La diagnostica di laboratorio dei tumori endocrini pancreatici (Rassegna)

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1 La diagnostica di laboratorio dei tumori endocrini pancreatici (Rassegna) Ettore Seregni 1, Alice Lorenzoni 1, Luca Giovanella 2 1SSD Terapia medico-nucleare ed Endocrinologia Istituto Nazionale Tumori, Milano 2Medicina Nucleare e Centro PET/CT Istituto Oncologico della Svizzera Italiana, Bellinzona (CH) INTRODUZIONE La diagnostica di laboratorio applicata alla valutazione delle neoplasie endocrine del pancreas possiede caratteristiche peculiari dovute alla bassa incidenza di queste neoplasie ed alla loro attitudine a sintetizzare ed a rilasciare nel circolo sanguigno molecole dotate di attività biologica. Lo sviluppo delle tecniche di dosaggio immunometrico, ha reso possibile la valutazione routinaria della maggior parte dei prodotti di secrezione di queste neoplasie. Tali analiti possono essere misurati nel sangue od in altri fluidi biologici, in condizioni basali o, meno frequentemente, in condizioni dinamiche attraverso l esecuzione di specifici test di stimolo o di inibizione. Il dosaggio di questi analiti può fornire informazioni aggiuntive utili per l inquadramento diagnostico e prognostico della malattia. La diagnostica di laboratorio di queste neoplasie può avvalersi del riconoscimento degli elementi caratterizzanti la specifica sindrome ormonale (ad esempio, iperinsulinemia ed ipoglicemia nell insulinoma) oppure può ricorrere alla dimostrazione di elementi comuni alle singole manifestazioni sindromiche, legate quindi alla loro propensione ipersecretiva. Il dosaggio della CgA rappresenta, come subito discusso, tale comune denominatore. CROMOGRANINA A Aspetti strutturali e funzionali La CgA rappresenta la molecola meglio definita e più studiata della famiglia delle granine, gruppo di proteine acide, solubili in acqua che si rinvengono all interno dei granuli densi di secrezione delle cellule endocrine e neurondocrine. Questa famiglia di proteine si caratterizza per la composizione aminoacidica ricca in aminoacidi acidi, l aggregazione a basso ph e per un elevata capacità di legare calcio ioni 1-3. La funzione biologica delle cromogranine in generale e della CgA non è completamente definita. Evidenze suggeriscono che la CgA possa essere coinvolta nel processo di granulo-genesi associata alla maturazione dei prodotti di secrezione presenti nei granuli stessi e, soprattutto, che possa rappresentare un precursore (pro-ormone) per molecole a più basso peso molecolare dotate di peculiari attività biologiche. Sotto il profilo biochimico la CgA è costituita da 439 aminoacidi, con peso molecolare di 48 kda, e nel corso dei processi di maturazione post-traduzionali subisce reazioni di carbossimetilazione, glicosilazione, fosforilazione e solfatazione. Il gene, posto sulla regione 14q32.12, è costituito da 8 esoni che danno origine ad un trascritto di circa 2000 nucleotidi. Un ruolo importante nel controllo trascrizionale di tale gene è esercitato dagli ormoni steroidei che ne possono regolare, sia positivamente che negativamente, l espressione. Oltre agli steroidi, altri messaggeri intracellulari, come il calcio, la protein-chinasi A e la protein-chinasi C, possono regolare la biosintesi della CgA. Una volta sintetizzata la molecola viene trasportata nel reticolo endoplasmatico rugoso e quindi nell apparato di Golgi. A livello del trans-golgi la CgA si accumula, in associazione ad ormoni e a neurotrasmettitori, nei granuli densi di secrezione. E importante sottolineare che in questa fase la CgA può essere clivata in peptidi a diverso peso molecolare per azione di enzimi proteolitici che frammentano la molecola a livello di sequenze mono o dibasiche presenti nella sequenza della stessa CgA. Altrettanto importante è il fatto che questa proteolisi controllata assume un discreto grado di tessuto specificità. Il contenuto dei granuli viene riversato all esterno dell ambiente cellulare attraverso un processo di esocitosi che può avvenire con due differenti modalità, una in forma costitutiva, cioè continua, e l altra in forma regolata, cioè posta sotto il controllo di stimoli adeguati. Evidenze sperimentali indicano che la CgA svolge un ruolo importante nel determinare il secondo di tipo di