*Corresponding author: Dipartimento di Biologia Sperimentale, Università degli Studi di Cagliari

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1 IMPATTO NUTRIZIONALE DEI PRODOTTI LATTIERO CASEARI NELL UOMO: FUNZIONE DELLA FRAZIONE LIPIDICA impact of dairy products on human nutrition: Role of the lipid fraction Stefano Pintus 1, Paolo Pintus 1, Danila Pistis 1, Barbara Batetta 2, Simonetta Accossu 2, Sabrina Uda 2, Gianfranca Carta 3, Elisabetta Murru 3, Lina Cordeddu 3, Claudia Vacca 3, Annarita Sirigu 3, Elena Giordano 3, Elena Ghiani 4, Giuseppe Vona 4, Marcello Mele 5, Pierlorenzo Secchiari 5 e Sebastiano Banni 3, * 1 Centro di Malattie Dismetaboliche dell Azienda Ospedaliera Brotzu di Cagliari 2 Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche, Università di Cagliari 3 Dipartimento di Biologia Sperimentale sezione Fisiologia Gen., Università di Cagliari 4 Dipartimento di Biologia Sperimentale sezione Antropologia, Università di Cagliari 5 Dipartimento di Agronomia e Gestione dell'agroecosistema, Università di Pisa *Corresponding author: Dipartimento di Biologia Sperimentale, Università degli Studi di Cagliari Cittadella Universitaria, Monserrato, Cagliari, ITALY. banni@unica.it Abstract Il contenuto e la composizione dei grassi dei prodotti lattiero caseari rappresentano un punto molto controverso, infatti per il loro alto contenuto in acidi grassi saturi sono considerati fattori di rischio cardiovascolare. I dati sperimentali non confermano però questa ipotesi probabilmente per la presenza di altri fattori come l acido linoleico coniugato (CLA) che ha ottenuto considerevole attenzione per la sua capacità di modulare positivamente il metabolismo lipidico sia in modelli sperimentali che nell uomo. Per verificare se prodotti caseari ricchi in CLA fossero in grado di modificare il profilo lipidico in pazienti ipercolesterolemici, abbiamo reclutato 20 pazienti adulti ipercolesterolemici a cui è stata somministrata una dieta standard con 90g/d formaggio arricchito in CLA ottenuto dal latte di pecore alimentate con un mangime sperimentale contenente semi di lino estrusi (una fonte naturale di precursori di CLA). Dai dati ancora preliminari, nei pazienti che avevano assunto il formaggio arricchito si nota una tendenza alla diminuzione dei PUFA idroperossidi, marker di stress ossidativo e una marginale diminuzione del colesterolo LDL, del BMI e della leptina plasmatica. I nostri dati, anche se ancora preliminari, suggeriscono che i formaggi naturalmente arricchiti in CLA, anche se marginalmente, migliorano il metabolismo lipidico ed energetico. Lo studio sembra indicare che, nonostante il relativo alto contenuto di acidi grassi saturi, i formaggi naturalmente arricchiti in CLA, anche per il contenuto di altri importanti elementi nutrizionali, potrebbero essere inclusi nelle raccomandazioni dietetiche dei pazienti ipercolesterolemici.

