L utilizzo delle tecniche in vitro per le piante grasse e succulente

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1 REPORT TECNICO: L utilizzo delle tecniche in vitro per le piante grasse e succulente La possibilità poter sporre prodotti innovativi, Cos è la micropropagazione? risulta fondamentale per mantenere la vitalità del settore delle piante succulente, soprattutto in questo Una delle applicazioni più importanti della periodo crisi generalizzata, dove si registra una coltura in vitro è la micropropagazione, tecnica pressione competitiva sempre maggiore da parte paesi in cui la manodopera costa meno o che presentano selezionati. Allo scopo ottenere una rapida conzioni climatiche più favorevoli. moltiplicazione partendo da una porzione del propagazione vegetativa genotipi vegetale (organo, tessuto, etc.), viene indotta la In tale contesto, appare estremo interesse poter proliferazione germogli su un mezzo sporre sistemi propagazione rapi, come la coltura idoneo, composto sali minerali, micropropagazione, introdurre vitamine, zuccheri e ormoni ed incubato in velocemente novità in una catena produzione conzioni crescita artificiali, lavorando in massale, sia meante una retta produzione ex vitro, sterilità. al fine poter sia attraverso la costituzione piante madri ex vitro da cui sviluppare successivamente la produzione massale Questa moltiplicazione può realizzarsi a partire piante in vivo. da germogli Generalmente, ascellari il o propagatore, avventizi. al fine L Istituto Regionale per la Floricoltura Sanremo, garantire che già in passato ha realizzato un attività supporto al propagazione comparto delle piante succulente, tramite la realizzazione (ottenimento cloni), preferisce rivolgersi alla analisi fitopatologi nell ambito del servizio LaRAF, a proliferazione mentre la partire dal 2011 ha iniziato anche un attività proliferazione per germogli avventizi può propagazione in vitro piante succulente, mettendo determinare a frutto l esperienza già acquisita con altre piante (piante verse da pianta madre). la massima possibilità conforme ascellare, un elevata all originale instabilità genetica ornamentali. In questi ultimi anni, le tecniche coltura in vitro sono state applicate per molte piante succulente, ed a pagina 8 è riportato un breve elenco bibliografico alcuni questi stu ed applicazioni. Tale comparto è però estremamente variegato, si è reso per tanto necessario sviluppare competenze ad hoc per le specie selezionate interesse per il territorio.

2 Vantaggi La micropropagazione può permettere: - avviare un ciclo propagazione a partire anche da una sola pianta o parte pianta; questa potenzialità risulta vantaggiosa soprattutto per quegli invidui rari o unici, nuovi ibri o invidui frutto mutazioni che presentano per esempio forme o variegature particolari, sempre molto ricercate dal mercato (es. forme crestate, chimere); - ottenere tassi moltiplicazione assai elevati, non perseguibili con le tecniche trazionali propagazione (da seme, per talea, innesto) e fondamentali sia per una produzione tipo massale, sia per incrementare la sponibilità invidui rari, specie a rischio estinzione o specie particolarmente problematiche che presentano capacità riproduttiva limitata e tassi crescita molto lenti; questa particolarità è determinata dal fatto che si è svincolati dalle stagioni e dal normale ciclo vitale della pianta (Gonzales and Serpa, 1992) e quin la moltiplicazione può essere condotta tutto l anno. Inoltre, l impiego dei fitoregolatori nel mezzo colturale potenzia il processo moltiplicazione o lo rende fattibile per le specie recalcitranti; questa potenzialità risulta vantaggiosa soprattutto per poter moltiplicare e contemporaneamente salvaguardare specie a rischio estinzione (a causa dell eccessiva raccolta e sfruttamento delle pianti madri, struzione del loro habitat naturale, cambiamenti climatici, etc.) (Fay, 1992; Malda et al., 1999); ne è un esempio Mammillaria hernandezii, una specie che nel 1980, grazie all applicazione un protocollo micropropagazione, ha avuto una produzione in grado sodsfare la richiesta piante da parte del mercato, ma anche ridurre il rischio estinzione con la creazione collezioni fuori dal loro habitat naturale (collezione ex situ, Grantham et al., 1999); - essere una valida alternativa quando nella propagazione in vivo si osservano marcescenze delle talee durante la racazione con conseguente scarso attecchimento; - effettuate semine in vitro che portano allo sviluppo della pianta da seme in tempi raccorciati rispetto alla riproduzione sessuale trazionale e favoriscono una migliore efficienza nella gestione del materiale vegetale nelle prime fasi sviluppo; - avere un accorciamento del ciclo, rispetto alla riproduzione per seme, circa un anno, come riportato per la moltiplicazione clonale in vitro Mammillaria woodsii (Kolar et al., 1976); - moltiplicare piante esenti da patogeni e, meante la coltura apici meristematici, produrre piante esenti da infezioni virali. Questi vantaggi introdotti dalla micropropagazione possono, riassumendo, favorire una rapida introduzione novità sul mercato.

