Strategie an*microbiche alterna*ve agli an*bio*ci Giordano Rampioni

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1 Strategie an*microbiche alterna*ve agli an*bio*ci Giordano Rampioni Università degli Studi Roma Tre - Dipar8mento di Scienze Laboratorio di Biotecnologie dei Microrganismi

2 A par&re dagli anni 60, si è assis&to ad una graduale diminuzione dei nuovi an&bio&ci introdo; in commercio. Produrre un nuovo an&bio&co costa molto (ci vogliono anni), e i microrganismi diventano presto resisten&.

3 Strategie an&baaeriche alterna&ve agli an&bio&ci In parallelo, le resistenze an&bio&che sono sempre più diffuse, e la percentuale di microrganismi resisten& agli an&bio&ci in commercio cresce ver&ginosamente.

4 L antibiotico-resistenza pone un serio problema sanitario ed economico Negli Stati Uniti, nel 2013: Staphylococcus aureus resistente alla me8cillina infezioni; decessi Streptococcus pneumoniae resistente ai farmaci clinicamente rilevan infezioni; decessi Enterococchi resisten8 alla vancomicina infezioni; decessi La spesa annua stimata relativa all insorgenza delle resistenze agli antibiotici è di circa 1,5 miliardi di euro nell Unione Europea, e di 5 miliardi di dollari negli Stati Uniti d America. CDC Office of Infectious Diseases, 2013.

5 L emergenza di microrganismi patogeni resisten& agli an&bio&ci è un problema sanitario ed economico mondiale, e ormai se ne stanno accorgendo anche al di fuori del mondo scien&fico. Lettori: Diffusione: Dir. Resp.: Giorgio Mulè Dir. Resp.: Giorgio Mulè 03-APR-2013 Lettori: Diffusione: da pag APR-2013 da pag Aprile APR-2013 Dir. Resp.: Giorgio Mulè da pag. 52

6 Corriere della Sera, 1 Maggio 2014

7 Possiamo vincere la guerra contro i patogeni? I problemi principali sono l elevata capacità dei baaeri di acquisire resistenze e la for&ssima pressione sele;va generata dall uso di an&bio&ci tradizionali. TraJamento con Ampicillina Rinfresco in un terreno senza o con Ampicillina Cellula resistente per acquisizione di una mutazione o di un gene di resistenza Tutta la popolazione ha la mutazione o il gene di resistenza In una popolazione baaerica basta un resistente per dar vita ad una popolazione di resisten&. L unico resistente può sfruaare le risorse di una nicchia priva di compe&tori!

8 Possiamo vincere la guerra contro i patogeni? Inoltre, gli an&bio&ci sono molecole di origine naturale, pertanto i microrganismi in natura hanno già evoluto meccanismi di an8bio8co resistenza prima che gli an8bio8ci vengano introdon sul mercato.

9 Mol& scienzia& credono che ci troviamo già nella post- an*bio*c era. In UK l an&bio&co- resistenza è stata inserita tra le emergenze nazionali, al pari del riscaldamento globale. Anche la WHO (World Health Organiza&on) si sta muovendo nella stessa direzione.

10 Cosa possiamo fare? Sicuramente sarebbe importante sviluppare nuovi an8bio8ci, ma possiamo immaginare che anche per ques8 si possano sviluppare in freja nuovi sistemi di resistenza (non è una soluzione a lungo termine). Uno dei problemi è che mol8 an8bio8ci sono sviluppa8 sulla base di an8bio8ci prodon dai microrganismi, per i quali già esistono in natura meccanismi di resistenza. Una strategia perseguita è quella di rendere di nuovo efficaci an&bio&ci che non lo sono più. Inibitori delle pompe d efflusso Sinergie con compos8 naturali o sinte8ci Si possono anche immaginare nuovi farmaci che impongano una ridoaa pressione sele;va, e che quindi non por&no all emergenza di resistenze. Inibitori della virulenza Molecole xenobio8che

