C NEUROSCIENZE SPERIMENTALI. GIORGIO BERNARDI Università di Roma Tor Vergata Fondazione Santa Lucia

Transcript

1 C NEUROSCIENZE SPERIMENTALI GIORGIO BERNARDI Università di Roma Tor Vergata Fondazione Santa Lucia

2 Neuroscienze sperimentali C La terapia della deep brain stimulation nel morbo di Parkinson: studio dei suoi meccanismi cellulari su un modello murino in vitro (Nicola Berretta) C Nuove funzioni della chinasi ATM (ataxia telangiectasia mutated) (Daniela Barilà) C Ruolo delle cellule MAIT nella sclerosi multipla: come la flora intestinale influenza le risposte autoimmuni (Luca Battistini) C Discinesie indotte dal trattamento cronico con L-DOPA nella malattia di Parkinson: nuovi meccanismi e targets molecolari (Paolo Calabresi) C Ruolo delle sirtuine in modelli in vitro ed in vivo di sclerosi laterale amiotrofica (SLA) di tipo familiare (Maria Teresa Carrì) C Regolazione della morte e sopravvivenza cellulare nelle neurodegenerazioni (Francesco Cecconi) C Ruolo della infiammazione nel danno sinaptico e neurodegenerativo in corso di sclerosi multipla (Diego Centonze) C Caratterizzazione funzionale dei neuroni dopaminergici mesencefalici e dei neuroni striatali in un modello genetico di malattia di Parkinson (Ezia Guatteo) C Leucemie secondarie al trattamento della sclerosi multipla, genetica di insorgenza e dei fattori predisponenti (Francesco Lo-Coco) C Neuroprotezione e danno remoto del SNC: valutazione morfologica, comportamentale e farmacologica di approcci terapeutici (Marco Molinari) C Meccanismi di morte cellulare remota e recupero funzionale in un modello murino di lesione spinale (Maria Teresa Viscomi, Marco Molinari) C Studi genetici in pazienti affetti da paraparesi spastica ereditaria (Antonio Orlacchio) C Effetti cognitivi transgenerazionali dell arricchimento ambientale (Laura Petrosini) C Ruolo della PDE10A nella fisiologia e nella patologia della via striato nigrale (Nicola Biagio Mercuri) C Meccanismi neurali dell estinzione: studio comportamentale, funzionale e molecolare in modelli preclinici (Stefano Puglisi-Allegra)

3 Sezione III: Attività per linea di ricerca corrente C C Regolazione dello splicing di SMN2 nella atrofia muscolare spinale (SMA) (Claudio Sette) C Studio molecolare e funzionale dei recettori purinergici P2 nelle patologie neurodegenerative e neuroinfiammatorie del sistema nervoso (Cinzia Volonté) C Bande β/γ nei gangli della base di mammifero; epifenomeno o patogenesi del parkinsonismo? (Alessandro Stefani)

4 C La terapia della deep brain stimulation nel morbo di Parkinson: studio dei suoi meccanismi cellulari su un modello murino in vitro (Nicola Berretta) Anno d inizio: 2012 Parole chiave: DBS, nucleo subtalamico, morbo di Parkinson. Neuroscienze sperimentali Il morbo di Parkinson (MP) è una malattia neurologica caratterizzata da rigidità muscolare, tremore e bradicinesia. È una malattia progressiva che può giungere in casi estremi a una perdita totale del movimento. Si ritiene che la perdita di neuroni che liberano dopamina (DA) nella sostanza nera pars compacta (SNc) associata a questa patologia determini una ipersensibilità dei recettori per la DA striatali e dunque uno sbilanciamento tra la via diretta e indiretta che origina da quest area. Questo comporterebbe un attività eccessiva nelle aree di proiezione dei gangli della base, come il pallido interno e la Sostanza Nera pars reticulata (SNr), tanto che una iperfunzionalità del Nucleo Subtalamico (STN) è ritenuta alla base di gran parte delle disfunzioni motorie associate al MP. È sulla base di questi presupposti che, alla classica terapia farmacologica con L-DOPA, è stata in anni recenti associata con successo anche la tecnica neurochirurgica della deep brain stimulation (DBS), nei casi in cui si manifestano gravi disturbi motori con scarsa risposta all intervento farmacologico. Essa prevede l impianto cronico di elettrodi stimolanti in aree specifiche dei gangli della base, soprattutto l STN, al fine di applicare stimolazioni continue ad alta frequenza, ma i meccanismi alla base dei suoi effetti benefici sono però ancora poco chiari. Lo scopo delle nostre ricerche è quello di ottimizzare un modello in vitro, che ci permetta di valutare i meccanismi cellulari alla base della DBS. A questo fine studieremo preparati slice di mesencefalo di ratto, comprensivi di SNc, SNr e STN. Una volta verificata la presenza di una connessione funzionale glutammatergica tra l STN e l area migrale, valuteremo gli effetti della stimolazione prolungata ad alta frequenza nell STN, con parametri di stimolazione analoghi a quelli utilizzati su pazienti trattati con DBS. Questi studi saranno condotti sia con tecniche di registrazione da singola cellula, in whole-cell patch-clamp, sia con registrazione extracellulare di singleunit mediante multi-electrode array. Questo doppio approccio sperimentale ci permetterà di mettere in rilievo sia le modificazioni nell efficacia sinaptica glutammatergica legate alla stimolazione prolungata in STN, che le modificazioni funzionali che ne conseguono, in termini di frequenza e pattern di scarica dei neuroni dopaminergici e nondopaminergici della SNc e SNr. Questi esperimenti potranno permetterci non solo di comprendere i meccanismi cellulari che sottostanno agli effetti benefici della DBS, ma anche, possibilmente, di ottimizzare protocolli di stimolazione in STN che possano meglio ristabilire dei pattern fisiologici di attività neuronale

