LA FECONDAZIONE Si attua in 4 fasi: 1) Avvicinamento dei gameti 2) Penetrazione delle barriere dell uovo 3) Reazioni dell uovo 4) Unione dei cromosomi

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1 LA Si attua in 4 fasi: 1) Avvicinamento dei gameti 2) Penetrazione delle barriere dell uovo 3) Reazioni dell uovo 4) Unione dei cromosomi

2 Trasporto nelle vie spermatiche Le vie spermatiche sono i canali che vanno dai tubuli seminiferi all uretra Maturazione degli spermatozoi nell epididimo (è un canale lungo circa 7 metri) gli spermatozoi vi risiedono per circa 1-2 settimane e 1. acquistano la capacità di muoversi e di fecondare l uovo. 2. sono ricoperti da glicoproteine protettive. 3. Il fluido tubulare (prodotto soprattutto dalle cellule del Sertoli) e gli spermatozoi, che passano da 50 mln/ml a 5 mld/ml) ne escono concentrati circa 100 volte. 4. La composizione del fluido seminale è determinata dalle vescichette seminali (per il 60%), dalla prostata (30%) e dalle ghiandole bulbo-uretrali o di Cowper. In un campione di seme umano di 2-4 ml sono contenuti dai 200 ai 400 mln di spermatozoi (conc. minima=15 mln/ml) vitali per il % vescica dotto eiaculatorio uretra epididimo pene vescichetta seminale prostata dotto deferente testicolo

3 Vie genitali maschili e ghiandole accessorie LA

4 LA LA Epitelio pseudostratificato con stereociglia (epididimo di ratto). Ematossilina-Eosina.

5 Epididimo 3 funzioni principali Maturazione degli spermatozoi (2-12 gg) Conservazione degli spermatozoi fino alla eiacualzione Trasporto peristaltico lungo il canale dell epididimo

6 Trasporto nelle vie genitali femminili LA Diagramma dell apparato genitale femminile e del percorso che gli spermatozoi devono compiere per raggiungere l ovocita (30-40 cm)

7 LA Fotografia di spermatozoi che stanno uscendo dal coagulo formato nella vagina. Gli enzimi coagulanti sono prodotti nella prostata e reagiscono al ph acido vaginale con substrati prodotti nelle vescichette seminali, tra cui la seminogelina1. Questa glicoproteina è presente solo nell uomo e nei primati più evoluti e sembra avere anche altre funzioni sul liquido seminale.

8 LA Dopo min il coagulo si fluidifica ad opera del PSA, antigene prostatico-specifico, una proteasi secreta dalla prostata come proenzima inattivo. La PSA è una glicoproteina specifica delle sole cellule epiteliali della prostata dove assume il ruolo di marker nel cancro prostatico.

9 Trasporto nelle vie genitali femminili LA FECON DAZION Dalla vagina al collo dell utero (cervice uterina): solo l 1% degli spermatozoi sopravvive; Una volta superato l ostacolo, essi risalgono l utero e si dirigono preferenzialmente nella tuba che contiene l ovocita. La propulsione è data dal flagello e dalle correnti ciliari dell ovidutto. E

10 Trasporto nelle vie femminili Spermatozoi prelevati dal liquido seminale non sono capaci di fecondare. Probabilmente nell epididimo, gli spermatozoi sono ricoperti da glicoproteine protettive che mascherano gli antigeni di superficie della membrana plasmatica impedendo l agglutinazione, la reazione acrosomiale prematura e la spermofagia ma anche la fecondazione. CAPACIT Tale rivestimento scompare progressivamente solo se lo spermatozoo passa nelle vie genitali femminili (cervice uterina, utero ed ovidotti) o in soluzioni saline (se trattato in vitro).