11 Cosa possiamo fare? Sicuramente sarebbe importante sviluppare nuovi an8bio8ci, ma possiamo immaginare che anche per ques8 si possano sviluppare in freja nuovi sistemi di resistenza (non è una soluzione a lungo termine). Uno dei problemi è che mol8 an8bio8ci sono sviluppa8 sulla base di an8bio8ci prodon dai microrganismi, per i quali già esistono in natura meccanismi di resistenza. Una strategia perseguita è quella di rendere di nuovo efficaci an&bio&ci che non lo sono più. Inibitori delle pompe d efflusso Sinergie con compos8 naturali o sinte8ci Si possono anche immaginare nuovi farmaci che impongano una ridoaa pressione sele;va, e che quindi non por&no all emergenza di resistenze. Inibitori della virulenza Molecole xenobio8che

12 Le pompe d efflusso e la resistenza agli an&bio&ci Le pompe d efflusso sono uno dei maggiori determinan8 di resistenza agli an8bio8ci nei microrganismi, ed agiscono estrudendo l an8bio8co all esterno della cellula bajerica. Figure 1: Schema8c Drawing of the AcrAB- TolC an8bio8c efflux pump of Escherichia coli. The inner membrane component AcrB (blue) is both the substrate specificity determinant and the energy module of the AcrA/AcrB/TolC efflux system. Drugs are transported from the outer leaflet of the inner membrane via a coupled drug/proton an8port mechanism. TolC (yellow) forms a channel in the outer membrane. AcrA (red) is an adaptor connec8ng AcrB and TolC.

13 Le pompe d efflusso e la resistenza agli an&bio&ci I primi studi sulle pompe di efflusso per gli an8bio8ci sono state condoje per la resistenza alla tetraciclina in E. coli. La resistenza alla tetraciclina è dovuta al gene tet, che codifica per una pompa di efflusso per questo an8bio8co. Il gene tet è presente su diversi trasposoni e plasmidi (si propaga facilmente tra i microrganismi). Alcuni bajeri hanno un vasto arsenale di pompe di efflusso e sono mul&resisten&. RND in B. cenocepacia J2315 Le pompe d efflusso che portano alla resistenza agli an8bio8ci appartengono a diverse famiglie: 1) major facilitator (MF) superfamily (proton- drug an8port) 2) resistance- nodula8on- division (RND) family (proton- drug an8port) 3) small mul8- drug resistance (SMR) family (proton- drug an8port) 4) ATP binding casseje (ABC) family (ATP hydrolysis) 5) mul8ple an8bio8c and toxin extrusion (MATE) family (proton or sodium an8port)

14 (Table 1) Contd.. Antimicrobial Efflux System Pump Family Organism(s) References Clindamycin Lsa(B) ABC Staphylococcus sciuri [6] Tetracyclines and glycilcyclines Le pompe d efflusso e la resistenza agli an&bio&ci Alcuni esempi di sistemi di efflusso che conferiscono resistenza alla tetraciclina in diversi bajeri. Tetracyclines Tet(A), Tet(B), Tet(C) Tet(D), Tet(E), Tet (G) Tet(H), Tet(J), Tet(Y) Tet(Z), Tet(30), Tet(39) MFS Gram-negative bacteria [34, 71] Tet(K), Tet(L) MFS Gram-positive bacteria [71] Tet38 MFS S. aureus [48] Tet(V) MFS Mycobacterium tuberculosis, M. fortuitum [56] Rv1258/tap MFS M. tuberculosis, M. fortuitum [56] P55/Rv1410 MFS M. tuberculosis, M. bovis [56] Rv2333c MFS M. tuberculosis, M. bovis [57] DrrAB ABC M. tuberculosis [56] MdfA MFS E. coli [6] MexAB-OprM, several RND pumps RND E. coli [6, 34] AcrAB-TolC RND S. enterica, Sserovar typhimurium [3, 6, 38] AdeABC ABC Acinetobacter baumannii [38] CmeABC SmdAB C. jejuni Serratia marcescens [39, 65] [72]