5 Sezione III: Attività per linea di ricerca corrente C Risultati e prodotti conseguiti Abbiamo utilizzato slice di mesencefalo ventrale di ratto, comprensivi di substantia nigra, sia pars compacta che pars reticulata (SNc e SNr), e nucleo subtalamico (STN), tagliate lungo il piano orizzontale. La scelta di un piano orizzontale per la sezione delle fettine di mesencefalo ha consentito di preservare in parte, nella stessa fettina di cervello, anche la proiezione glutammatergica del STN alla SN. La presenza di fibre appartenenti a questa proiezione è stata verificata funzionalmente mediante registrazioni elettrofisiologiche da neuroni dopaminergici della SNc, registrati intracellularmente e identificati come dopaminergici sulla base di proprietà di membrana note, che sono distintive di questo tipo cellulare. Un elettrodo stimolante bipolare è stato posto a livello di STN oppure in una zona intermedia tra STN e SNc, e mediante questo venivano applicati brevi treni di stimoli a livello della presunta via glutammatergica afferente (40 ms a 130 Hz). In 18 neuroni dopaminergici della SNc abbiamo verificato la presenza di una risposta sinaptica evocata a breve latenza (of 2.36 ± 0.04 ms), indicativa di una risposta monosinaptica. Il potenziale postsinaptico era in larga misura sostenuto dall attivazione di recettori ionotropici glutammatergici. Infatti, l applicazione di bicucullina (10 µm), antagonista dei recettori GABAA1 produceva una minima riduzione dell area sottesa alla risposta eccitatoria evocata, da ± a ± mv ms (n = 14, P > 0.4; ± % del valore di controllo). Per contro, la perfusione con CNQX (10 µm), antagonista dei recettori ionotropici glutammatergici di tipo AMPA, lasciava solo una risposta residuale di ± 51.5 mv ms (n = 14; P < 0.005; 28.9 ± 4.6 % del valore di controllo), che era sostanzialmente abolita da D-AP5 (100 µm), antagonista dei recettori ionotropici glutammatergici di tipo NMDA (29.2 ± 21.5 mv ms; n = 14; P < 0.001; 0.98 ± 3.15 % del valore di controllo). Abbiamo poi verificato gli effetti di una stimolazione prolungata a una frequenza ( Hz) paragonabile a quella utilizzata nei protocolli di DBS. In questi esperimenti abbiamo potuto osservare una progressiva scomparsa della risposta sinaptica evocata, tale per cui, dopo 10 s di stimolazione continua la risposta risultava virtualmente abolita (10.95 ± 2.46 % dell ampiezza al picco; n = 29). Questo effetto di scomparsa permaneva per tutta la durata della stimolazione ad alta frequenza (fino a 15 min). Questi risultati sembrerebbero suggerire un effetto di inibizione delle efferenze glutammatergiche dello STN, in concomitanza con stimolazioni mediante protocolli DBS, piuttosto che eccitazione delle stesse. I risultati finora conseguiti sembrerebbero suggerire un effetto di inibizione delle efferenze glutammatergiche dello STN, in concomitanza con stimolazioni mediante protocolli DBS, piuttosto che eccitazione delle stesse. Ulteriori esperimenti saranno dunque necessari al fine di verificare la consistenza di questo

6 Neuroscienze sperimentali fenomeno osservato di depressione sinaptica e i meccanismi cellulari che vi presiedono. In particolare valuteremo gli effetti di questa depressione sinaptica sulla scarica autorigenerativa spontanea dei neuroni dopaminergici della SNc, oltre che l azione esercitata da altri sistemi recettoriali che potrebbero teoricamente essere coinvolti nella azione depressioria dell input proveniente dallo STN. Nello specifico utilizzeremo un approccio farmacologico volto a valutare il contributo del sistema GABAergico, di quello colinergico e anche di quello glutammatergico mediato da recettori metabotropici. C Nuove funzioni della chinasi ATM (ataxia telangiectasia mutated) (Daniela Barilà) Parole chiave: ATM chinasi, ITCH E-3 ubiquitina ligasi, stabilità proteica. L atassia telangiectasia (AT) è una patologia caratterizzata da atassia cerebellare. È una malattia monogenica caratterizzata da mutazioni su entrambi gli alleli per il gene atm che causano l assenza nei pazienti della proteina corrispondente ATM (ataxia telangiectasia mutated). ATM è una serina-treoninachinasi centrale nella risposta al danno al DNA indotto da rotture a doppio filamento. Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi approcci di proteomica che hanno consentito di identificare più di 700 nuovi substrati di ATM evidenziando il coinvolgimento di questa chinasi, oltre che nella risposta al danno del DNA, anche in molti pathway nucleari e citoplasmatici. Due pathway molecolari in cui ATM ha una funzione importante sono la degradazione delle proteine ubiquitina-proteosoma dipendente e la traduzione del segnale a valle dei recettori tirosina chinasi. Abbiamo recentemente identificato ATM come un nuovo modulatore della stabilità proteica ed in particolare della degradazione ubiquitina-proteosoma dipendente della proteina anti-apoptotica FLIP. In tal modo l attivazione di ATM promuove la morte cellulare indotta da stimolo dei recettori di morte. Questo meccanismo contribuisce a spiegare alcune manifestazioni fenotipiche associate a genotipo A-T. I nostri studi hanno dimostrato che ATM modula l attività enzimatica della E3 ubiquitina ligasi ITCH che a sua volta è responsabile del controllo della stabilità proteica di FLIP. Parallelamente, mediante un approccio di proteomica, abbiamo analizzato il profilo proteico di una linea cellulare linfoblastoide derivata da pazienti A-T, ricostituita o meno per l espressione di ATM, e trattata o meno con l inibitore del proteosoma MG132. Tale studio identifica, ATM come un modulatore importante di diverse vie metaboliche e dell espressione di proteine coinvolte nella risposta a stress ossidativi, in accordo con dati presenti in letteratura