2 Abstract Dietary intake of dairy products has often been claimed to increase cardiovascular disease due to their relative high content of saturated fatty acids. Experimental data however do not confirm this hypothesis probably for the concomitant presence of other components such as conjugated linoleic acid (CLA) which has been shown to positively modify lipid metabolism both in experimental models and humans. In order to verify whether dairy products naturally enriched in CLA are able to modify lipid metabolism, we recruited 20 hypercholesterolemic patients and instructed to eat 90g/day of CLA enriched cheese obtained from milk of sheep fed extruded linseed. Preliminary results show a trend of a decrease of LDL cholesterol, BMI, leptin and PUFA hydroperoxides, a marker of oxidative stress. Overall these data, if confirmed, demonstrate that CLA enriched products positively influence lipid and energy metabolism and despite their relative high content of saturated fatty acids may be recommended to be included in the diet of hypercholesterolemic patients. Keyword: cheese, conjugated linoleic acid (CLA), cholesterolemia Parole chiave: formaggio, acido linoleico coniugato (CLA), colesterolemia

3 Introduzione Il ruolo dei grassi nella dieta rappresenta un punto molto controverso: alcuni di essi sono considerati fattori di rischio cardiovascolare, mentre altri sono indispensabili per garantire l apporto calorico per l organismo, la funzione strutturale per le cellule ed altri importanti effetti biologici. Il confine tra nutrizionalmente utile e nocivo dipende dalla quantità e dal tipo di grasso assunto con la dieta. Infatti, i diversi acidi grassi hanno differenti proprietà e influenzano la produzione di molecole ad alta attività biologica le quali modulano il metabolismo lipidico, il bilancio energetico e la risposta infiammatoria. Tra i diversi acidi grassi riveste un ruolo di primo piano l acido linoleico coniugato, meglio conosciuto con l acronimo CLA dall Inglese Conjugated Linoleic Acid 1. Il CLA è un acido grasso inusuale presente naturalmente nella carne, nel latte e nei prodotti lattiero caseari, in quanto sintetizzato da batteri anaerobi presenti nel rumine. L alimentazione dei ruminanti basata esclusivamente su pascolo fresco arricchisce naturalmente il latte in CLA. Negli ultimi anni il CLA ha ottenuto considerevole attenzione per la sua capacità di modulare il metabolismo lipidico sia in modelli sperimentali che nell uomo 2. Le diverse attività biologiche del CLA sono in gran parte riconducibili alla sua capacità di ridurre la biosintesi degli eicosanoidi che sono alla base dell instaurarsi del processo infiammatorio. Ciò avviene poiché il CLA ed i suoi metaboliti si sostituiscono agli acidi linoleico, eicosatrienoico ed arachidonico nel metabolismo di sintesi degli eicosanoidi 2 3. Dai nostri studi preliminari sembrerebbe che in diversi modelli sperimentali, il CLA sia in grado di influenzare la formazione di eicosanoidi e l attività di recettori nucleari attraverso il quale modula il metabolismo lipidico e la distribuzione della massa grassa. In parallelo agli studi sugli animali, abbiamo condotto degli studi sull uomo. Una prima sperimentazione è stata da noi condotta nell ambito di uno studio europeo sulla produzione e sui possibili effetti nell uomo di prodotti lattiero-caseari naturalmente arricchiti in CLA. In questo studio era previsto che 4 partners, uno francese, un irlandese, uno scozzese ed uno sardo producessero un tipo di formaggio arricchito ed uno di controllo non arricchito. Lo studio sull uomo fu condotto su 40 volontari sani a cui furono somministrati i formaggi arricchiti e non, con uno studio cross-over in doppio cieco. Lo studio prevedeva la somministrazione di 50g/die di formaggio per 2 mesi. Prima della somministrazione del formaggio, sugli stessi pazienti abbiamo verificato se per il CLA esistesse una dose risposta, somministrando dosi crescenti di CLA sintetico e valutandone i livelli ematici. Nell arco di due anni lo studio si è concluso e stiamo finalizzando la pubblicazione. Dai risultati è emerso che il CLA è assorbito e metabolizzato in maniera dose dipendente e che l assunzione di 50 g/die di formaggio non determina nessuna modificazione del profilo lipidico. Ancora più interessante è stato il risultato ottenuto con il CLA sintetico dove sembra che dosi superiori ad 1 g/die determinavano un decremento significativo del colesterolo LDL. Questi dati ci hanno indotto a verificare se un formaggio ricco in CLA fosse in grado di modificare il profilo lipidico in pazienti ipercolesterolemici.