secrezione comportando una precipitazione ph e calcio-mediata dei prodotti di secrezione all interno dei granuli 4,5. Come menzionato la CgA costituisce anche il precursore per diversi ormoni peptici. I più definiti sono la pancreastatina (CgA ), la vasostatina 1 (CgA 1-76), la vasostatina 2 (CgA 1-113), la parastatina (CgA ), la catestatina (CgA ), la cromostatina (CgA ) 6-8. Le principali azioni biologiche di questi ormoni sono riportate in tabella 1. La CgA non si rinviene alle medesime concentrazioni in tutti i tessuti endocrini e neuroendocrini: le più alte concentrazioni sono a livello dei granuli cromaffini della midollare surrenalica e dei granuli densi dei nervi simpatici. Inoltre, quantità progressivamente decrescenti di CgA si rinvengono a carico dell ipofisi> pancreas > stomaco> piccolo intestino > paratiroide > tiroide. Indicazioni all utilizzo della CgA nella diagnostica dei tumori endocrini pancreatici Essendo, come descritto, un prodotto della cellula endocrina/neuroendocrina la Cga può essere utilizzata con finalità diagnostiche per definire questo gruppo di neoplasie A livello immunoistochimico il riconoscimento della CgA è ampiamente utilizzato per riconoscere la natura e l origine neuroendocrina di una neoplasia, mentre la CgA circolante rappresenta il marcatore tumorale che viene determinato con maggior affidabilità e semplicità nei pazienti potatori di neoplasie neuroendocrine. La CgA viene normalmente misurata nel siero o plasma utilizzando tecniche immunometriche. Sono al momento disponibi- 248 LigandAssay 18 (3) 2013

2 Tabella 1 Molecole derivanti da proteolisi della CgA Molecola Frammento Azione biologica pancreastatina CgA inibizione secrezione di insulina stimolazione glicogenolisi epatica inibizione secrezione amilasi pancreatica inibizione secrezione acida-gastrica inibizione secrezione ormone paratiroideo vasostatina CgA 1-76 inotropa negativa integrità endoteliale inibizione vasocostrizione inibizione neo-angiogenesi inibizione attività muscolare gastro-intestinale attivazione microglia parastatina CgA inibizione secrezione di ormone paratiroideo inibizione secrezione insulina catestatina CgA inibizione secrezione catecolamine stimolazione mastociti e granulociti polimorfonucleati inibizione crescita batteri, miceti e lieviti cromostatina CgA inibizione secrezione catecolamine Tabella 2 Test diagnostici per il dosaggio della CgA Test Reattivi Metodo Epitopi bersaglio CgA-RIA CT (CISbio International, Gif-sur- Yvette, France) a DAKO CgA ELISA Kit (DAKO A/S, Glostrup, Denmark) Chromogranin A Neolisa (Euro Diagnostica, Malmo, Sweden) anticorpi monoclonali IRMA regione ; regione anticorpi policlonali ELISA frammento C-terminale anticorpi monoclonali ELISA regione EDI Kit ELISA CgA (Epitope Diagnostics, Inc. San Diego, USA) KRYPTOR CgA (BRAHMS GmbH, Thermo Scientific, Germany) anticorpi monoclonali (molecola intatta e frammento C-terminale) anticorpi policlonali (frammento C-terminale) ELISA non dichiarati anticorpi monoclonali TRACE b non dichiarati a: disponibile anche con metodica ELISA su micro piastra b:trace: Time Resolved Amplified Cryptate Emission li differenti metodi di dosaggio della CgA Le caratteristiche dei più diffusi metodi per la rilevazione della CgA sono riportate in tabella 2. E importante ricordare che tali metodi, oltre a differenziarsi per l impiego di differenti traccianti (radioattivo, enzimatico, luminescente) si discostano tra loro anche per l impiego dei reagenti anticorpali utilizzati che possono riconoscere porzioni differenti della molecola della CgA. Da ciò si ricava come nella pratica clinica sia fondamentale utilizzare sempre lo stesso metodo per monitorare il singolo paziente con neoplasia neuroendocrina. Inoltre, anche nel singolo individuo la CgA presenta un elevato grado di variabilità biologica (fino al 25%) per cui è raccomandabile che il prelievo venga sempre eseguito in condizioni standardizzate (raccomandabile, al mattino e a digiuno) 16. Il dosaggio della CgA è stato proposto in diversi momenti diagnostici: 1) diagnosi di neoplasia neuroendocrina in paziente poratore di sintomatologia potenzialmente suggestiva per tale neoplasia; 2) bilancio di malattia nel paziente con diagnosi accertata di neoplasia neuroendocrina; 3) sorveglianza del follow-up; 