7 Sezione III: Attività per linea di ricerca corrente C Ci proponiamo di: 1) Investigare il ruolo della modulazione da parte di ATM dell attività dell ubiquitina ligasi ITCH in modelli neuronali. 2) Investigare il ruolo di ATM nella tumorigenesi mediata da recettori tirosina chinasi. Risultati e prodotti conseguiti Utilizzando un approccio di proteomica, abbiamo condotto esperimenti di comparazione del profilo di espressione proteica di una linea cellulare linfoblastoide derivata da pazienti A-T ricostituita o meno per l espressione di ATM e trattata o meno con l inibitore del proteosoma MG132. Tale studio ci ha consentito di identificare ATM come un modulatore importante di diverse vie metaboliche e di proteine coinvolte nella risposta a stress ossidativo. Tali osservazioni sono coerenti con gli studi pubblicati negli ultimissimi anni da diversi gruppi. Abbiamo identificato ATM come un nuovo modulatore dell attività enzimatica della E3 ubiquitina ligasi ITCH che, a sua volta, è responsabile dell ubiquitinazione e della conseguente degradazione proteosoma-dipendente di due substrati noti di ITCH, FLIP e c-jun. ATM media la fosforilazione di ITCH in uno specifico residuo di Serina e tale fosforilazione consente il rilascio di un complesso di interazioni intramolecolari necessarie a bloccare ITCH in una conformazione inattiva. Il ruolo di ATM nella modulazione dell attività di ITCH è stato validato anche in vivo utilizzando un modello murino ATM KO. Marzano V, Santini S, Rossi C, Zucchelli M, D Alessandro A, Marchetti M, Mingardi M, Stagni V, Barilà D, Urbani A (2012) Journal of Proteomics 75: Santini S, Stagni V, Giambruno R, Fianco G, Di Benedetto A, Mottolese A, Pellegrini M, Barilà D (2013) Oncogene Feb 25. doi: /onc Investigare in vitro ed in vivo, se ATM possa modulare la stabilità di alcuni target di ITCH. Valutare il ruolo di ATM nella modulazione della tumorigenesi mediata da iperattivazione di recettori tirosina chinasi. C Ruolo delle cellule MAIT nella sclerosi multipla: come la flora intestinale influenza le risposte autoimmuni (Luca Battistini) Parole chiave: Sclerosi multipla, linfociti T, infezioni

8 Neuroscienze sperimentali Una nuova popolazione cellulare specializzata, i linfociti CD8+ MAIT (mucosal associated invariant T cells), ha catturato di recente l attenzione di molti ricercatori. Questa popolazione cellulare, chiamata MAIT si espande dopo la nascita in seguito al contatto con la flora batterica commensale, ed è caratterizzata dall espressione di un TCR semi-invariante, dall elevata espressione dei recettori di membrana CD161 e CCR6, e dalla produzione di IFNg e IL-17; anzi, tutti i linfociti CD8+ che producono IL-17 appartengono a questa popolazione cellulare. Queste cellule sono state trovate negli infiltrati cellulari delle lesioni demielinizzanti e in stretta associazione con i follicoli ectopici composti da linfociti B, e la loro frequenza è significativamente aumentata nel sangue periferico dei pazienti con MS. È possibile che queste cellule, attivate ed espanse a livello della mucosa intestinale a causa di un alterata composizione della flora batterica intestinale, penetrino nel tessuto cerebrale attraverso il plesso corioideo, le cui cellule epiteliali secernono costitutivamente CCL20, la chemochina il cui ligando è la molecola CCR6, espressa ad alti livelli dalle cellule MAIT. All interno del cervello, l interazione con le popolazioni residenti cerebrali o con cellule di derivazione ematica che hanno già attraversato la barriera ematoencefalica potrebbe fornire un ulteriore stimolo di attivazione determinando infine il rilascio di citochine proinfiammatorie, generando le condizioni ottimali per l ingresso di altre ondate di cellule. In questo progetto ci proponiamo di studiare la composizione della flora batterica intestinale nei pazienti con sclerosi multipla e nei soggetti sani, sfruttando anche la possibilità di avere campioni fecali da coppie di gemelli omozigoti discordanti per la malattia. I ceppi batterici e fungini che verranno selezionati perché differenzialmente presenti nei soggetti sani o nei pazienti verranno utilizzati per test in vitro per misurare la risposta da parte delle cellule MAIT. In parallelo, studieremo le molecole che partecipano all attivazione dei linfociti MAIT come NKR-P1A, il cui ligando LLT1 è espresso da cellule B infettate dal virus di Epstein-Barr. Ciò ha rilevanza, in questo progetto, poiché il virus EBV sembra essere coinvolto nella patogenesi della SM, e le cellule MAIT negli infiltrati cerebrali sono spesso a stretto contatto con linfociti B infettati da EBV. La caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule MAIT nei pazienti affetti da sclerosi multipla e in individui sani. Lo studio della frequenza delle cellule MAIT nel sangue periferico dei pazienti affetti da sclerosi multipla stratificati in base al tipo di malattia (SM recidivante-remittiva; SM primariamente progressiva; SM secondariamente progressiva) e in base all attività di malattia. Tale analisi saranno confrontate con quelle ottenute in individui sani con età e sesso paragonabili a quelle dei pazienti. Studio della flora batterica intestinale in pazienti affetti da sclerosi multipla e in individui sani. A tale scopo saranno selezionate 4 coppie di gemelli omozigoti discordanti per sclerosi multipla per valutare l influenza delle abitudini alimentari sulla flora batterica intestinale in un contesto genetico identico

9 Sezione III: Attività per linea di ricerca corrente C C Discinesie indotte dal trattamento cronico con L-DOPA nella malattia di Parkinson: nuovi meccanismi e targets molecolari (Paolo Calabresi) Parole chiave: Plasticità sinaptica, discinesie e malattia di Parkinson, elettrofisiologia. La malattia di Parkinson (MP) è caratterizzata dalla perdita dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra. La L-DOPA, un precursore della dopamina (DA), è attualmente il farmaco più efficace nel contrastare i sintomi motori della patologia. Tuttavia, dopo i primi anni di trattamento nella maggioranza dei pazienti compaiono effetti indesiderati che si manifestano come discinesia da L-DOPA (LID) [Calabresi et al., 2010]. Negli ultimi anni grazie all utilizzo di modelli animali è stata raggiunta una migliore comprensione dei meccanismi che regolano la comparsa della LID. In roditori lesionati con 6-OHDA e in primati trattati con MPTP, infatti, si sviluppa una sintomatologia motoria indotta dalla L-DOPA simile alla discinesia che si sviluppa nei pazienti [Lundblad et al., 2002; Bezard et al., 2003]. L identificazione di specifiche alterazioni pre- e post-sinaptiche caratterizzate in questi modelli animali suggeriscono che la LID sia una sinaptopatia che implica una combinazione di specifiche alterazioni molecolari. L effetto terapeutico della L-DOPA durante i primi anni di trattamento è verosimilmente legato alla capacità dei neuroni DAergici restanti di internalizzare la L-DOPA, di convertirla in DA e di rilasciarla nello spazio sinaptico. Vi è inoltre la capacità degli autorecettori D2/D3 e del trasportatore della DA, di regolare i livelli sinaptici di DA. Infatti, negli stadi iniziali della patologia, nello striato è presente un numero di terminali DAergici sufficiente per mediare questi effetti. Lo sprouting dei terminali DAergici e il ridotto uptake di DA contribuiscono a conservare i livelli striatali di DA [Lee et al., 2008]. Tuttavia, con la progressione della degenerazione neuronale il catabolismo della DA viene ridotto [Wachtel, Abercrombie, 1994] e la decarbossilazione di L-DOPA a DA, così come il rilascio di questo neurotrasmettitore, avvengono da parte di cellule non-daergiche [Rylander et al., 2011; Carta et al., 2007]. Pertanto, col progredire della malattia, viene persa progressivamente la stimolazione fisiologica dei recettori DAergici. In questo contesto, giocano un ruolo fondamentale i neuroni serotoninergici (5-HT) per quanto riguarda la produzione e il rilascio della DA derivata da L-DOPA. Infatti, tali neuroni possiedono sia l enzima deputato alla decarbossilazione della L-DOPA che il trasportatore vescicolare delle monoamine. I neuroni 5-HT, tuttavia, non possono regolare i livelli extracellulari di DA, poiché mancano dei meccanismi di autoregolazione del rilascio e, quindi, in seguito a trattamento con