15 Le pompe d efflusso e la resistenza agli an&bio&ci Gli inibitori delle pompe d efflusso possono dissipare il gradiente protonico o inibire direjamente la pompa d efflusso. Agen8 che dissipano il gradiente protonico: carbonil cianide m- clorofenilidrazone (CCCP), valinomicina e dinitrofenolo (DNP). Sono citotossici per le cellule superiori! La reserpina ed il verapamil sono esempi di inibitori delle pompe d efflusso per i quali non è noto il bersaglio molecolare. Anche ques8 compos8, però, sono anvi a concentrazioni che non possono essere u8lizzate in terapia in quanto tossiche. Alcuni inibitori delle pompe d efflusso interagiscono direjamente con una delle componen8 molecolari di tali pompe. Una delle prime molecole di tale classe ad essere iden8ficata, ed una delle più studiate, è la fenilalanina arginil β- nagilamide (PAβN). Questa molecola inibisce alcune pompe d efflusso della famiglia RND, ma come per la maggior parte degli inibitori iden8fica8 fino ad oggi, anche il PAβN è tossico. Lo studio degli inibitori delle pompe d efflusso mira a produrre nuovi compos8 con maggiore anvità inibitoria e/o ridoja anvità citotossica (ques8 due parametri sono correla8 tra loro). Le molecole trovate fino ad ora sono impiegate come scaffold per lo sviluppo di analoghi con maggiore anvità e/o con minore citotossicità.

16 Come iden&ficare nuovi inibitori delle pompe d efflusso? Come per i nuovi an8bio8ci (e mol8 altri farmaci), si possono seguire due vie dis8nte: Screening random di compos8 di derivazione naturale o sinte8ca. Molte volte questo è preceduto da test di citotossicità. Design razionale di compos8 di sintesi sulla base di informazioni strujurali del target. Bisogna conoscere i target. Si testano migliaia di compos8 contenu8 in libraries random per la loro anvità. Spesso questo screening è robo8zzato. Molecola con una strujura tale da legarsi alla pompa d efflusso ed inibirne l anvità.

17 Una strategia perseguita è quella di rendere di nuovo efficaci an&bio&ci che non lo sono più. Inibitori delle pompe d efflusso Sinergie con compos& naturali o sinte&ci Si possono anche immaginare nuovi farmaci che impongano una ridoaa pressione sele;va, e che quindi non por&no all emergenza di resistenze. Inibitori della virulenza Molecole xenobio8che

