Coltivazione dei batteri Fattori influenzanti la crescita Identificazione dei microrganismi. Giovanni Di Bonaventura B.Sc., Ph.D.

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1 Coltivazione dei batteri Fattori influenzanti la crescita Identificazione dei microrganismi Giovanni Di Bonaventura B.Sc., Ph.D.

2 Terreni di coltura Terreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo Caratteristiche: concentrazione adatta di sostanze nutritive per la crescita batterica adeguato grado di umidità reazione (ph) adatta sterili e protetti da qualsiasi inquinamento

3 Terreni di coltura Contenuto qualitativo (1 di 2) Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.) NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessità osmotiche richieste, in vivo, da alcuni microrganismi parassiti Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, sono aggiunti per scopi specifici in terreni particolari Estratti di lievito, carne, d organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici

4 Terreni di coltura Contenuto qualitativo (2 di 2) Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina vitamine. Necessari per la crescita di batteri più esigenti dal punto di vista nutrizionale Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide) Indicatori: le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.) permettono di seguire il metabolismo fermentativo del batterio in esame, determinando il viraggio di colore del terreno a valori critici di ph

5 Terreni di coltura Classificazione (1 di 3) In base allo stato fisico: Terreni LIQUIDI: componenti sciolti in acqua e sterilizzati. Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel)

6 Terreni di coltura Classificazione (2 di 3) In base alla costituzione chimica: Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantità note. Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantità note. Terreni COMPLESSI: ignota l esatta composizione chimica delle sostanze nutritive (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.). Comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio.

7 Terreni di coltura Classificazione (3 di 3) In base alla funzione: Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche. Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Utilizzati per l isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati. Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Usati per la ID di specifici microrganismi.

8 Terreni di coltura Tecniche di semina per isolamento

9 Semina per isolamento

10 Principali terreni di coltura usati in microbiologia diagnostica (1 di 3) Cetrimide Agar: Terreno selettivo per l isolamento e l identificazione presuntiva di Pseudomonas aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato per stimolare la produzione di pigmento. Cetrimide, verso cui P. aeruginosa è resistente, inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi. Columbia Blood Agar Base: Terreno di uso generale e base per terreni addizionati di sangue (S. aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram+, H. pylori, Gardnerella). Hektoen Enteric Agar: Terreno differenziale e selettivo per l isolamento di Salmonella e Shigella dalle altre Enterobacteriaceae in campioni enterici. I sali biliari inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza di tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio ferrico) per evidenziare la produzione di H 2 S (colonie nerastre, Salmonella)

11 Cetrimide Agar

12 Columbia Blood Agar Base

13 Hektoen Enteric Agar Salmonella: colonie lac- Klebsiella: colonie lac+

14 Principali terreni di coltura usati in microbiologia diagnostica (2 di 3) MacConkey agar: evidenziazione, isolamento e conta dei coliformi e degli Enterobatteri (E. coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella). La presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la crescita di Gram+. La presenza di lattosio evidenzia la capacità fermentante: le colonie fermentanti il lattosio (Klebsiella, E. coli, Enterobacter aerogenes) appariranno rosa acceso, incolori quelle non fermentanti (Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, P. aeruginosa). Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar: non selettivo, per la crescita e tests di sensibilità degli anaerobi. Urea broth base (terreno di Christensen): evidenziazione attività ureasica delle Enterobacteriaceae mediante viraggio di un indicatore di ph (rosso fenolo).

15 MacConkey agar A B A: colonie lac- di P. aeruginosa; B: colonie lac+ di E. coli

16 Urea broth base

17 Principali terreni di coltura usati in microbiologia diagnostica (3 di 3) Mannitol Salt Agar: Terreno selettivo per l isolamento di stafilococchi presunti patogeni. Azione selettiva dell elevata [NaCl]. S. aureus produce colonie con alone giallo-brillante; gli stafilococchi coagulasi-negativi formano colonie di colore rosso porpora. Mueller-Hinton agar: per la determinazione dei saggi di antibiotico-sensibilità. Saboraud Dextrose Agar: terreno acido indicato per l isolamento di diversi funghi e lieviti. Candida albicans (colonie incolori/rosa); Candida nonalbicans (colonie rosa scuro/rosse). Salmonella-Shigella Agar (Agar SS): terreno selettivo e differenziale per l isolamento di Salmonella e Shigella dalle feci e da campioni di altra natura.