10 Neuroscienze sperimentali L-DOPA, inducono un rilascio incontrollato di DA. La DA rilasciata dai neuroni 5-HT causa una stimolazione pulsatile dei recettori DA che è ritenuta responsabile sia delle alterazioni osservate a livello dei recettori D1 (D1R) che delle alterazioni molecolari a valle di questi recettori. Infatti, la rimozione dell innervazione serotoninergica è in grado di produrre, in ratti discinetici, una riduzione dell 80% dei livelli striatali extracellulari di DA derivata da L-DOPA [Carta et al., 2007; Eskow et al., 2009] e la quasi completa soppressione della LID. Allo stesso modo, la modulazione farmacologica inibitoria dell attività 5-HT, indotta da agonisti 5-HT1A e 1B, riduce i livelli extracellulari di DA derivata da L-DOPA [Carta et al., 2007; Eskow et al., 2009] ed elimina le LID sia nei ratti [Carta et al., 2007] che nei primati con parkinsonismo sperimentale [Munoz et al., 2008]. Un recente studio clinico pilota sta attualmente analizzando i potenziali effetti antidiscinetici di agonisti dei recettori 5-HT1A/1B. Recentemente è stato osservato un aumento della innervazione 5-HT nello striato di animali e di pazienti discinetici confermando che i neuroni serotoninergici hanno un ruolo rilevante nell insorgenza della LID [Gil et al., 2010; Rylander, 2011]. Questo studio ha suggerito che il trattamento con L-DOPA possa indurre sia uno sprouting dei terminali 5-HT che modificazioni della loro morfologia, attraverso un meccanismo mediato dal BDNF. Infatti, l aumento di espressione del BDNF è in grado di indurre sprouting dei terminali 5-HT e di alterare il rilascio di 5-HT [Mamounas et al., 1995; Mamounas et al., 2000; Goggi et al., 2002]. Questi eventi aumenterebbero le fluttuazioni della concentrazione extracellulare di DA e stimolerebbero un aumento delle alterate risposte sinaptiche alla somministrazione di L-DOPA. È chiaro, quindi, come l interazione tra i neuroni 5-HT e la L-DOPA possa giocare un ruolo chiave nell induzione della LID. Inoltre, il BDNF influenza il trafficking dei recettori NMDA, la funzionalità dei loro canali e l induzione della plasticità sinaptica [Kovalchuk et al., 2002; Gardoni et al., 2006; Xu et al., 2006]. Questo aspetto è di particolare importanza perché esiste un vasto consenso sul fatto che alterazioni della sinapsi glutammatergica striatale siano implicate sia nella MP che nelle LID. L obiettivo del presente progetto è chiarire i meccanismi alla base della LID, stimolare lo sviluppo di soluzioni terapeutiche innovative e favorire l applicazione dell uso di nuovi bersagli terapeutici dalla ricerca di base alla pratica clinica. Saranno utilizzati due differenti approcci: a) Influenza della modulazione del rilascio di serotonina da parte di agonisti 5-HT1 sui marcatori post-sinaptici delle discinesie nei ratti lesionati con 6-OHDA. b) Implicazioni dell iperespressione del BDNF sulla vulnerabilità alla LID nel modello murino di malattia di Parkinson: studio molecolare, comportamentale ed elettrofisiologico. Analisi elettrofisiologica in patch clamp delle proprietà intrinseche, attività spontanea, NMDA/AMPA ratio, cinetiche delle correnti nei neuroni spinosi

11 Sezione III: Attività per linea di ricerca corrente C registrati dai ratti di controllo con trattamento in vitro con eltoprazina (agonista 5-HT1A/B). Inizio analisi comportamentale ed elettrofisiologica dei possibili effetti antiparkinsoniani e degli effetti discinetici del trattamento cronico con 5-HT agonista versus trattamento cronico con L-DOPA. C Ruolo delle sirtuine in modelli in vitro ed in vivo di sclerosi laterale amiotrofica (SLA) di tipo familiare (Maria Teresa Carrì) Parole chiave: SLA, sirtuine, mitocondri. Altri Enti coinvolti: Università di Strasburgo, Francia. Recenti studi suggeriscono che modificazioni dell espressione o della attività di istone deacetilasi (HDAC) possano avere un ruolo nella patogenesi della sclerosi laterale amiotrofica [1]. Utilizzando modelli cellulari costituiti dalla linea motoneuronale murina NSC34 o dalla linea neuronale umana SH-SY5Y trasfettate per l espressione inducibile di diverse SOD1 mutanti associate alla forma familiare di SLA, abbiamo dimostrato che solo alcune delle 18 HDAC note sono espresse diversamente in cellule modificate rispetto al controllo non trasfettato. Di particolare interesse è l osservazione della modificazione nella espressione di alcune HDAC di classe III (sirtuine) che hanno un ruolo nella regolazione del metabolismo mitocondriale. È noto infatti che il danno mitocondriale è tra i principali mediatori del danno motoneuronale nella SLA [2]. Obiettivo del progetto è di estendere questo studio, valutando l espressione delle HDAC nel midollo spinale, cervello e muscolo di due diversi modelli murini di SLA prima della comparsa dei sintomi motori e durante il corso della patologia, e di indagare sulla possibilità di intercettare il danno causato dalla espressione di SOD1 mutanti mediante trattamenti farmacologici mirati alla modulazione di sirtuine in questi modelli murini ed in cellule in coltura. 1. Janssen C, Schmalbach S, Boeselt S, Sarlette A, Dengler R, Petri S (2010) J Neuropathol Exp Neurol 69: Cozzolino M, Carrì MT (2012) Prog Neurobiol 97: In questo studio saranno impiegati due modelli murini di SLA basati sull iperespressione di due diverse mutazioni della SOD1 (G93A/G86R). Le