4) monitoraggio delle terapia. E importante ricordare e sottolineare come l utilizzo del dosaggio della CgA per la diagnosi di tumore neuroendocrino debba essere rigorosamente evitato. Infatti, molti tumori in fase iniziale, cioè con interessamento solo loco-regionale, non determinano apprezzabili innalzamenti del marcatore, ma soprattutto la valutazione del marcatore puo fornire risultati falsamente positivi. Numerose e, nello stesso tempo comuni, sono, infatti, le cause di falsa positività del dosaggio della CgA: tra queste ricordiamo le malattie infiammatorie, l ipertensione arteriosa, l insufficienza renale (anche di modico grado), l insufficienza cardiaca ed epatica. Inoltre, anche taluni farmaci come gli inibitori pompa protonica posono determinare innalzamenti non neoplastici del marcatore Una descrizione di tali condizioni di falsa positività è riportata in tabella 3. In queste situazioni, il riscontro di valori elevati di CgA circolante induce necessariamente l adozione di esami diagnostici LigandAssay 18 (3)

3 Tabella 3 Cause non tumorali di elevazione della CgA circolante Malattie infiammatorie Affezioni gastro-intestinali Malattie cardio-vascolari Affezioni renali Trattamenti farmacologici strumentali di secondo livello (tomografia computerizzata, risonanza magnetica, tomografie ad emissione di positroni, scintigrafie etc.) che oltre ad essere onerose da un punto di vista economico, possono non essere scevre da morbilità. Nei tumori neuroendocrini in fase avanzata il dosaggio della CgA possiede una sensibilità diagnostica compresa tra il 70 e il 90%. I più alti valori di sensibilità diagnostica associati alle più elevate concentrazioni di CgA circolanti si rinvengono nei tumori metastatici del tratto intestinale intermedio midgut (i classici carcinoidi, come nel passato erano definiti tali tumori), del pancreas endocrino e soprattutto nei pazienti portatori sindrome MEN-1. In questi pazienti le concentrazioni di CgA correlano con l estensione e con l interessamento ghiandolare raggiungendo i valori più elevati alla comparsa di una neoplasia neuroendocrina del tratto gastro-entero pancreatico. Nei pazienti con sindrome MEN-1, pertanto, il dosaggio della CgA costituisce un imprescindibile strumento di monitoraggio clinico. Una volta accertata la presenza di una neoplasia neuroendocrina il dosaggio della CgA rappresenta un importante indice prognostico. A questo riguardo è stato dimostrato che pazienti portatori di neoplasie neuroendocrine in fase avanzata che presentano all esordio valori di CgA inferiori al doppio del valore massimo di riferimento presentano una sopravvivenza decisamente superiore rispetto ai pazienti con elevati valori del marcatore. Esiste un ampio consenso sul fatto che il principale ruolo clinico del dosaggio della CgA debba essere ricercato nel monitoraggio delle terapie antineoplastiche e nella sorveglianza dei pazienti in follow-up. In queste situazioni le modificazioni delle concentrazioni di CgA circolante riflettono analoghe variazioni del carico tumorale e, pertanto, il dosaggio del marcatore costituisce un semplice ed economico strumento di monitoraggio PPoma artrite reumatoide bronchiti croniche sepsi gastrite cronica atrofica pancreatiti acute e croniche retto-colite ulcerosa sindrome del colon irritabile epatite cronica cirrosi epatica insufficienza epatica ipertensione arteriosa insufficienza cardiaca cardiopatia ischemica insufficienza renale inibitori di pompa protonica H 2 antagonisti (cimetidina) farmaci anti-ipertensivi Merita di essere considerato in questa sede in quanto i tumori pancreatici secernenti tale ormone non determinano una specifica sindrome clinica. È caratterizzato da elevati livelli plasmatici dell ormone polipeptidico pancreatico (PP). Tuttavia la dimostrazione di elevati livelli di PP non è diagnostica di PPoma, in quanto l ormone si può riscontrare in circolo a livelli superiori alla norma anche in pazienti con altre neoplasie del pancreas endocrino, con tumori neuroendocrini del tratto gastroentererico ed in numerose situazioni non neoplastiche. Nei tumori pancreatici classicamente considerati come funzionanti, il PP risulta elevato, a seconda delle casistiche, nel 25-70% dei casi. Questi dati ci inducono a considerare il PP come un marcatore