3 Svantaggi Tuttavia, accanto a questi inscutibili vantaggi che la micropropagazione può apportare al settore delle piante succulente, bisogna tenere in considerazioni anche alcuni fattori limitanti, riscontrati nella sua applicazione, come registrato anche per altre colture: - costi maggiori rispetto alle classiche tecniche moltiplicazione determinati sia dalla necessità ammortizzare il costo elevato iniziale dovuto alla realizzazione del laboratorio commerciale, sia dal costo della manodopera specializzata inspensabile al processo; - recalcitranza alla coltura in vitro per alcune specie, seppure selezionate per il particolare interesse economico; - possibilità ottenere varianti somaclonali; gli elevati tassi moltiplicazione possono infatti provocare una rapida moltiplicazione genotipi variati, in particolare in presenza una moltiplicazione avventizia. La presenza varianti somaclonali, vicerversa, può essere importante per la ricerca prodotti nuovi rivolti non solo al grande pubblico, ma anche al mondo dei collezionisti che sono sempre alla ricerca novità, dello strano e non necessariamente del bello. Le modalità micropropagazione La tecnica micropropagazione prevede la realizzazione verse fasi: - Fase 0 o fase preparazione della pianta madre, in cui, dopo la selezione (Fase00) della pianta madre, la medesima pianta da cui inizierà la coltura in vitro viene coltivata in conzioni fitosanitarie che favoriscano l ottenimento successivo espianti reattivi ed asettici. - Fase I o fase d inoculo in vitro e stabilizzazione della coltura asettica, consiste nel prelievo, sinfezione dell espianto e stabilizzazione della coltura asettica. - Fase II o fase moltiplicazione, consiste nella ripetuta moltiplicazione in vitro dei germogli, attraverso perioche subcolture che prevedono la sudvisione dei germogli e il loro trasferimento su un substrato colturale fresco; per ottimizzare questa fase è necessario valutare la composizione del substrato crescita (fitoregolatori, sali minerali, etc.), ma anche altri fattori crescita come luminosità e temperatura. - Fase III o fase racazione, consiste nella formazioni delle raci e quin nell ottenimento una piantina morfologicamente completa; questa fase può essere indotta in vitro, tramite l utilizzo un appropriato substrato coltura (utilizzo auxine, carbone attivo, etc.), ma anche rettamente in vivo. - Fase IV o fase ambientamento, prevede l adattamento progressivo delle plantule alle conzioni crescita in vivo (in serra o in campo), limitando al massimo lo stress che la pianta deve subire passando dalle particolari conzioni coltura in vitro (temperatura e illuminazione controllata, elevata umità relativa) a quelle vivo.