18 Mannitol Salt Agar

19 Sabouraud Agar

20 Salmonella Shigella Agar (SS-agar) Salmonella typhimurium Salmonella dublin

21 Fattori influenzanti la crescita (1 di 6) Crescita vs Tolleranza Crescita generalmente indica l acquisizione di biomassa per la divisione cellulare (o riproduzione). Alcuni microrganismi possono sopravvivere a condizioni non permissive per la loro crescita. Il suffisso -fili viene spesso usato per descrivere le condizioni permissive per la crescita, mentre il termine tollerante descrive le condizioni in cui il microrganismo sopravvive, ma non necessariamente cresce. Ad esempio, un batterio termofilo cresce in presenza di elevate temperature, mentre un batterio termotollerante sopravvive ad elevate temperature, ma cresce a temperature inferiori.

22 Fattori influenzanti la crescita (2 di 6) Obbligato (stretto) vs facoltativo Obbligato (o stretto ) indica che una data condizione è necessaria per la crescita batterica. Facoltativo indica che il microrganismo può crescere in quella condizione, sebbene non necessaria. Il termine facoltativo viene spesso usato in presenza di condizioni sub-ottimali. Ad esempio, un termofilo obbligato necessita di elevate temperature per la sua crescita, mentre un termofilo facoltativo può crescere ad alte temperature ma anche a temperature più basse.

23 Fattori influenzanti la crescita (3 di 6) Temperatura La maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 20 C, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo optimum termico Psicrofili: ~0 20ºC Mesofili: ~10 50ºC Termofili: ~40 75 ºC Ipertermofili: ~ ºC

24 Fattori influenzanti la crescita Temperatura

25 Fattori influenzanti la crescita (4 di 6) ph Acidofili: crescono al di sotto di ph 6 (ph 2 6, generalmente) funghi e lieviti (ph 5-6) Neutrofili: crescono tra ph 6 8 maggior parte dei batteri Alcalofili: crescono a ph > 8 (ph 8 9.5, generalmente)

26 Fattori influenzanti la crescita (5 di 6) Concentrazione salina (pressione osmotica) Alofili: Crescono ad elevate concentrazioni saline (generalmente 1 M), sopportando elevate pressioni osmotiche; Stafilococchi

27 Ossigeno (O 2 ) Batteri AEROBI OBBLIGATI vivono solo in presenza di O 2 Fattori influenzanti la crescita Batteri AEROBI-ANAEROBI FACOLTATIVI vivono in presenza/assenza di O 2 Batteri ANAEROBI OBBLIGATI vivono in assenza di O 2 (6 di 6) Batteri MICROAEROFILI vivono in presenza di (O 2 5%, CO 2 10%, N 2 85%) Aerobi obbligati Aerobi facoltativi Anaerobi obbligati Anaerobi facoltativi Microaerofili

28 Terreni particolari per l isolamento di agenti eziologici poco frequenti Origine prelievo Diagnosi presuntiva Batteri patogeni Terreni per l'isolamento Feci Colera Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Faringe Infiammazione ostruttiva epiglottide e faringe Haemophilus influenzae Acqua peptonata alcalina TCBS Agar sangue cioccolato o agar Casman Faringite membranosa Corynebacterium diphteriae Agar Loeffler Agar Tinsdale Terreno al tellurito di sodio

29 Terreni particolari per l isolamento di agenti eziologici poco frequenti Origine prelievo Tampone rinofaringeo Escreato Diagnosi presuntiva Pertosse Tubercolosi Micosi polmonare Batteri patogeni Bordetella pertussis Mycobacterium tuberculosis Blastomyces dermatitidis Terreni per l'isolamento Bordet-Gengou alla patata Lowenstein- Jensen Middlebrook 7H- 11 Brain-heart Infusion agar Urina Leptospirosi Leptospira spp. Semisolido di Fletcher Sangue, midollo osseo o biopsia Brucellosi Brucella spp. Agar brucella

30 Terreni per l isolamento degli anaerobi da campioni patologici (1 di 2) Terreno Agar sangue (AS) Agar cioccolato (AC) Agar MacConkey (MAC) Agar sangue feniletil alcool (PEA) Scopo Terreno in piastra non selettivo di uso generale Utilizzato principalmente per l'isolamento di Haemophilus e Neisseria; usato anche per l'isolamento di anaerobi esigenti Isolamento di bacilli Gram- aerobi ed anaerobi facoltativi Isolamento cocchi Gram+ anerobi facoltativi ed anaerobi obbligati Gram+ e Gram-