4 Materiali e Metodi Lo studio si proponeva da un lato di ottenere nuovi prodotti lattiero caseari in grado di contribuire, se inseriti nell ambito di una dieta equilibrata, alla prevenzione di alcune delle principali patologie croniche che affliggono le società sviluppate, dall altro di dimostrare che il grasso del latte e dei latticini, non necessariamente deve essere considerato un fattore di rischio per la salute. A tal fine, dopo alcune prove realizzate nelle sedi sperimentali delle strutture di appartenenza, si è proceduto a trasferire in ambito operativo le strategie di alimentazione messe a punto, organizzando una prova sperimentale in un allevamento commerciale di pecore da latte ubicato in provincia di Grosseto. I ricercatori hanno formulato un mangime sperimentale contenente semi di lino estrusi (una fonte naturale di precursori di CLA) da somministrare ad un gruppo di 24 pecore in lattazione messo a confronto con un altro gruppo di pecore cui veniva somministrato un mangime di controllo. Dopo 10 settimane di sperimentazione, durante le quali la produzione di latte e i parametri ematoclinici degli animali sono stati costantemente monitorati, al fine di verificare gli effetti del trattamento sulla produttività e sul benessere degli animali, il latte prodotto dai due gruppi è stato caseificato separatamente per ottenere circa 30 kg di caciotte per ciascun gruppo da utilizzare per la successiva parte della sperimentazione. Le caciotte ottenute sono state analizzate per caratterizzarne le proprietà chimico nutrizionali con particolare riguardo alla componente lipidica. L analisi degli acidi grassi presenti nel formaggio evidenziava che in quello ottenuto dalle pecore alimentate con il mangime contenente semi di lino vi era una diminuzione di quasi il 30% degli acidi grassi saturi e un aumento di acidi grassi omega-3 e di CLA rispettivamente del 200% e del 400%. Il formaggio ottenuto è stato utilizzato per la realizzazione della sperimentazione. Presso il Centro per le Malattie Dismetaboliche e l Arteriosclerosi della Az. Osp. G. Brotzu di Cagliari sono stati reclutati per lo studio pilota 20 pazienti adulti ipercolesterolemici a basso rischio c.v. (9 maschi e 11 femmine) a cui è stata somministrata una dieta standard con dosi decrescenti di formaggio arricchito (FA) seguita da una dieta con dosi crescenti di formaggio non arricchito (FNA) secondo il seguente schema: (FA 90g/die 21gg +wash-out 21gg, FA 45g/die 21gg +wash-out 21gg, FNA 45g/die 21gg +wash-out 21gg, FNA 90g/die 21gg).Criteri d inclusione: età (M.>18 aa. F. in menopausa); BMI <30; Col. tot.(ct) >200<300 mg/dl; Trigliceridemia (TG) 250 mg/dl; HDL-Col. 70 mg/dl; apoe= e3e3 (genotipo più comune in Sardegna non legato a particolari ipercolesterolemie familiari). Lo studio prevedeva l esclusione di soggetti affetti da nefropatia, cardiopatia ischemica, scompenso cardiaco, diabete, ipertensione in terapia non stabilizzata da almeno tre mesi, patologie tiroidee non compensate, intolleranza al lattosio. All inizio e alla fine di ogni fase del trattamento sono stati registrati peso, circonferenza vita e fianchi, pressione arteriosa e frequenza cardiaca e sono stati prelevati campioni di sangue per la valutazione dei seguenti parametri metabolici: CT, LDL-C, HDL-C, TG, glicemia, creatinina, uricemia, ALT, AST, γ-gt, CK, Apo A1, ApoB. Per l analisi statistica è stato utilizzato l ANOVA.