18 BRIEF COMMUNICATION PUBLISHED ONLINE: 24 APRIL 2011 DOI: /NCHEMBIO.559 Combinations of antibiotics and nonantibiotic drugs enhance antimicrobial efficacy Linda Ejim 1,2, Maya A Farha 1,2, Shannon B Falconer 1,2, Jan Wildenhain 3, Brian K Coombes 1,2, Mike Tyers 3, Eric D Brown 1,2 * & Gerard D Wright 1,2 * 2011 Nature America, Inc. All rights reserved. Combinations of antibiotics are commonly used in medicine to broaden antimicrobial spectrum and generate synergistic effects. Alternatively, combination of nonantibiotic drugs with antibiotics offers an opportunity to sample a previously untapped expanse of bioactive chemical space. We screened a collection of drugs to identify compounds that augment the activity of the antibiotic minocycline. Unexpected synergistic drug combinations exhibited in vitro and in vivo activity against bacterial pathogens, including multidrug resistant isolates. Resistance to antibiotics is a ubiquitous and relentless clinical problem that is compounded by a dearth of new therapeutic agents 1. The retreat of the pharmaceutical sector from new antibiotic development has exacerbated the challenge of widespread resistance and signals a critical need for innovation. The density of vital functional connections at the levels of gene expression, genetic interactions and protein interactions in model microbes 2,3 predicts that combinations of bioactive small molecules targeting two or more functions have potential as antimicrobial agents 4,5. Drug combinations may also counteract drug resistance 6. To date, however, the discovery of effective antibiotic combinations has been ad hoc and limited in scope. Redeployment of drugs for alternative indications can leverage well-characterized toxicology and pharmacology 7,8 and reduce cost barriers in drug development 9. Combinations of antibiotics have been used to treat tuberculosis, leprosy, malaria, HIV and infections associated with cystic fibrosis, and a few combinations of nonantibiotics with antibiotics have shown increased antimicrobial activity in vitro (for example, refs ). This suggests that combinations of bioactive compounds with antibiotics can explore a much larger area of antimicrobial chemical space than single agents. To probe this chemical space, we systematically explored combinations of an approved antibiotic and a collection of previously ATCC29213) in the presence of minocycline at one half the minimal inhibitory concentration (MIC) for each strain. We monitored growth inhibition in duplicate samples at h after inoculation In questo lavoro è stato inves&gato il potenziale di compos& appartenen& ad una banca di FDA- approved drugs (compos& già approva& per l uso nell uomo) di aumentare l effeao dell an&bio&co minociclina, una tetraciclina, su ceppi di Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. L uso di banche di FDA- approved drugs può dras&camente abbreviare i tempi (ed i cos&) per il trasferimento del composto dal laboratorio all uso clinico. Questo approccio si definisce SOSA (Selec&ve Op&miza&on of Side Ac&vi&es) approach, o anche drug- repurposing. in the presence of PAD compounds at 10 M, which is a readily achievable assay concentration that enables selection of bioactive compounds. The primary screens yielded 156 active compounds with >45% growth inhibition for S. aureus, 142 for E. coli and 48 for P. aeruginosa (Supplementary Fig. 1). As the PAD library is enriched for known antibiotics (~180 in total), about half of the primary hits were known antibacterial agents and thus uninteresting as potentiators of minocycline. In total, 69 nonantibiotic compounds that have never been used clinically to treat bacterial infection were found to synergize with minocycline. These compounds exhibited substantially nonoverlapping profiles for each species: 35 for S. aureus, 41 for E. coli and 6 for P. aeruginosa (Supplementary Table 2). For S. aureus and P. aeruginosa, we determined whether the PAD combinations with minocycline were additive or synergistic using the fractional inhibitory concentration (FIC) index as a measure of the interaction between two antimicrobial agents 13. Con questo screening sono sta& iden&fica& diversi compos& con effeao sinergico alla minociclina: 35 per S. aureus, 41 per E. coli e 6 per P. aeruginosa. FIC indices of 1, 0.5 and 4 indicate no interaction, synergy and antagonism, respectively 14. For example, we identified a strong synergy on growth inhibition of S. aureus between minocycline and disulfiram (trade name: Antabuse) (2), an inhibitor of acetaldehyde dehydrogenase widely used as an aversion treatment for alcoholism. Disulfiram alone has weak antibiotic activity against Tali compos& non hanno un effeao an&bio&co per se, e sono u&lizza& per il traaamento di patologie non connesse alle infezioni baaeriche. S. aureus (Supplementary Table 3) but strongly synergizes with mino cycline. Synergy was seen for eight of ten distinct MRSA (methicillin- resistant S. aureus) strains from the Canadian MRSA collection 15, including community-acquired (USA300) and hospital (USA200) epidemic strains (Supplementary Table 3). P. aeruginosa is clinically resistant to many antibiotics including