4 La micropropagazione piante succulente condotta presso l Istituto Regionale per la Floricoltura Sanremo Da bibliografia, gli stu condotti sulla micropropagazione delle piante succulente risultano in numero esiguo, soprattutto perchè si tratta un gruppo piante estremamente versificato per cui anche le conoscenze già acquisite non possono essere facilmente generalizzate. Risulta solitamente necessario, ogni volta che si seleziona una specie particolare interesse inviduare un protocollo con prove sperimentale per valutare le verse fasi e nello specifico i substrati colturali ottimali, le modalità lavorazione delle piante, etc. Presso il nostro laboratorio, tramite la collaborazione con aziende locali, sono state selezionate 25 specie particolare pregio ed interesse commerciale, per le quali risulta particolare interesse l applicazione delle tecniche in vitro. Per 10 specie è stato già inviduato un protocollo ottimale e per 8 queste abbiamo già realizzato nel 2013 delle consegne materiale alle aziende, mentre per le altre specie siamo ancora in fase valutazione. Di seguito, a titolo esempio, è stato riportato un protocollo micropropagazione da noi realizzato (si sottolinea che le tempistiche riportate, così come i risultati ottenuti, sono relativi alla specifica specie sotto incata, mentre per altre risultati e tempistiche). Protocollo Crassula x starburst Specie: Crassula x starburst Famiglia: Crassulaceae Genere: Crassula Descrizione: Pianta compatta, cespitosa, con foglie triangolari corte, sessili, inserite su steli e strettamente sovrapposte lungo quattro linee a formare colonne quadrangolari color verde scuro. Note: è un ibrido tra Crassula ausensis e Crassula pyramidalis. Motivazione alla base della sua scelta: pur presentando una screto tasso moltiplicazione con le normali tecniche propagazione in vivo (taleaggio del fusto), un azienda locale l ha selezionata e consegnata al nostro ente per poter valutare l applicabilità un protocollo micropropagazione, allo scopo ottenere un stock base piante madri in tempi più rapi e conseguenza una più veloce immissione sul mercato con numeri cospicui.

5 Fase 0-Selezione e preparazione pianta madre: l azienda che ci ha richiesto la propagazione in vitro questa specie l ha selezionata per le sue caratteristiche ornamentali. In totale sono state selezionate e fornite al nostro ente 2 piante madri, che dopo alcuni giorni permanenza nelle nostre serre, senza subire particolari trattamenti per favorirne la successiva coltura asettica, sono state utilizzate per il prelievo degli espianti. Fase I-inoculo in vitro (~2 mesi): si è deciso confrontare l utilizzo 2 tipologie materiale inoculo, la semplice foglia e porzioni fusto con gemme apicali o ascellari, per un totale 60 inoculi. Sono state inoltre confrontate verse modalità sterilizzazione e versi substrati colturali d inoculo. Non si sono riscontrate fferenze significative tra le verse modalità sterilizzazione, né nell utilizzo dei versi substrati inoculo. L utilizzo delle singole foglie come inoculo ha dato migliori risultati rispetto alla porzione fusto con gemme apicali e ascellari: le foglie risultano infatti più facilmente sterilizzabili (valori riuscita della sterilizzazione del 75%) e iniziano subito a moltiplicare (da una foglia ottenute già al primo trasferimento in mea 4 plantule, mentre dal fusto con gemme apicali o ascellari solo 2). In totale sono risultati ottimali e reattivi 33 inoculi, che hanno iniziato a moltiplicare già dal primo trasferimento. Fase II-moltiplicazione (~10 mesi): il materiale ha iniziato a moltiplicare già dal primo trasferimento. Ogni 8 settimane i nuovi germogli sono stati visi e trasferiti su un substrato colturale fresco. In questa fase abbiamo valutato versi substrati culturali, alcuni hanno dato fenomeni iperidricità che hanno portato alla perta piante, ma siamo riusciti ad inviduare un substrato colturale che permette uno sviluppo ottimale della pianta e con il quale si ottengono da 1 pianta in mea 3 piante ad ogni trasferimento. In un anno dall introduzione in vitro siamo riusciti ad ottenere più 1000 piante da due piante madri partenza.