31 Terreni per l isolamento degli anaerobi da campioni patologici (2 di 2) Terreno Agar sangue kanamicinavancomicina (KV) Terreno al tioglicolato (BBL-0135C) + emina + vitamina K 1 (THIO) Scopo Isolamento selettivo di bacilli anaerobi Gram- Brodo di arricchimento utilizzato per arricchire i terreni in piastra particolarmente se il campione è scarso Terreno di Thayer-Martin modificato (MT) Impiegato per arricchire i terreni per anaerobi quando si sopetta nel campione la presenza di Neisseria gonorrhoeae o N. meningitidis

32 Giara per anaerobiosi Anaerobiosi Cappa (camera) per anaerobiosi Figure 6.5

33 Carbossifilia (5% O 2, 10% CO 2, 85% N 2 ) Giara con candela Sistemi per generazione di carbossifilia (CO 2 -packet) Figure 6.7

34 Identificazione dei microrganismi 1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen 2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc. crescita su terreni selettivi 3. Caratteristiche biochimiche 4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) 5. Tipizzazione fagica 6. Identificazione genotipica

35 ID dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie (1 di 2) Forma Rilievo puntiforme d < 1 mm effuso sottile, allungato circolare piatto filamentosa irregolare, a filo intrecciato sopraelevato rizoide irregolare, ramificata convesso irregolare umbonato

36 ID dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie (2 di 2) Superficie Margine liscia intero rilevata radiata concentrica rugosa ondulata anelli concentrici raggrinzita ondulato eroso filamentos o arricciato

37 ID dei microrganismi Aspetti macroscopici (emolisi) Streptococcus spp Staphylococcus spp

38 ID dei microrganismi Aspetti macroscopici (fermentazione) Staphylococcus spp

39 ID dei microrganismi Aspetti macroscopici (sciamaggio) Proteus mirabilis

40 ID dei microrganismi Caratteristiche biochimiche Enterobacteriaceae, in particolare: capacità di utilizzare determinati substrati come unica fonte di carbonio acidi organici o loro sali (acetato, citrato, malonato) + indicatore ph (blu di bromotimolo: vira al blu a ph basico) presenza di particolari enzimi ureasi, lisina- ornitina-decarbossilasi, arginina-diidrolasi, beta-galattosidasi, ureasi produzione di specifici prodotti metabolici terminali H 2 S, indolo, acetoino (reazione di Voges-Proskauer) capacità di fermentare particolari zuccheri (O-F test) 1% carboidrato + indicatore ph + campanella di Durhan (produzione di gas)

41 ID dei microrganismi Caratteristiche biochimiche API (biomérieux) Identification System

42 ID dei microrganismi Caratteristiche antigeniche Produzione di antisieri (Ab specifici) mediante inoculazione di microrganismi nella cavia Utilizzo di antisieri per reazione di agglutinazione colonia stemperata in NaCl + antisiero specifico reazione positiva: agglutinazione dei microrganismi Possibile tipizzazione specifica ed intra-specifica (tipi sierologici o sierotipi)

43 Agglutinazione Ag Ag Ag Ag Ag Ab

44 ID dei microrganismi Tipizzazione fagica Una singola specie può comprendere ceppi diversi (sottospecie o tipi) Impiego di batteriofagi a fini identificativi esempio: tipizzazione di S. aureus estremamente sensibile a numerosi (20) batteriofagi virulenti (litici) sensibilità non uniforme (stipite-specifica) individuazione di tipi fagici Utile ai fini epidemiologici (studio delle modalità di diffusione dell infezione)

45 Tipizzazione fagica

46 ID dei microrganismi Identificazione molecolare Polymerase Chain Reaction amplificazione di sequenze bersaglio, specifiche per il genere, la specie od il tipo batterico elevata sensibilità (necessità di poche copie del target di partenza) e specificità. sequenziamento genico (genotipizzazione) RNA ribosomale grandi quantità di rrna altamente conservate in specie differenti; presenza di sequenze di rrna specifiche per specie e tipo. L amplitudo della differenza nell rrna di due batteri rivela quanto filogeneticamente vicini essi siano: piccole differenze in rrna sono suggestive per una vicinanaza tra le specie, mentre grandi differenze indicano che le specie sono più distanti tra loro. L individuazione di un pattern in rrna che non trova riscontro in nessun altra sequenza nota, indica la scoperta di una nuova specie.

47 ID dei microrganismi Identificazione molecolare