degli animali - brevi intervalli di generazione quindi rapido progresso genetico.

7 Pochi i caratteri produttivi con tali caratteristiche. Frequenti i caratteri che: - si esprimono in un solo sesso (uova, latte) - si evidenziano tardi (problemi articolari) - si evidenziano dopo macellazione (spessore lardo, tagli magri, qualità della carne) - sono difficili da misurare (resistenza alle malattie, indice di conversione alimentare) - sono particolarmente influenzati da fattori ambientali (fertilità e resistenza alle malattie) - ereditabilità molto bassa

8 La GENETICA MOLECOLARE supera questi problemi perché fornisce gli strumenti per analizzare la variabilità direttamente a livello del DNA. genetica quantitativa A tal fine è necessario trovare marcatori del DNA che siano associati a geni che codificano caratteri di interesse selettivo.

9 I MARCATORI GENETICI m1 m2 m1 m2 m3 m3 Sono porzioni di DNA: non codificanti distribuiti uniformemente sul genoma ad eredità mendeliana semplice

10 TIPI di MARCATORI GENETICI..rilevabili a vari livelli MORFOLOGICO o SOMATICO: colore del mantello BIOCHIMICO: gruppi sanguigni proteine (del plasma, del latte etc.) DNA: SNP, RFLP, AFLP, RAPD, microsatelliti,

11 MARCATORI BIOCHIMICI E IMMUNOLOGICI 1961: Neimann-Sorensen e Robertson studiarono l associazione tra gruppi sanguigni e diversi caratteri produttivi nei bovini da latte. Questi studi non ebbero molto successo per il limitato numero di marcatori disponibili e per l utilizzo di popolazioni animali senza un appropriato disegno sperimentale.

12 I MARCATORI del DNA Caratteristiche favorevoli Non influenzati dall ambiente ambiente Neutrali Stabili Numerosi Polimorfici (sequenze non codificanti) Campioni di qualsiasi tessuto Analisi indipendenti da sesso ed età Facili da monitorare Analisi automatizzabili

13 RFLP (Restriction Fragment Length Ploymorphism) Sono stati i primi marcatori ad essere utilizzati (1978). Molto frequenti e distribuiti su tutto il genoma animale erano ideali per costruire mappe gentiche ed identificare loci responsabili della variabilità genetica quantitativa ( (Quantitative Trait Loci QTL). Non hanno trovato larga applicazione perché il metodo di identificazione (Southerm( Blotting) è lungo e laborioso e perché,, in genere, presentano solo due alleli.

14 VNTR o Minisatelliti (Variable Variable Number of Tandem Repeats) Identificati nel 1987, presentano un alto numero di alleli, però presentano le stesse difficoltà di individuazione degli RFLP. Insieme agli RFLP sono stati utilizzati nelle prime fasi di costruzione delle mappe genetiche.

15 SSR o MICROSATELLITI (SimpleSimple Sequence Repeats ) Ripetizioni in tandem di corte (1-5) sequenze di nucleotidi: (AC) n o (GT) n o (CAC) n o (GATA) n di- di- tri- tetra- nucleotidi distribuite nel genoma animale in numero elevatissimo in regioni anonime (non hanno funzione nota). Il polimorfismo è molto elevato e deriva dal numero di ripetizioni (n) del motivo di base del microsatellite. Sono conservati entro specie e risultano essere specie-specifici.

16 Microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeats)

17 Visualizzazione microsatelliti 1) ESTRAZIONE DEL DNA Sangue Peli Seme DNA 2) PCR POLYMERASE CHAIN REACTION Individuo A Individuo B Individuo C campione di controllo 3 paia di cromosomi omologhi 3) ELETTROFORESI

18 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA ) identificano marcatori per mezzo di corti oligonucleotidi come inneschi nella PCR. Sono marcatori dominanti, a differenza degli RFLP e dei microsatelliti che sono in genere codominanti,, e non presentano un altissima riproducibilità perché influenzati dalle ondizioni di analisi. ALTRI MARCATORI GENETICI

19 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphics ) combinano l analisi l di restrizione con la PCR e permettono, utilizzando diverse combinazioni di enzimi e primers, di analizzare contemporaneamente un elevato numero di loci.

20 SNP (Single Single Nucleotide Polymorphisms) Variazioni di singole basi GAT CAG TTC GAT GTC GAT CAG TTA GAT GTC Frequenza elevata (polimorfismi da mutazioni puntiformi una ogni nucleotidi) Distribuiti in modo casuale

21 APPLICAZIONI DEI MARCATORI NEL SETTORE ZOOTECNICO Costruzione di mappe genetiche e fisiche Mappatura ed isolamento di geni utili Mappatura di QTL Diagnosi di anomalie genetiche Analisi di paternità Studi su filogenesi, variabilità genetica, struttura e dinamica di specie e popolazioni Stima della consanguineità e ausilio ai piani di accoppiamento Tracciabilità dei prodotti

22 MAPPE GENETICHE Il genoma degli animali è costituito da un diverso numero di paia di autosomi e da un paio di cromosomi sessuali con un contenuto di DNA di circa 3 miliardi di nucleotidi nei mammiferi e 1,2 miliardi per le specie avicole. Il DNA codifica per circa geni, i quali rappresentano solo il 4% del DNA contenuto nel genoma. Quindi i geni sono dispersi in regioni del DNA che non hanno funzione codificante.