12 Neuroscienze sperimentali due linee di topi transgenici ricapitolano essenzialmente le manifestazioni della patologia umana, ma mostrano un decorso di diversa severità e durata. Nel primo anno di lavoro, i tessuti dei topi saranno analizzati in una fase che precede l esordio dei sintomi, durante il decorso della malattia e nello stadio finale che precede immediatamente la morte. Verranno inizialmente determinati i livelli di espressione di tutte le 18 HDAC mediante PCR quantitativa su mrna estratto da midollo spinale, cervello e muscolo. In tali tessuti sarà in seguito valutata la rilevanza funzionale delle alterazioni delle HDAC in termini di attività su specifiche proteine bersaglio. L individuazione di alterazioni specifiche nella attività delle HDAC consentirà di scegliere opportuni farmaci (attivatori/inibitori) per tentare la modulazione in vivo. L efficacia dei trattamenti sarà valutata sia determinando una serie di parametri biochimici di funzionalità mitocondriale (metabolismo energetico, metabolismo del calcio, induzione di apoptosi mitocondrio-dipendente) che effetti sul fenotipo motorio e sulla sopravvivenza degli animali rispetto a controlli non trattati. In parallelo, sarà svolta una analoga indagine su modelli per la SLA familiare legata a mutazioni diverse da SOD1. Questo studio di tipo preclinico potrebbe rivelarsi utile al disegno di nuove strategie terapeutiche per il trattamento della SLA. C Regolazione della morte e sopravvivenza cellulare nelle neurodegenerazioni (Francesco Cecconi) Parole chiave: Autofagia, mitocondrio, sinapsi. 1. Analisi dei mitocondri sinaptici in un modello murino di malattia di Alzheimer (TG2576) Un grande numero di recenti studi dimostrano che i mitocondri sono malfunzionanti sia in diversi modelli murini del morbo di Alzheimer (AD) che nei tessuti post-mortem di molti pazienti analizzati; tale malfunzionamento potrebbe essere ricondotto alla presenza di APP e di peptide Aβ nelle membrane mitocondriali [Lustbader et al., 2004; Rui et al., 2006]. Tuttavia, dal momento che i mitocondri sinaptici risultano più vulnerabili dei mitocondri non sinaptici e dato che svolgono una funzione essenziale nel mantenimento della funzionalità neuronale, il nostro scopo è a) analizzare se l accumulo di peptide Aβ ha luogo prima nei mitocondri sinaptici rispetto ai non-sinaptici; b) analizzare se questo eventuale accumulo di Aβ nei mitocondri sinaptici è responsabile dell alterazione della funzionalità mitocondriale. 2. Autofagia e glaucoma Il glaucoma è causato da un difetto anatomico e fisiologico nelle cellule ganglionari della retina (RGC) a livello del nervo ottico, che porta ad una perdita del loro corpo cellulare. Dal momento che l autofagia

13 Sezione III: Attività per linea di ricerca corrente C è un meccanismo di degradazione coinvolto nel mantenimento dell omeostasi cellulare che regola processi quali la proliferazione cellulare, il differenziamento e lo sviluppo, il nostro scopo è valutare il ruolo dell autofagia nell insorgenza del glaucoma. In particolare, verificheremo se la manipolazione dell autofagia è in grado di aumentare la sopravvivenza delle RGC. Un analisi dell autofagia verrà condotta nelle RGC in seguito ad induzione di glaucoma, ottenuto mediante aumento forzato della pressione ottica. Nell ambito della parte 1. del nostro progetto procederemo, nel primo anno di attività, come segue: Mediante la tecnica del Western Blotting e dell ELISA, utilizzando un anticorpo specifico per i peptidi Aβ 1-40 e 1-42, analizzeremo le due popolazioni di mitocondri isolati da topi wild-type e da topi TG2576 di diverse età (2 mesi, 3 mesi, 6 mesi). Analizzeremo il potenziale di membrana mediante citofluorimetria utilizzando la sonda TRMR. Analizzeremo, in seguito, se c è un alterazione delle dinamiche mitocondriali (la fusione e la fissione): verranno studiati i livelli di mrna e proteine quali Drp1, Fis1, Opa1 e Mfn1, coinvolte in tali dinamiche, mediante western blotting e immunofluorescenza. Analizzeremo le due popolazioni di mitocondri isolati da topi wild-type e topi TG2576 di diverse età (2 mesi, 3 mesi, 6 mesi). Per la parte 2. effettueremo: Analisi dell insorgenza spontanea di Glaucoma in modelli murini difettivi nel processo di autofagia. Utilizzando topi eterozigoti per AMBRA1 e Beclin 1 di diverse età (2 mesi, 6 mesi, 12 mesi) verranno contati gli assoni del nervo ottico e il numero delle RGC in seguito a marcatura, mediante immunofluorescenza, con un anticorpo specifico per le RGC, anti-brn3. Inoltre, verrà analizzata la morte cellulare con tecnica TUNEL e immunofluorescenza condotta con un anticorpo anti-caspasi 3 attiva. Analisi della morte delle RGC in seguito ad induzione farmacologica dell autofagia. In seguito a somministrazione per via sistemica di rapamicina (induttore di autofagia), verranno effettuate le stesse analisi descritte sopra. C Ruolo della infiammazione nel danno sinaptico e neurodegenerativo in corso di sclerosi multipla (Diego Centonze) Parole chiave: Sclerosi multipla, citochine, trasmissione sinaptica. La classica distinzione tra disordini infiammatori e neurodegenerativi del sistema nervoso centrale (SNC) sta svanendo parallelamente alla migliorata