generico di neuroendocrinia. Nelle condizioni non legate ad una patologia neoplastica, il PP può raggiungere elevate concentrazioni nelle patologie infiammatorie croniche, nell insufficienza renale, nel diabete, nei soggetti alcoolisti e nell età avanzata 27. DIAGNOSTICA BIOCHIMICA DEI SINGOLI TUMORI ENDOCRINI PANCREATICI Gastrinoma Rappresenta l istotipo caratterizzante la sindrome di Zollinger-Ellison. I tumori associati a tale sindrome originano principalmente in una zona circoscritta definita triangolo del gastrinoma che comprende la testa del pancreas e la II-III porzione duodenale 28. Clinicamente la sindrome è sostenuta da ipersecrezione di acido cloridrico da parte delle cellule oxintiche dello stomaco e si manifesta con la presenza di ulcere gastro-duodenali, dolori addominali e diarrea. Sotto il profilo laboratoristico si configura con ipergastrinemia a digiuno associata ad un elevato valore di secrezione acida gastrica basale (BAO). Valori di gastrinemia a digiuno > 1000 pg/ml e di BAO < 15 meq/h sono diagnostici di gastrinoma. Tuttavia in circa due terzi dei pazienti con gastrinoma non vengono raggiunte concentrazioni di gastrinemia superiori a tale soglia ed, inoltre, elevate concentrazioni di gastrina possono osservarsi in situazioni diverse quali quelle condizionanti un iperplasia od un iperfunzione delle cellule G dell antro gastrico 29. Per queste ragioni la rilevazione della semplice gastrinemia basale ha perso rilevanza diagnostica e il test di riferimento è attualmente costituto dal test provocativo e dinamico con secretina ll test con secretina è semplice, riproducibile, predittivo ed esente da effetti collaterali. Vengono iniettate 2 U/Kg di secretina in bolo e.v. e vengono effettuati dei prelievi 15 minuti prima dello stimolo, al tempo 0 e poi a 2, 5, e 20 minuti dopo l iniezione. Il test viene considerato positivo per la presenza di gastrinoma in caso di incrementi della gastrinemia di almeno 200 pg/ml rispetto ai valori basali. Falsi negativi possono essere riscontrati nei pazienti portatori di gastrinoma indifferenziato in cui viene persa l espressione dei recettori per la secretina. Insulinoma Gli insulinomi sono i più frequenti tumori pancreatici secernenti. Sono neoplasie spesso benigne, infatti le forme maligne rappresentano solamente il 10% dei casi 33. Clinicamente l insulinoma è caratterizzato dalla triade di Wipple: crisi ipoglicemiche a digiuno (con manifestazioni neuroglicopeniche come irritabilità, agitazione, confusione mentale e da attivazione adrenergica, come ansia, tremo- 250 LigandAssay 18 (3) 2013

4 re, sudorazione e tachicardia), marcata ipoglicemia (< 40 mg/dl) durante la crisi, risoluzione della crisi stessa dopo assunzione di cibo o zuccheri. Tuttavia, una franca ipoglicemia è riscontrabile solo in una minoranza dei pazienti (meno del 40% dei casi) anche se un inappropriata secrezione di insulina è presente in una più elevata percentuale di pazienti. Per questo motivo, nel sospetto di insulinoma si impone l esecuzione del test del digiuno Nel soggetto normale, il digiuno protratto induce un inibizione della secrezione di insulina finalizzata a contrastare la sua azione ipoglicemizzante; nel paziente affetto da insulinoma la secrezione di insulina è autonoma e va a determinare un ulteriore riduzione dei livelli glicemici fino alla comparsa della sintomatologia specifica. La prova del digiuno deve essere eseguita in regime di ricovero sia per consentire un monitoraggio frequente della glicemia e dell insulinemia (prelievi ogni 2 ore, anche più ravvicinati in caso di severa ipoglicemia) sia per poter intervenire prontamente e sospendere il test alla comparsa della prima sintomatologia o a valori glicemici <40 mg/dl. Nel 75% dei pazienti affetti da insulinoma questo avviene entro le prime 24 ore dall inizio dell esame, nel 95% entro le prime 48 ore e pressochè in tutti i pazienti entro 72 ore. Il test viene considerato positivo per la presenza di un insulinoma quando il rapporto tra insulina plasmatica e glicemia risulta > 0,3. VIPoma Caratterizza la sindrome di Verner-Morrison e si manifesta con diarrea acquosa che può essere di notevole entità (fino a 20 litri al giorno). Laboratoristicamente questa neoplasia si configura con ipokaliemia (presente nel 100% dei