19 BRIEF COMMUNICATION PUBLISHED ONLINE: 24 APRIL 2011 DOI: /NCHEMBIO.559 Combinations of antibiotics and nonantibiotic drugs enhance antimicrobial efficacy Linda Ejim 1,2, Maya A Farha 1,2, Shannon B Falconer 1,2, Jan Wildenhain 3, Brian K Coombes 1,2, Mike Tyers BRIEF 3, Eric D Brown COMMUNICATION 1,2 * & Gerard D Wright 1,2 * NATURE CHEM 2011 Nature America, Inc. All rights reserved. Combinations of antibiotics are commonly used in medicine ATCC29213) in the presence of minocycline at one half the minimal inhibitory Percent concentration inhibition (MIC) for each strain. c We 1.2monitored effects. Alternatively, combination of nonantibiotic drugs to broaden aantimicrobial spectrum Percent inhibition and generate synergistic b Benserazide growth inhibition in duplicate samples at h after inoculation with antibiotics offers 0 an 20 opportunity to sample 80 a 100 previously in the 0 presence 20 of 40 PAD compounds at M, which is a readily Loperamide untapped expanse of bioactive chemical space. We screened achievable assay concentration that enables selection 1.0of bioactive Tegaserod a collection of drugs to identify compounds that augment the compounds. The primary screens yielded 156 active compounds activity of the 256 antibiotic minocycline. Unexpected synergistic 1,024 with >45% growth inhibition for S. aureus, 142 for E. coli and 48 for drug combinations exhibited in vitro and in vivo activity against P. aeruginosa (Supplementary Fig. 1). As the PAD library is enriched bacterial pathogens, including multidrug resistant isolates. for known antibiotics (~180 in total), about half of the primary hits Resistance to 64 antibiotics is a ubiquitous and relentless clinical 256 were known antibacterial agents and thus uninteresting as potentiators of minocycline. In total, 69 nonantibiotic compounds that have 0.6 problem that is compounded 32 by a dearth of new therapeutic agents The retreat of the pharmaceutical sector from new antibiotic development has exacerbated never been used clinically to treat bacterial infection were found 16 the challenge of widespread resistance and to 64 synergize with minocycline. These compounds exhibited 0.4 substantially 32 nonoverlapping profiles for each species: 35 for S. aureus, signals a critical need 8 for innovation. The density of vital functional connections at the levels of gene expression, genetic interactions and 41 for E. coli and 6 for P. aeruginosa (Supplementary Table 2) protein interactions in model microbes 2,3 predicts that combinations For S. aureus and P. aeruginosa, we determined 0.2 whether the of bioactive small 2molecules targeting two or more functions have PAD 8 combinations with minocycline were additive or synergistic potential as antimicrobial 0 agents 4,5. Drug combinations may also using the fractional inhibitory concentration (FIC) index as a 0 counteract drug resistance 6. To date, however, the discovery of effective antibiotic combinations 0 1has 2been 4 ad 8hoc and limited 128 in scope. FIC indices 0 1 of 21, and indicate no interaction, synergy and measure of the interaction between two antimicrobial 0 agents 13. Redeployment of drugs for alternative indications can leverage antagonism, respectively 14. For example, we identified a strong Minocycline (mg ml 1 ) Minocycline (mg ml 1 ) well-characterized toxicology and pharmacology 7,8 and reduce cost synergy on growth inhibition of S. aureus between minocycline barriers in drug development 9. Combinations of antibiotics have and disulfiram (trade name: Antabuse) (2), an inhibitor of acetaldehyde dehydrogenase widely used as an aversion treatment for P. aeruginosa been used to treat tuberculosis, leprosy, malaria, HIV and infections associated with cystic fibrosis, and a few combinations of nonantibiotics with antibiotics have shown increased antimicrobial activity S. aureus (Supplementary Table 3) but strongly synergizes with alcoholism. Disulfiram alone has weak antibiotic activity against in vitro (for Figure example, 1 refs. Nonantibiotic 10 12). This suggests molecules that combinations synergize mino cycline. with Synergy the was antibiotic seen for eight minocycline. of ten distinct MRSA (a,b) Heat plots sh of bioactive compounds with antibiotics can explore a much larger (methicillin- resistant S. aureus) strains from the Canadian MRSA area of antimicrobial minocycline chemical in space combination than single agents. with benserazide collection (a) 15, including and community-acquired loperamide (b). (USA300) Synergy and hospital was evident as the To probe this chemical space, we systematically explored combinations alone of an approved are 32 antibiotic g mland 1, a 256 collection g ml of previously 1 and 2,048 P. aeruginosa g ml is 1 clinically, respectively. resistant to many (c) antibiotics Synergy including of combinations (USA200) epidemic strains (Supplementary Table 3). of Benserazide (mg ml 1 ) Loperamide (mg ml 1 ) Ad esempio, la benserazide, un inibitore dell enzima DOPA carbossilasi, normalmente u&lizzato nel traaamento del morbo di Parkinson, diminuisce la MIC della minociclina nei confron& di P. aeruginosa. Lo stesso vale per la loperamide, un an&diarroico (in Italia commercializzato come Imodium). FIC index PA01 #216 #302 #