23 Numero di cromosomi e contenuto in DNA stimato per alcune specie di interesse zootecnico SPECIE N. Cromosomi 2n Dimensione stimata del genoma in nucleotidi (paia di basi) Bovino Suino Pecora Capra Cavallo Coniglio Pollo Tacchino

24 Durante la meiosi si verifica lo scambio di materiale genetico fra cromosomi omologhi. Se due marcatori sono lontani è più probabile che un evento di scambio li separi. Se sono vicini è più facile che rimangano assieme. Andando a rilevare quante volte, dopo la meiosi, si ha o meno separazione dei due marcatori si può stimare la loro distanza reciproca e quindi costruire una mappa.

25 Esempio di mappa di linkage Si può quindi definire un unit unità di mappa 1% di ricombinazione genica=distanza di 1 centimorgan (cm).

26 BOVMAP (Progetto per la mappatura del genoma bovino) 1) Vi partecipano 32 gruppi europei finanziati dalla UE 2) Obiettivo: definire una mappa di marcatori genetici specifici per il bovino (utilizza tutti i tipi di marcatori) 3) Scopo della mappa è studiare l associazione tra marcatori e caratteri QTL e/o ETL

27 BOVMAP (INRA) (Progetto per la mappatura del genoma bovino) Loci: 4357 Loci mappati: : 4122 Geni: 1557 Geni mappati: : 1506 Microsatelliti: 2402 Microsatelliti mappati: : 2241 QTLs: : 46

28 HORSEMAP (INRA) (Progetto per la mappatura del genoma equino) Loci: 2409 Loci mappati: : 2134 Geni: 771 Geni mappati: : 752 Microsatelliti: 1521 Microsatelliti mappati: : 1269

29 SHEEPMAP (Progetto per la mappatura del genoma ovino) Loci: 2030 Geni: 543 Microsatelliti: 2257 PIGMAP (Progetto per la mappatura del genoma suino) Loci: 4081 Geni: 1588 Microsatelliti: 1673

30 PERCHÉ È IMPORTANTE MAPPARE IL GENOMA? 1) Studio dell organizzazione, regolazione ed espressione dell insieme di geni nel genoma. 2) Selezione assistita da marcatori (Marker( Assisted Selection - MAS): identificazione dell associazione tra marcatori e QTL /o ETL (Economic efficiente Trait Loci) ) per una selezione più 3) Clonaggio di posizione: identificare e clonare un gene responsabile per un ETL.

31 MAS (Marker Assisted Selection) I marcatori genetici possono essere usati per ricercare associazioni con i singoli loci che contribuiscono ai caratteri quantitativi di importanza economica (QTL e ETL.) L individuazione di associazione di questo tipo permette di frazionare un carattere quantitativo a variazione continua in un certo numero di loci mendeliani a variazione discontinua, chiaramente identificabili, e di attuare una selezione assistita da marcatori.

32 Infatti se un allele di un locus ad effetto quantitativo e un marcatore sono geneticamente associati, saranno trasmessi dai genitori ai figli in modo congiunto. Pertanto utilizzando gli alleli dei marcatori per il carattere in selezione si potranno scegliere gli animali portatori delle varianti più favorevoli. La MAS può influire favorevolmente su tutti i fattori che determinano il progresso genetico (accuratezza della selezione, intensità della selezione e intervallo di generazione).

33 La MAS può aumentare l efficacia l della seleziona attuata solo sulla base delle performance, soprattutto per caratteristiche che si esprimono in un solo sesso (produzione latte, numero di nati) o difficilmente misurabili su animali vivi (caratteristiche della carcassa e della carne). Esempio di MAS: gene Alotano nei suini è responsabile della sindrome da stress (PSS) e del difetto PSE. Si è scoperto la causa è una mutazione del gene CRC (Calcium( Release Channel).

34 La risposta alla selezione effettuata con i microsatelliti è più elevata nelle prime generazioni di selezione.. A seguito dell aumento delle frequenze alleliche fino alla fissazione degli alleli favorevoli del QTL, la varianza genetica residua della popolazione diminuisce e con questa la possibilità di risposta nel lungo periodo. L impiego della MAS comporta un guadagno di tempo, arrivando prima alla fissazione del QTL nella popolazione. La riduzione della risposta alla MAS nel lungo periodo non si ha se è applicata nelle fasi o in gruppi di animali in cui non si applica selezione fenotipica (es. preselezione tori destinati al progeny test).

35 ANALISI PATERNITÀ CON MICROSATELLITI In corrispondenza di ogni marcatore, con 4 alleli per locus, la probabilità che due individui abbiano la stessa combinazione di alleli nel medesimo locus sarà del 12,5% Se e aumentiamo il numero dei marcatori la probabilità che due individui presentino la stessa combinazione di alleli per tutti i loci diventa piccolissima. Numero loci (marcatori) Probabilità di matching (stesso profilo) % % 0.19 % % % %

36 DNA fingerprinting Utilizzando contemporanemente più marcatori si ottengono profili allelici in grado di identificare in modo univoco gli individui impronte digitali del DNA

37 Due alleli del microsatellite PADRE GENOTIPO: 263/263 PADRE GENOTIPO: 128/ GENOTIPO: 128/146 GENOTIPO: 263/277 MADRE MADRE FIGLIO GENOTIPO: 128/128 FIGLIO GENOTIPO: 263/ FIGLIO GENOTIPO: 124/128 GENOTIPO: 263/ FIGLIO FIGLIO GENOTIPO: 128/ DIAGNOSI POSITIVA DIAGNOSI NEGATIVA