11 L attivazione degli spermatozoi Avviene in prossimità dell uovo e le cause sono ancora da chiarire. 1. Moti irregolari della coda dello spermatozoo che da ondulatori diventano a colpo di frusta. 2. La membrana plasmatica della testa dello spermatozoo espone recettori per la zona pellucida e diviene capace di fondersi con quella dell ovocito (si modifica la distribuzione di fosfolipidi e viene espressa la proteina fertilina) 3. L acrosoma si rigonfia ed avviene la reazione acrosomiale (vedi avanti)

12 Penetrazione dello spermatozoo nell uovo (circa min) Lo spermatozoo deve superare 3 barriere: 1. La corona radiata 2. La zona pellucida 3. La membrana vitellina LA

13 Penetrazione dello spermatozoo nell uovo (circa min) Lo spermatozoo deve superare 3 barriere: 1. La corona radiata 2. La zona pellucida 3. La membrana vitellina LA 1. Ialuronidasi + enzima di penetrazione della corona + movimenti del flagello;

14 Penetrazione dello spermatozoo nell uovo (circa min) Lo spermatozoo deve superare 3 barriere: 1. La corona radiata 2. La zona pellucida 3. La membrana vitellina LA 2. Attacco della membrana plasmatica della testa dello sp.zoo alla zona pellucida (ZP3 è il recettore) e reazione acrosomiale

15 Le fasi del legame e di adesione dello spermatozoo alla zona pellucida e all ovolemma ZP3 LA

16 Reazione acrosomiale LA LA proacrosina In vicinanza dell uovo e in presenza di Ca2+, L acrosoma si rigonfia e la sua membrana si fonde con quella plasmatica in vari punti. La reazione acrosomiale avviene con rottura della membrana ed espulsione degli enzimi liberi nello spazio circostante. Alcuni, come l acrosina, sono legati alla parete interna della m. acrosomiale che risulterà esposta in più punti all ambiente esterno

17 Penetrazione dello spermatozoo nell uovo (circa min) Lo spermatozoo deve superare 3 barriere: 1. La corona radiata 2. La zona pellucida 3. La membrana vitellina 3. Fusione tra le membrane plasmatiche dello spermatozoo e dell uovo. LA

18 LA Lo spermatozoo viene a contatto con l ovocito disponendosi tangenzialmente rispetto ad esso. La fusione interessa dapprima la regione equatoriale della testa dello spermatozoo (dove è ancora presente la sua membrana plasmatica) per poi spostarsi all indietro. La parte anteriore della testa, rivestita della sola membrana acrosomiale interna, viene invece fagocitata da estroflessioni citoplasmatiche dell ovocito. Si realizza così la fecondazione con l ingresso del nucleo maschile, del centriolo prossimale, dei mitocondri e di parte del flagello di cui solo i primi due componenti restano attivi e funzionali nello zigote (così si chiama l uovo fecondato).

19 LA Fotografia di spermatozoi umani attorno all ovocita

20 Fotografia al MES di uno spermatozoo che ha iniziato ad entrare nell uovo. LA LA

21 I mitocondri sono ereditati per linea materna Il genoma mitocondriale è indipendente da quello nucleare racchiuso nei cromosomi. Recentemente (2012) è stato sequenziato da Ernesto Picardi e Graziano Pesole, rispettivamente ricercatore e direttore dell'istituto di biomembrane e bioenergetica del Consiglio nazionale delle ricerche (Ibbe-Cnr) e docenti di Biologia molecolare del dipartimento di Bioscienze, biotecnologie e scienze farmacologiche dell'universita' di Bari. Il Dna mitocondriale dà un suo contributo nella patogenesi di molte malattie genetiche. Quello dei mitocondri costituisce circa il 2% del DNA cellulare e assolve funzioni di importanza vitale. Mutazioni del genoma mitocondriale sono responsabili di malattie gravissime che compromettono la funzionalita' del sistema muscolare e nervoso o che sono associate a processi di invecchiamento e tumorigenesi. Le malattie cosiddette mitocondriali, come la sindrome di Leigh, di Kearns-Sayre, di Pearson o diverse encefalopatie e neuropatie, hanno un'incidenza media di 1/4000, colpiscono soprattutto bambini e si distinguono per il fatto che, come il DNA mitocondriale, sono ereditate esclusivamente per via materna. Per approfondimenti:

22 Le reazioni dell uovo Dopo l entrata dello spermatozoo, l uovo fecondato (zigote) deve: Impedire l ingresso di altri spermatozoi (polispermia) con la reazione corticale (esocitosi del contenuto dei granuli corticali) e con la reazione della zona (modificazione dei recettori ZP2 e ZP3), eventi che si completano pochi minuti dopo la fecondazione Compiere la seconda divisione meiotica ed espellere il secondo globulo polare (entro circa 4 h dopo la fecondazione). Attivazione dell uovo: liberazione del Ca++ dai depositi citoplasmatici brusco aumento del metabolismo respiratorio preparazione alla prima mitosi formazione del fuso