5 Risultati Durante lo studio non sono state riscontrate modificazioni statisticamente significative dei parametri della funzionalità epatica e renale. che la somministrazione giornaliera di 90g per 21 giorni di formaggio arricchito in CLA induca un aumento significativo dei livelli plasmatici dell acido vaccenico (circa il 300% del controllo), del CLA (circa 300% del controllo), dell acido alfa linolenico coniugato (CALA) (circa il 400% del controllo ) e dell acido alfa linolenico (circa il 150% del controllo). Dai dati ancora preliminari, si nota un tendenza alla diminuzione di circa il 40% dei PUFA idroperossidi, marker di stress ossidativo e una marginale diminuzione del 7% del colesterolo LDL, dell 1% del BMI e 5% della leptina plasmatica. Discussione I nostri dati, anche se ancora preliminari, suggeriscono che i formaggi naturalmente arricchiti in CLA, anche se marginalmente, migliorano il profilo lipidico e la distribuzione della massa grassa, in associazione all incremento a livello plasmatico degli acidi grassi di cui sono arricchiti i formaggi somministrati. Inoltre sembra che l introduzione nella dieta di formaggio naturalmente arricchito in CLA abbia anche un effetto su alcuni parametri di stress ossidativo. Questo dato sembra confermare dati recenti in cui abbiamo riscontrato che il CLA influenza il metabolismo di alcuni marker di stress ossidativo 4. Un altro dato importante ancora da verificare è se l incremento dell apporto di CLA possa aumentare l assorbimento della Vitamina A. Infatti, in diversi modelli sperimentali abbiamo riscontrato un aumento di retinolo plasmatico e tissutale conseguente all apporto alimentare di CLA 5-7. Bisogna inoltre sottolineare che questi risultati sono stati ottenuti a seguito della somministrazione di formaggio in aggiunta al normale regime alimentare dei soggetti e non in sostituzione di altri alimenti. Lo studio sembra indicare che, nonostante il relativo alto contenuto di acidi grassi saturi, i formaggi naturalmente arricchiti in CLA, anche per il contenuto di altri importanti elementi nutrizionali, potrebbero essere inclusi nelle raccomandazioni dietetiche dei pazienti ipercolesterolemici. Bibliografia 1. M. P. Yurawecz, J. K.G. Kramer, S. Banni, Gudmundsen O, Pariza MW. Advances in conjugated linoleic acid research. Champaign, IL, USA: AOCS Press, Banni S. Conjugated linoleic acid metabolism. Curr Opin Lipidol 2002;13(3): Banni S, Angioni E, Casu V, Melis MP, Carta G, Corongiu FP, et al. Decrease in linoleic acid metabolites as a potential mechanism in cancer risk reduction by conjugated linoleic acid. Carcinogenesis 1999;20(6): Iannone A, Petroni A, Murru E, Cordeddu L, Carta G, Melis MP, et al. Impairment of 8-iso-PGF(2ALPHA) isoprostane metabolism by dietary conjugated linoleic acid (CLA). Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2009;80(5-6): Ortiz B, Wassef L, Shabrova E, Cordeddu L, Banni S, Quadro L. Hepatic retinol secretion and storage are altered by dietary CLA: common and distinct actions of CLA c9,t11 and t10,c12 isomers. J Lipid Res 2009;50(11): Carta G, Angioni E, Murru E, Melis MP, Spada S, Banni S. Modulation of lipid metabolism and vitamin A by conjugated linoleic acid. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2002;67(2-3):

6 7. Banni S, Angioni E, Casu V, Melis MP, Scrugli S, Carta G, et al. An increase in vitamin A status by the feeding of conjugated linoleic acid. Nutr Cancer 1999;33(1):53-7. Ringraziamenti Studio finanziato dai Ministeri dell Economia e delle Finanze, dell Istruzione, Università e Ricerca, dell Ambiente, della Tutela del Territorio, delle Politiche Agricole e Forestali col Progetto FISR Fondo Integrativo Speciale Ricerca Qualità dei prodotti di origine animale e salute umana: miglioramento della frazione lipidica e minerale del latte e dei latticini di vacca, pecora e capra al fine di accrescere il valore nutraceutico e la sicurezza di questi alimenti..