casi), ipocloridria (70%), entrambe secondarie alla perdita di elettroliti per via enterica (diarrea secretoria), ipercalcemia (40%) ed iperglicemia (20%) 37. La diagnosi di VIPoma richiede la dimostrazione di elevate concentrazioni plasmatiche del peptide vasointestinale (VIP). Il dosaggio del VIP necessita di alcuni accorgimenti a causa della estrema labilità della proteina che può andare facilmente incontro a degradazione proteolitica. Inoltre, aumentati valori di VIP possono osservarsi anche nelle condizioni di insufficienza epatica e renale, nell infarto miocardico, nell ischemia intestinale e nella diarrea da abuso di lassativi o nei pazienti affetti da AIDS. Glucagonoma Configura la sindrome di Becker. Questa rara neoplasia (< 2% di tutti i tumori endocrini del tratto gastro-enteropancreatico) origina quasi esclusivamente dal pancreas e nei pazienti affetti è presente in oltre il 90% dei casi un affezione dermatologica patognomonica, l eritema necrolitico migrante che può precedere anche di alcuni anni la dimostrazione della neoplasia 38. Il laboratorio dimostra iperglicemia, ipoamminoacidemia e, soprattutto, un innalzamento delle concentrazioni plasmatiche di glucagone. In condizioni normali la glucagononemia non supera i 200 pg/ml, mentre nei pazienti portatori di glucagonoma questa supera generalmente i 500 pg/ml. Nei rari casi di glucagonoma con concentrazioni ormonali <500 pg/ml bisogna escludere altre condizioni che possono causare iperglucagonemia quali, ad esempio, insufficienza renale cronica, insufficienza epatica, pancreatite acuta, acromegalia, ipercorticosurrenalismo etc. Altre neoplasie endocrine del pancreas A completamento della trattazione ricordiamo che sono stati più raramente descritti anche altri tumori pancreatici secernenti. Tra questi quelli relativamente più frequenti sono il somatostinoma (caratterizzato da diarrea, diabete mellito, colelitiasi e da elevate concentrazioni di somatostatina circolante), il GRHoma e l ACTHoma. CONCLUSIONI I tumori endocrini del pancreas, come discusso in questa rassagna, possono essere distinti in tumori funzionanti e non-funzionanti esclusivamente sulla base del fatto che siano in grado di determinare o meno una specifica sintomatologia clinica da ipersecrezione ormonale. La distinzione è operativa ed, essenzialmente clinica, in quanto anche i tumori non-funzionanti possono risultare positivi a livello tessutali per ormoni: in questo caso tali prodotti possono essere sintetizzati, ma non secreti o secreti in quantità non significative oppure tali molecole sono clinicamente ininfluenti, come nel discusso caso del polipeptide pancreatico. Abbiamo a disposizione numerose Linee Guida che orientano le nostre decisioni diagnostiche e terapeutiche nella gestione dei pazienti affetti da neoplasie endocrine del pancreas. Le più diffuse ed autorevoli sono quelle prodotte dall European NeuroEndocrine Society (ENETS), North American NeuroEndocrine Tumor Society (NANETS), National Comprehensive Cancer Network (NCCN), e dall European Society Medical Oncology (ESMO) Nel loro complesso le indicazioni fornite da queste società scientifiche sono abbastanza concordanti anche se differente enfasi ed importanza viene attribuita alla mandatorietà di eseguire la determinazione di uno specifico marcatore nel particolare momento del percorso diagnostico del paziente con tumore neuroendocrino. A titolo non solo esemplificativo, ma anche per la vicinanza culturale di chi scrive, si riportano le indicazioni della ENETS. Nei tumori non funzionanti: Il marcatore di riferimento è la CgA Altre molecole (quali NSE, HCG, PP) rivestono un ruolo marginale Attenzione agli aspetti pre-analitici del dosaggio della CgA (scelta del metodo, standardizzazione del prelievo, attenzione a tutte le cause di false positività etc.) Non utilizzo del dosaggio della CgA per la diagnosi di tumore neuroendocrino Utilità della CgA nel bilancio di malattia alla diagnosi (indice prognostico), nel monitoraggio dei trattamenti e nella sorveglianza del follow-up Nei tumori funzionanti: Utilizzare quando è possibile i marcatori specifici o i parametri di laboratorio caratterizzanti la sindrome Ruolo complementare del dosaggio della CgA. LigandAssay 18 (3)

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