23 LA Dopo la fusione si ha un ingresso di ioni Na+ che determina un cambiamento nella polarità della membrana (ne consegue il blocco rapido della polispermìa). La mobilizzazione di ioni Ca++ dopo la fecondazione induce la reazione corticale: i granuli corticali (prodotti durante la fase preovulatoria e contenenti enzimi digestivi) sono esocitati nello spazio perivitellino. Alla reazione corticale segue la reazione della zona, per cui nella zona pellucida si modificano i recettori ZP2 e ZP3

24 Granuli corticali (già prodotti in fase preovulatoria) Granuli corticali: sono rilasciati al momento della fecondazione e dopo mobilizzazione del Ca++ Contengono proteasi che modificano la conformazione di ZP2 e rimuovono carboidrati da ZP3 LA

25 Attivazione dell uovo LA Lo spermatozoo introduce una fosfolipasi specifica (plczeta) in grado di scatenare le oscillazioni della concentrazione del Ca++ nell uovo. (Saunders CM, Development, 2002)

26 LA La fecondazione avviene nella ampolla della tuba uterina entro ore dalla ovulazione.

27 L'enzima che blocca la polispermia Udx1 genera perossido di idrogeno e impedisce l'accesso agli spermatozoi Una cellula uovo (oocita) può essere circondata da innumerevoli spermatozoi contemporaneamente, eppure a uno soltanto è consentito di fecondarla. In effetti, un oocita deve subire una rapida e complessa serie di cambiamenti per impedire l'ingresso di più di uno spermatozoo, un fenomeno dannoso per il normale sviluppo chiamato polispermia. Uno studio pubblicato sul numero di dicembre 2004 della rivista " Developmental Cell" fornisce interessanti informazioni sulla scoperta di un enzima che consente a un oocita di bloccare fisicamente l'ingresso di ulteriori spermatozoi dopo la fecondazione. Impedire la polispermia nei ricci di mare e in molti altri animali richiede una drammatica trasformazione che comprende uno scatto respiratorio caratterizzato dalla massiccia produzione di perossido di idrogeno vicino alla superficie dell'uovo. Nonostante questo fenomeno fosse stato descritto già oltre 100 anni or sono, il meccanismo responsabile della generazione di perossido dopo la fecondazione non è ancora del tutto chiaro. Gary M. Wessel e colleghi della Brown University di Providence hanno scoperto nei ricci di mare un enzima, differente da quelli usati dai globuli bianchi del sangue, coinvolto specificatamente nella generazione di perossido di idrogeno al momento della fecondazione. L'enzima, chiamato Udx1 (urchin dual oxidase 1), agisce insieme ad altri componenti cellulari per produrre perossido che consente all'oocita di trasformare la sua parte esterna in una barriera contro altri spermatozoi. Julian Wong, Robbert Créton, Gary M. Wessel, The Oxidative Burst at Fertilization Is Dependent upon Activation of the Dual Oxidase Udx1. Developmental Cell, Vol. 7, No. 6 (dicembre 2004).

28 La metafase della 2^ divisione meiotica viene riattivata 2-3 ore dopo la fecondazione, per terminare 2-3 ore dopo. LA 1 2 I cromosomi dell uovo e dello spermatozoo sono liberi nel citoplasma e vengono circondati da due distinte membrane nucleari formando i pronuclei dello zigote. Questi, in ore, migrano verso il centro e duplicano i cromosomi Successivamente le membrane dei pronuclei si rompono ed i cromosomi si dispongono in piastra metafasica per la prima mitosi, completata in ore dopo la fecondazione. N.B. l ovocito manca di centrioli per cui il fuso mitotico sarà assemblato nello zigote solo dopo la duplicazione del centriolo portato dallo spermatozoo. 3 4

29 LA Con il trapianto dei pronuclei si dimostra la nonequivalenza dei genomi materno e paterno (imprinting genomico). Solo tessuti extraembrionali T. embrionali ma ridotti t. extraembrionali

30 Fecondazione in vitro (ICSI) LA LA

31 LA