14 Neuroscienze sperimentali comprensione dell intima natura dei processi patologici che ne sono alla base. I processi infiammatori hanno un ruolo importante nella fisiopatologia dei disordini primariamente degenerativi, e la neurodegenerazione complica i disturbi primariamente infiammatori del cervello e del midollo spinale come la sclerosi multipla (SM). Una complessa interazione tra sistema immunitario e funzione/disfunzione neuronale sta emergendo. A questo proposito, il sistema endocannabinoide e specifiche citochine quali il tumor necros factor α (TNF-α) e la interleuchina 1β (IL1β) sembrano avere un ruolo importante: possono infatti interagire con molteplici mediatori cellulari e molecolari della neuroinfiammazione, modulare l attività della microglia e la sensibilità neuronale alla attivazione di recettori di membrana per il glutammato o il GABA. Tuttavia nessuno studio si è occupato di chiarire il loro ruolo nelle alterazioni neuronali che hanno luogo in corso di SM e di SM sperimentale. Il nostro tentativo con questo progetto di ricerca è pertanto quello di colmare questa lacuna studiando gli effetti di perturbazioni sia genetiche che farmacologiche del sistema endocannabinoide e della attività delle citochine TNF-α e IL1β nella fisiopatologia di una classica malattia neuroinfiammatoria, l encefalomielite autoimmune sperimentale (EAS, modello murino di SM). I dati ottenuti sul modello animale di SM saranno affiancati a dati analoghi ottenuti dallo studio del ruolo del sistema endocannabinoide, del TNF-α e della IL1β in pazienti con SM. Risultati e prodotti conseguiti Abbiamo recentemente studiato il coinvolgimento delle citochine infiammatorie, prodotte in seguito alla attivazione del sistema immunitario, nelle alterazioni sinaptiche a carico della trasmissione glutammatergica e GABAergica in topi con EAE. I nostri risultati possono essere così riassunti. Fin dalle fasi presintomatiche della EAE, l attivazione microgliale secondaria alla infiltrazione T linfocitaria esita nella produzione e nel rilascio di TNF-α nella sostanza grigia di specifiche aree del sistema nervoso centrale, quali il nucleo striato. Il TNF-α così prodotto è in grado di alterare l espressione e lo stato di fosforilazione di specifiche subunità del recettore AMPA del glutammato, causando le alterazioni elettrofisiologiche descritte a carico della trasmissione sinaptica eccitatoria nel primo anno della ricerca. La sottoregolazione di uno specifico early gene (Arc/Arg) è responsabile per tale cambiamento della sensibilità del recettore AMPA al glutammato endogeno rilasciato dalle sinapsi eccitatorie. Il TNF-α, al contrario, non induce alcuna variazione a carico della trasmissione GABAergica. Abbiamo inoltre dimostrato che l abnorme funzionalità del recettore AMPA indotto dalla infiammazione cronica e dal TNF-α, attiva la cascata apoptotica nelle spine dendritiche dei neuroni striatali, portando a una drammatica riduzione della densità delle spine dendritiche neuronali. Tali alterazioni degenerative, infatti, venivano completamente bloccate dal trattamento cronico dei topi EAE con NBQX, un bloccante dei recettori AMPA. Ci siamo anche concentrati sul ruolo del sistema endocannabinode nella SM, poiché tale sistema è coinvolto tanto nella modulazione della risposta infiamma

15 Sezione III: Attività per linea di ricerca corrente C toria che nel danno neurodegenerativo. La SM altera in modo significativo il sistema endocannabinoide. Abbiamo misurato i livelli dei due endocannabinoidi AEA e 2-AG nel fluido cerebrospinale (CSF, cerebrospinal fluid, o liquor) di pazienti non sottoposti a terapia. Abbiamo potuto rivelare un aumento di 6 volte nei livelli di AEA di questi soggetti, mentre la concentrazione del 2-AG rimaneva normale. Di particolare interesse è stata l osservazione che i livelli di AEA sono particolarmente alti nei soggetti con un maggior numero di lesioni, risultanti dalla visualizzazione per risonanza magnetica. Un aumento significativo del contenuto di AEA si è osservato anche nei linfociti periferici dei pazienti SM. Tali risultati, uniti ad altri ottenuti dal nostro gruppo sul modello pre-clinico di SM rappresentato dai topi con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), dimostrano che durante l attacco immuno-mediato del sistema nervoso centrale l attivazione del sistema endocannabinoide rappresenta un meccanismo protettivo che tenta di ridurre sia il danno neurodegenerativo che quello infiammatorio, attraverso meccanismi convergenti che coinvolgono neuroni e cellule immunitarie. I nostri dati dimostrano altresì che cellule del sangue periferico possono fare da specchio di un danno centrale, presentando alterazioni simili di alcuni marcatori essenziali come gli endocannabinoidi. Intendiamo proseguire il nostro studio sul ruolo delle citochine infiammatorie nel danno sinaptico della SM e del suo modello sperimentale, la encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Focalizzeremo la nostra attenzione sul cervelletto, poiché tale struttura è colpita frequentemente in corso di SM ed è causa di importante disabilità. Mediante studi di neurofisiologia in vitro, valuteremo le caratteristiche della trasmissione sinaptica eccitatoria dal cervelletto di topi di controllo e con EAE. Studieremo inoltre il coinvolgimento delle maggiori citochine proinfiammatorie, quali la IL-1β e il TNF-α nel danno sinaptico associato alla EAE, e studieremo il ruolo della microglia e della astroglia. Valuteremo inoltre il ruolo dei linficiti infiltranti nel danno sinaptico associato alla EAE e caratterizzeremo biochimicamente, mediante microscopia confocale, e con western blotting le perturbazioni del milieu citochinico in corso di EAE. Valuteremo se la EAE causa alterazioni della risposta sinaptica ai principali sistemi neurotrasmettitoriali cerebrali. Cercheremo di chiarire la natura del complesso dialogo tra infiammazione, glia e trasmissione sinaptica, provando a replicare le alterazioni viste negli studi con EAE mediante applicazione diretta su tessuto cerebrale di animali sani delle citochine proinfiammatorie oppure di cellule microgliali attivate o di linfociti, di controllo e attivati, prelevati dalle milze dei topi EAE. Il ruolo delle cellule gliali nelle alterazioni sinaptiche della EAE verrà approfondito studiando le proprietà della astroglia di subire modificazioni strutturali e funzionali in corso di infiammazione, così come studiando la