20 BRIEF COMMUNICATION PUBLISHED ONLINE: 24 APRIL 2011 DOI: /NCHEMBIO Nature America, Inc. All rights reserved. Combinations of antibiotics and nonantibiotic drugs enhance antimicrobial efficacy LOGY DOI: /NCHEMBIO.559 d Cfu per g tissue Minocycline Loperamide Bacteria Linda Ejim 1,2, Maya A Farha 1,2, Shannon B Falconer 1,2, Jan Wildenhain 3, Brian K Coombes 1,2, Mike Tyers 3, Eric D Brown 1,2 * & Gerard D Wright 1,2 * Combinations of antibiotics are commonly used in medicine to broaden antimicrobial spectrum and generate synergistic effects. Alternatively, combination of nonantibiotic drugs with antibiotics offers an opportunity to sample a previously untapped expanse of bioactive chemical space. We screened a collection of drugs to identify compounds that augment the activity of the antibiotic minocycline. Unexpected synergistic drug combinations exhibited in vitro and in vivo activity against bacterial pathogens, including multidrug resistant isolates. Resistance to antibiotics is a ubiquitous and relentless clinical problem that is compounded by a dearth of new therapeutic agents 1. The retreat of the pharmaceutical sector from new antibiotic development has exacerbated the challenge of widespread resistance and signals a critical need for innovation. The density of vital functional connections at the levels of gene expression, genetic interactions and protein interactions in model microbes 2,3 predicts that combinations of bioactive small molecules targeting two or more functions have potential as antimicrobial agents 4,5. Drug combinations may also counteract drug resistance 6. To date, however, the discovery of effective antibiotic combinations has been ad hoc and limited in scope. Redeployment of drugs for alternative indications can leverage well-characterized toxicology and pharmacology 7,8 and reduce cost barriers in drug development 9. Combinations of antibiotics have been used to treat tuberculosis, leprosy, malaria, HIV and infections associated with cystic fibrosis, and a few combinations of nonantibiotics 0 0with 100 antibiotics 0 have 75 shown 75 increased antimicrobial activity in vitro (for example, refs ). This suggests that combinations of 0bioactive 0 compounds 0 50 with 1 10 antibiotics 50 can 1 explore 10 a 50 much larger area of antimicrobial chemical space than single agents. To probe + + this chemical + + space, + we + systematically + + explored + combinations of an approved antibiotic and a collection of previously ATCC29213) in the presence of minocycline at one half the minimal inhibitory concentration (MIC) for each strain. We monitored growth inhibition in duplicate samples at h after inoculation in the presence of PAD compounds at 10 M, which is a readily achievable assay concentration that enables selection of bioactive compounds. The primary screens yielded 156 active compounds with >45% growth inhibition for S. aureus, 142 for E. coli and 48 for P. aeruginosa (Supplementary Fig. 1). As the PAD library is enriched for known antibiotics (~180 in total), about half of the primary hits were known antibacterial agents and thus uninteresting as potentiators of minocycline. In total, 69 nonantibiotic compounds that have never been used clinically to treat bacterial infection were found to synergize with minocycline. These compounds exhibited substantially nonoverlapping profiles for each species: 35 for S. aureus, 41 for E. coli and 6 for P. aeruginosa (Supplementary Table 2). serovar Typhimurium. For S. aureus and P. aeruginosa, we determined whether the PAD combinations with minocycline were additive or synergistic using the fractional inhibitory concentration (FIC) index as a measure of the interaction between two antimicrobial agents 13. FIC indices of 1, 0.5 and 4 indicate no interaction, synergy and antagonism, respectively 14. For example, we identified a strong synergy on growth inhibition of S. aureus between minocycline and disulfiram (trade name: Antabuse) (2), an inhibitor of acetaldehyde dehydrogenase widely used as an aversion treatment for alcoholism. Disulfiram alone has weak antibiotic activity against S. aureus (Supplementary Table 3) but strongly synergizes with mino cycline. Synergy was seen for eight of ten distinct MRSA (methicillin- resistant S. aureus) strains from the Canadian MRSA collection 15, including community-acquired (USA300) and hospital (USA200) epidemic strains (Supplementary Table 3). P. aeruginosa is clinically resistant to many antibiotics including E stato dimostrato che la loperamide è efficace anche in vivo, in un modello di murino di infezione intes&nale con Salmonella enterica