6 Fase III-racazione (~2 settimane): è stata osservata racazione su tutti i substrati colturali utilizzati in fase moltiplicazione, non è stato pertanto necessario realizzare specifiche prove per valutare un substrato colturale racazione. Fase IV-ambientamento(~3 settimane): questa fase prevede l adattamento progressivo delle plantule alle conzioni crescita in vivo ed è stata realizzata in serra, sotto tunnel in plastica che gradatamente è stato aperto per limitare al massimo lo stress che la pianta deve subire passando dalle particolari conzioni coltura in vitro (temperatura e illuminazione controllata, elevata umità relativa) a quelle vivo. Il materiale è stato posto ad ambientare in alveoli contenenti cocco e torba (80:20). Quest anno abbiamo consegnate circa 900 piante e ulteriore consegne sono previste per i prossimi mesi (siamo a circa un anno e mezzo dall inizio quest attività propagazione).

7 Alcune fonti bibliografiche relative ad applicazioni della coltura in vitro alle piante grasse Abrie AL, Van Staden J (2001) Micropropagation of the endangered Aloe polyphylla. Plant growth regul 33:19.23 Amoo S, Finnie J.F, Van Staden J (2009) Effects of temperature, photoperiod and culture vessel size on adventitious shoot production of in vitro propagated Huernia hystrix. Plant cell Tiss Organ Cult 99: Fay MF (1992) Conservation of rare and endangered plats using in vitro methods In vitro cell Dev Biol- Plant 28:1-4 Frello S, Venerus, Serek M (2002) Regeneration of various species of Crassulaceae, with special reference to Kalanchoe. J Hort Sci Biotechnol 77: Gonzales M, Serpa M (1992) Micropropagation de Neprolepsis exalant L. Horti. Science 27(6); 697 Grantham K, Klaassen P (1999) The plantfinder s guide to Cacti&other succulents. Oregon, Timber Press. Ivanova M, Novàk O (2006) Endagenous cytokinins in shoot of Aloe polyphylla cultured in vitro in relation to hyperhydricity, exogenous cytokinins and gelling agents, Plant growth regul 50: Karpoff AJ (1982) Hormones and early in vitro development of epiphyllous propagules on Bryophylum calycinim. Am J Bot 69: Khalafalla M.M, Abdellatef E., Mohameed M.M, Osman M.G (2007) Micropropagation of cactus (Opuntia ficus-inca) as stratecig tool combat desertification in arid and semi arid regions. Int. J.Sustain. Crop Prod. 2(4):1-8 Kolar Z, Bartek J, Viskot B (1976(1976) Vegetative propagation of cactus Mamillaria woodsii trough tissue cultures. Experientia 32: Malda G, Suzàn H, Backhus Ret (1999) In vitro culture as a potential method for the conservation of endangered plants possessing crassulacean acid metabolism. Sci Hort 81:71-87 Perez Molphe Balch E, Perez Reyes M E, Villalobos Amador E, Meza rangel E (1998) Micropropagatio of 21 species of Mexican cacti by axillary proliferation. In vitro Cell. Dev. Biol- Plant 34: Saifullah K, Sheeba N, Kashif A, Samreen Z (2006) Direct organogenesis of Kalankoe tomentosa (Crassulaceae) from shoot-tips. Pak.J. Bot. 38(4) : Salazar E, Gonzales P, Hernàndez C (2009) In vitro multiplication of Agave cocui Trelease through axillary buds. Agronomia Trop. 59(2): Sanchez-Urbina A, Ventura-Canseco L.M.C., Ayora-Talavara T, Abud-Archila M, Péerez-Ferrera M.A., Dendooven L, Gutiérrez Miceli F.A (2008) Seed Germination and in vitro Propagation of Agave grijalvensis an Endemic Endangered Mexican Species. Asian Journal of Plant Science Sawsan S, Sayed S, Abou-Dahab T.A., Youssef E.M.A (2004) In vitro propagation of cactus (Cereus peruvianus l.). Arab J. Biotech., 8(1): Shagufta N, Sumera J, Saiqa I, Aamir A (2009) An efficient protocol for rapid multiplication of Bryophyllum pinnatum and Bryophyllum daigremontianum. Pak.J. Bot. 41(5):