16 Neuroscienze sperimentali espressione su tali cellule di molecole in gradi di metabolizzare il glutammato sinaptico in condizioni di controllo, dopo trattamento con citochine infiammatorie e dopo l induzione della EAE. Valuteremo infine le alterazioni comportamentali e i deficit neurologici nei topi con EAE, allo scopo di fornire un correlato clinico al danno neuronale indotto dal processo infiammatorio in tale modello di SM. C Caratterizzazione funzionale dei neuroni dopaminergici mesencefalici e dei neuroni striatali in un modello genetico di malattia di Parkinson (Ezia Guatteo) Parole chiave: α-synucleina, neuroni dopaminergici, calcio citosolico. L ipotesi centrale del presente progetto è che i deficit neuronali precoci che portano alla neuro degenerazione dopaminergica nella malattia di Parkinson e nelle correlate sinucleinopatie siano causati dall accumulo di α-sinucleina nella forma oligomerica che precede la formazione di fibrille. Gli oligomeri potrebbero agire accumulandosi sia nello spazio extra- che intra-cellulare, causando danni all omeostasi dei neuroni dopaminergici mesencefalici. In questo progetto testeremo questa ipotesi attraverso tre step successivi che verranno affrontati nel corso di 36 mesi. Gli studi verranno condotti su un nuovo modello genetico della malattia di Parkinson rappresentato da un ratto avente una mutazione autosomica recessiva [Stoica et al., 2012] che causa, durante il primo mese di vita, una progressiva degenerazione dopaminergica, ricapitolando gli eventi chiave riscontrati nelle fasi pre-sintomatica, iniziale ed avanzata della malattia di Parkinson. Il nostro scopo è quello di capire gli eventi molecolari ed elettrofisiologici che avvengono nei neuroni dopaminergici e striatali in seguito alla formazione di oligomeri di α-sinucleina. Due coppie di ratti eterozigoti per la mutazione in posizione 466 della regione 3 dell mrna per α-sinucleina sono stati regalati dal Prof. Stoica della Texas A&M University. Al momento stiamo espandendo la colonia, identificando nuovi eterozigoti mediante accoppiamenti con eterozigoti certi. I ratti affetti sono ottenuti da due genitori eterozigoti in proporzioni mendeliane (circa 25% della progenie) e si riconoscono per il colore grigio del mantello [Stoica et al., 2012]. Durante il primo anno ci occuperemo di studiare le proprietà intrinseche e degli input sinaptici dei neuroni dopaminergici durante lo sviluppo post-natale dei ratti affetti, rispetto a controlli della stessa età

17 Sezione III: Attività per linea di ricerca corrente C A tali scopi utilizzeremo la tecnica elettrofisiologica del patch clamp, in neuroni dopaminergici in fettine acute di mesencefalo. Valuteremo innanzitutto le proprietà elettriche passive, quali capacità e resistenza di membrana, e le proprietà attive quali il firing spontaneo e in risposta a stimoli depolarizzanti, il potenziale di riposo, e la presenza di correnti ioniche che si attivano in iperpolarizzazione (Ih) in neuroni di ratti affetti, a diverse età postnatali, rispetto ai loro controlli. Successivamente indagheremo la risposta all applicazione esogena di agonisti di recettori dei neurotrasmettitori (D2; mgluri; GABAB), per verificare la funzionalità delle singole vie di trasduzione del segnale nei ratti affetti rispetto ai loro controlli. Tali parametri verranno valutati anche in presenza di sorgenti di stress ossidativo, quali il rotenone [Freestone et al., 2009] e 6-hydroxydopamine [Berretta et al., 2005], noti per indurre la produzione di ROS, accumulo di calcio citosolico e diminuzione di contenuto di ATP. Questi esperimenti saranno utili per mettere in evidenza la maggiore vulnerabilità a tali tossine dei neuroni dopaminergici ottenuti da ratti affetti. Utilizzeremo inoltre la levodopa per testare la capacità dei neuroni di ratti affetti di convertirla in dopamina e rilasciarla nello spazio extracellulare a livello somato-dendritico. C Leucemie secondarie al trattamento della sclerosi multipla, genetica di insorgenza e dei fattori predisponenti (Francesco Lo-Coco) Parole chiave: Leucemie secondarie, sclerosi multipla, polimorfismi genici. La leucemia acuta secondaria (therapy-related acute leukemia, TRAL) è una ben nota complicanza del trattamento con agenti chemioterapici immunosoppressivi e genotossici. Quando insorge dopo trattamento di una malattia non tumorale come la sclerosi multipla (SM) la TRAL ci offre l opportunità di capire il ruolo di un agente specifico come il mitoxantrone (MTZ), usato in monoterapia nel trattamento della SM, nel causare anomalie genetiche. Il laboratorio presso la Fondazione Santa Lucia studia i meccanismi alla base della leucemogenesi, correlando specifiche anomalie genetiche con l effetto biologico di singoli agenti teratogeni. Il rischio di ammalarsi di SM è notevolmente maggiore tra i parenti di un individuo affetto. Poiché solo una piccola percentuale di pazienti affetti da SM che sono stati trattati con terapia immunosoppressiva antiblastica con MTZ sviluppano un tumore secondario, il più delle volte una forma leucemica, esistono con molta probabilità fattori predisponenti specifici che sono correlati alla stessa suscettibilità per la malattia primaria. Infatti, è noto che sono

18 Neuroscienze sperimentali coinvolti nel facilitare l insorgenza di TRAL alcune varianti genetiche di enzimi polimorfici che partecipano alla riparazione del DNA, nel controllo della replicazione cellulare e nella apoptosi. Tali varianti, o per lo meno varianti in geni coinvolti nei medesimi meccanismi, sembrano essere un fattore predisponente anche per l insorgenza di SM. In seguito alla nostra esperienza nel campo delle TRAL, in particolare per quel che riguarda la leucemia promielocitica acuta, abbiamo sviluppato un particolare interesse a studiare le varianti genetiche correlate con una suscettibilità ad ammalare di leucemia secondaria. Le TRAL sono tipicamente malattie molto difficili da curare. Pertanto è di fondamentale interesse acquisire ulteriori conoscenze biologiche sull azione dei farmaci e sui fattori predisponenti al fine di minimizzarne l insorgenza di queste forme, anche alla luce della recente disponibilità di innovativi trattamenti non chemioterapici. Nel nostro laboratorio studiamo i breakpoint specifici delle alterazioni cromosomiche ed il profilo di variabilità genetica correlata con il controllo della omeostasi replicativa cellulare, in particolare per quel che riguarda i geni coinvolti nella suscettibilità alla SM e, nello specifico, nelle cellule staminali leucemiche, la cui persistenza è causa di resistenza al trattamento e recidiva di malattia. Il profilo genetico di queste verrà confrontato con cellule non leucemiche dello stesso paziente ed eventualmente con quello di familiari in nuclei con anamnesi di malattie degenerative, in particolare SM. L obiettivo è studiare il meccanismo d azione che conduce alla tumorigenesi ed un eventuale assetto genetico predisponente isolando singoli fattori basilari ed eventuali fattori comuni all insorgere delle due patologie. Raccolta campioni. SNPs analisi, FACS analisi, analisi di sequenza del trascrittoma (whole exome deep-sequence analysis). Correlazione con i dati anamnestici. Approfondimenti analitici. C Neuroprotezione e danno remoto del SNC: valutazione morfologica, comportamentale e farmacologica di approcci terapeutici (Marco Molinari) Parole chiave: Degenerazione remota, neuroprotezione, recupero funzionale. Il meccanismo di degenerazione remota rappresenta un evento peculiare nella determinazione dello status funzionale e, in particolare, del recupero