21 Una strategia perseguita è quella di rendere di nuovo efficaci an&bio&ci che non lo sono più. Inibitori delle pompe d efflusso Sinergie con compos8 naturali o sinte8ci Quali limitazioni potrebbero essere insite in tali approcci? Come per gli an8bio8ci tradizionali, gli inibitori delle pompe d efflusso ed i compos8 adiuvan8 esercitano una forte pressione selenva sulla popolazione microbica, e possono pertanto portare ad una rapida insorgenza di ceppi resisten8. Inoltre, in mol8 casi, l impajo di tali molecole sulla fisiologia dei microrganismi non è carajerizzato nel dejaglio. Cosa succede se un adiuvante o un inibitore di una pompa d efflusso, ad esempio, aumentano la virulenza di un patogeno?

22 Una strategia perseguita è quella di rendere di nuovo efficaci an&bio&ci che non lo sono più. Inibitori delle pompe d efflusso Sinergie con compos8 naturali o sinte8ci Si possono anche immaginare nuovi farmaci che impongano una ridoaa pressione sele;va, e che quindi non por&no all emergenza di resistenze. Molecole xenobio&che Inibitori della virulenza

23 Gli acidi pep8donucleici (PNA) I PNA sono polimeri organici analoghi agli acidi nucleici in cui lo scheletro zucchero- fosfato è completamente sos8tuito da una strujura pseudo pep8dica. I PNA sono in grado di appaiarsi con molecole di DNA o RNA complementari. I PNA non possono essere degrada8 da nucleasi o proteasi. Il legame PNA/DNA o PNA/RNA è più stabile di quello DNA/DNA o DNA/RNA.

24 I PNA per la terapia an8senso an8bajerica PNA In base alla loro sequenza i PNA possono appaiarsi con determinati mrna bersaglio, inibendone la traduzione. Se questi mrna codificano per proteine essenziali alla crescita del microrganismo, i PNA avranno un effetto antimicrobico. Woodford e Wareham (2009) J Antimicrob Chemother 63:

25 Strategie an&senso basate su PNA sono state u&lizzate con successo per inibire la crescita di una vasta gamma di baaeri patogeni Microrganismi Gene bersaglio Proteina codificata Referenze Acinetobacter baumannii rpod RNA polimerasi, subunità σ 70 Bai et al. (2012) Biomaterials 33: Brucella suis pola DNA polimerasi I, necessaria per la replicazione del DNA Rajasekaran et al. (2013) Int J Antimicrob Agents 41: Escherichia coli fola Diidrofolato reduttasi, sintesi dell acido folico Dryselius et al. (2005) J Antimicrob Chemother 56: Gram-positivi Gram-negativi Klebsiella pneumoniae mura Proteina coinvolta nella sintesi del peptidoglicano Mondhe et al. (2014) PloS ONE 9:1-8. Pseudomonas aeruginosa acpp Proteina trasportatrice di gruppi acili, essenziale per la biosintesi degli acidi grassi Salmonella enterica ser. Typhimurium Ghosal e Nielsen (2012) Nucleic Acid Ther 22: mura Proteina coinvolta nella sintesi del peptidoglicano Mondhe et al. (2014) PloS ONE 9:1-8. Shigella flexneri rpod RNA polimerasi, subunità σ 70 Bai et al. (2012) Biomaterials 33: Bacillus subtilis ftsz Proteina coinvolta nella divisione cellulare Mondhe et al. (2014) PloS ONE 9:1-8. Listeria monocytogenes rpoa RNA polimerasi, subunità α Alajlouni e Seleem (2013) Nucleic Acid Ther 23: Mycobacterium smegmatis inha Reduttasi coinvolta nell allungamento degli acidi grassi Kulyté et al. (2005) J Mol Microbiol Biotech 9: Staphylococcus aureus fmhb Proteina coinvolta nella sintesi del peptidoglicano Nekhotiaeva et al. (2004) Mol Ther 10: Streptococcus pyogenes gyra DNA girasi, subunità A, parte del processo replicativo del DNA Patenge et al. (2013) Mol Ther Nucleic Acids 2:1-9.

26 Altri bersagli possibili dei PNA an8bajerici RNA ribosomiale RNA della RNasi P mrna di geni per la resistenza agli an&bio&ci

27 Ingresso dei PNA nelle cellule bajeriche L ingresso dei PNA nelle cellule è normalmente molto limitato. Perché i PNA possano entrare nelle cellule, questi devono essere coniugati a Cell Penetrating Peptides, come ad esempio (KFF) 3 K o (RXR) 4 XB. Effetto di un PNA anti-gyra sulla crescita di K. pneumoniae. Kurupati et al. (2007) Antimicrob Agents Chemother 51:

28 Come disegnare PNA efficaci Diversi parametri devono essere tenuti in considerazione quando si disegnano i PNA. 1. Quanto devono essere lunghi i PNA? PNA troppo corti non sarebbero in grado di appaiarsi con sufficiente stabilità agli acidi nucleici bersaglio. PNA troppo lunghi potrebbero non entrare nelle cellule. Good et al. (2007) Nat Biotechnol 19:

29 Come disegnare PNA efficaci 2. Qual è la regione migliore dell mrna su cui disegnare i PNA? PNA antisenso disegnati su varie regioni dell mrna del gene acpp di E. coli, e relativi valori di Minima Concentrazione Inibente la crescita (MIC). Dryselius et al. (2003) Oligonucleotides 13:

30 Come disegnare PNA efficaci 3. Si vogliono generare PNA ad ampio spettro d azione o specie-specifici? A seconda del grado di conservazione della loro sequenza bersaglio, si possono disegnare PNA: ad ampio spettro d azione: in grado di inibire la crescita di patogeni appartenenti a generi e specie differenti; specie-specifici: approccio mirato, inibiscono la crescita di un solo patogeno senza creare disbiosi nel microbiota dell ospite.

31 PNA ad ampio spettro d azione Un PNA disegnato su una regione conservata dell mrna del gene rpod è in grado di inibire la crescita di diversi patogeni Gram-negativi, anche antibiotico resistenti. Bai et al, (2012) Biomaterials 33:

32 PNA specie-specifici Se si prede in esame una regione dell mrna non conservata, si possono disegnare PNA in grado di inibire in modo selettivo la crescita di una sola specie batterica. I PNA Kp0001 e Se0001 sono disegnati sulla stessa regione del gene mura, che codifica per un enzima necessario alla sintesi del peptidoglicano. PNA Kp0001: appaiamento perfetto con l mrna del gene mura di K. pneumoniae; 2 mismatch con l mrna del gene mura di B. subtilis e S. enterica ser. Typhimurium. PNA Se0001: appaiamento perfetto con l mrna del gene mura di S. enterica ser. Typhimurium; 2 mismatch con l mrna del gene mura di B. subtilis e K. pneumoniae. Mondhe et al. (2014) PLoS ONE 9:1-8.

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