19 Sezione III: Attività per linea di ricerca corrente C funzionale in numerose patologie acute del SNC, quali il trauma cranico e le lesioni del midollo spinale. Per degenerazione remota s intende quell insieme di fenomeni degenerativi e/o reattivi che avvengono in regioni distanti, ma funzionalmente connesse, al sito primario di danno. Questi eventi sono associati a fenomeni di degenerazione sia anterograda che retrograda. Nonostante i meccanismi coinvolti siano ancora piuttosto sconosciuti, è ormai assodato che la degenerazione remota coinvolge una serie di cambiamenti cellulari, funzionali e molecolari correlati tra loro sia temporalmente che spazialmente. Un ruolo chiave in tale meccanismo di morte è svolto dai fenomeni infiammatori, soprattutto quelli legati alla reazione astrocitaria, i quali intervengono ad esacerbare ulteriormente il complesso quadro collegato con la morte cellulare a distanza. Considerando l importanza della degenerazione remota nel determinare la prognosi e il recupero funzionale in diverse patologie del SNC, il nostro obiettivo principale è quello di: a) definire il ruolo svolto dai diversi organelli citoplasmatici, principalmente mitocondri e reticolo endoplasmico, nella risposta al danno a distanza; b) individuare ed analizzare nel dettaglio i diversi pathways molecolari che intervengono nel meccanismo di morte cellulare a distanza; c) individuare strategie terapeutiche efficaci nell arrestare la morte cellulare a distanza e quindi favorire sia la sopravvivenza neuronale che il recupero funzionale post-lesionale. Nel corso del 2013 intendiamo proseguire la nostra indagine sul meccanismo della degenerazione remota dopo danno focale del SNC, nello specifico dopo emicerebellectomia chirurgica (HCb). Nel suo insieme il progetto è diretto all identificazione dei diversi processi cellulari che intervengono nel determinare la morte cellulare remota al fine di mettere a punto efficaci strategie terapeutiche. Obiettivo specifico dell anno in oggetto sarà quello di chiarire il contributo dei diversi organelli cellulari, principalmente mitocondri e reticolo endoplasmico, nel meccanismo di morte cellulare remota. In assenza del target fisiologico o dopo assotomia i neuroni vanno incontro a notevoli squilibri interni a livello funzionale. Il progetto affronterà la caratterizzazione di diverse componenti subcellulari nelle varie fasi del danno remoto mettendo in luce le alterazioni che riguardano sia il reticolo endoplasmatico che i mitocondri, questi ultimi organelli di primaria importanza per funzionalità dell omeostasi cellulare. Lo studio prevede la definizione delle caratteristiche dello stress del reticolo, della perturbazione del dinamismo mitocondriale, in particolare analizzando i meccanismi di fusione e di fissione mitocondriale. Lo studio proposto rappresenta lo stadio preliminare e necessario per poter progettare interventi farmacologici di neuroprotezione diretti al ripristino della funzionalità dei processi intracellulari per favorire il recupero funzionale dopo danno del SNC

20 C Meccanismi di morte cellulare remota e recupero funzionale in un modello murino di lesione spinale (Maria Teresa Viscomi, Marco Molinari) Parole chiave: Lesione midollo spinale, neuroprotezione, recupero funzionale. La lesione del midollo spinale (SCI) rappresenta una condizione fisicamente e psicologicamente devastante per la quale, al momento, non esiste ancora un trattamento efficace. Le difficoltà nello sviluppo di terapie efficaci derivano soprattutto dalle complesse alterazioni fisiopatologiche che si verificano in seguito al danno. Nonostante i cambiamenti che si verificano nelle aree funzionalmente connesse all area primaria di danno, ma distanti da essa, siano ormai riconosciuti come eventi critici nel determinare il quadro clinico e la prognosi in una grande varietà di patologie neurodegenerative, i meccanismi di morte cellulare remota dopo SCI sono stati spesso trascurati. Oggi è ormai assodato che una strategia efficace di recupero deve tenere conto dei cambiamenti molecolari e biochimici che si verificano nei corpi neuronali assotomizzati. Dati recenti sottolineano il ruolo chiave della macchina autofagica nel gioco complesso che sostiene la sopravvivenza dei neuroni assotomizzati dopo danno focale del SNC. L autofagia è un meccanismo che degrada i vari componenti cellulari, gli aggregati tossici e gli organelli danneggiati al fine di mantenere l omeostasi cellulare. Considerando il grande interesse del recupero funzionale dopo SCI e le recenti scoperte riguardanti il ruolo dell autofagia nel sostenere un attività pro-omeostatica e neuroprotettiva, il seguente progetto si propone di esplorare il ruolo dell autofagia nel promuovere la sopravvivenza dei neuroni assotomizzati e il recupero funzionale dopo SCI. Neuroscienze sperimentali Nel corso del 2013 il nostro obiettivo principale sarà quello di caratterizzare le variazioni del sistema autofagico in relazione ai cambiamenti morfologici e molecolari che si verificano nei neuroni del nucleo rosso (RN) dopo emisezione spinale a livello C4 (SCI). Tali dati saranno correlati anche con il recupero delle funzioni motorie. Per l analisi delle risposte reattive dei neuroni assotomizzati nel RN gli animali riceveranno 10 giorni prima del danno una singola iniezione di tracciante Fast-Blue (FB) sotto il sito di danno per marcare selettivamente i neuroni del circuito rubro-spinale. A 3, 5, 7,14, 21, 60 giorni dopo SCI gli animali saranno sacrificati e i cervelli processati. Dopo colorazione di Nissl analizzeremo mediante