Oncologica. Seminari di Ematologia. Controversie NEL PROSSIMO NUMERO

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1 ISSN Editor in chief Giorgio Lambertenghi Deliliers Anno 7 Numero Seminari di Ematologia Oncologica NEL PROSSIMO NUMERO LEUCEMIA LINFATICA CRONICA Storia naturale Fattori prognostici Linfocitosi B monoclonale Pattern evolutivi Terapie innovative Controversie EDIZIONI INTERNAZIONALI srl Edizioni Medico Scientifiche - Pavia

2 Controversie Vol. 7 - n Diagnostica citogenetica e molecolare 5 CRISTINA MECUCCI Sindromi mieloproliferative croniche 23 GIOVANNI BAROSI Mieloma multiplo 45 STEFANIA OLIVA, ANTONIO PALUMBO, MARIO BOCCADORO Editor in Chief Giorgio Lambertenghi Deliliers Fondazione IRCCS Ca Granda, Ospedale Maggiore Policlinico di Milano Editorial Board Sergio Amadori Università degli Studi Tor Vergata, Roma Mario Boccadoro Università degli Studi, Torino Alberto Bosi Università degli Studi, Firenze Federico Caligaris Cappio Università Vita e Salute, Istituto San Raffaele, Milano Antonio Cuneo Università degli Studi, Ferrara Marco Gobbi Università degli Studi, Genova Mario Petrini Università degli Studi, Pisa Giovanni Pizzolo Università degli Studi, Verona Giorgina Specchia Università degli Studi, Bari Direttore Responsabile Paolo E. Zoncada Registrazione Trib. di Milano n. 532 Trapianto di cellule staminali emopoietiche 65 ALBERTO BOSI, BENEDETTA BARTOLOZZI Edizioni Internazionali srl Divisione EDIMES Edizioni Medico-Scientifiche - Pavia Via Riviera, Pavia Tel r.a. - Fax edint.edimes@tin.it

3 2 Periodicità Quadrimestrale Scopi Seminari di Ematologia Oncologica è un periodico di aggiornamento che nasce come servizio per i medici con l intenzione di rendere più facilmente e rapidamente disponibili in formazioni su argomenti pertinenti l ematologia oncologica. Lo scopo della rivista è quello di as sistere il lettore fornendogli in maniera esaustiva: a) opinioni di esperti qualificati sui più recenti progressi in forma chiara, aggiornata e concisa; b) revisioni critiche di argomenti di grande rilevanza pertinenti gli interessi culturali degli specialisti interessati; NORME REDAZIONALI 1) Il testo dell articolo deve essere editato utilizzando il programma Microsoft Word per Windows o Macintosh. Agli AA. è riservata la correzione ed il rinvio (entro e non oltre 5 gg. dal ricevimento) delle sole prime bozze del lavoro. 2) L Autore è tenuto ad ottenere l autorizzazione di «Copyright» qualora riproduca nel testo tabelle, figure, microfotografie od altro materiale iconografico già pubblicato altrove. Tale materiale illustrativo dovrà essere riprodotto con la dicitura «per concessione di» seguito dalla citazione della fonte di provenienza. 3) Il manoscritto dovrebbe seguire nelle linee generali la seguente traccia: Titolo Conciso, ma informativo ed esauriente. Nome, Cognome degli AA., Istituzione di appartenenza senza abbreviazioni. Nome, Cognome, Foto a colori, Indirizzo, Telefono, Fax, del 1 Autore cui andrà indirizzata la corrispondenza. Introduzione Concisa ed essenziale, comunque tale da rendere in maniera chiara ed esaustiva lo scopo dell articolo. Parole chiave Si richiedono 3/5 parole. Corpo dell articolo Il contenuto non deve essere inferiore alle 30 cartelle dattiloscritte (2.000 battute cad.) compresa la bibliografia e dovrà rendere lo stato dell arte aggiornato dell argomento trattato. L articolo deve essere corredato di illustrazioni/fotografie, possibilmente a colori, in file ad alta risoluzione (salvati in formato.tif,.eps,.jpg). Le citazioni bibliografiche nel testo devono essere essenziali, ma aggiornate (non con i nomi degli AA. ma con la numerazione corrispondente alle voci della bibliografia), dovranno essere numerate con il numero arabo (1) secondo l ordine di comparsa nel testo e comunque in numero non superiore a Seminari di Ematologia Oncologica Periodico di aggiornamento sulla clinica e terapia delle emopatie neoplastiche Bibliografia Per lo stile nella stesura seguire le seguenti indicazioni o consultare il sito International Committee of Medical Journal Editors Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals: Sample References. Es. 1 - Articolo standard 1. Bianchi AG, Rossi EV. Immunologic effect of donor lymphocytes in bone marrow transplantation. N Engl J Med. 2004; 232: Es. 2 - Articolo con più di 6 autori (dopo il 6 autore et al.) 1. Bianchi AG, Rossi EV, Rose ME, Huerbin MB, Melick J, Marion DW, et al. Immunologic effect of donor lymphocytes in bone marrow transplantation. N Engl J Med. 2004; 232: Es. 3 - Letter 1. Bianchi AG, Rossi AV. Immunologic effect of donor lymphocytes [Letter]. N Engl J Med. 2004; 232: Es. 4 - Capitoli di libri 1. Bianchi AG, Rossi AV. Immunologic effect of donor lymphocytes. In: Caplan RS, Vigna AB, editors. Immunology. Milano: MacGraw- Hill; 2002; p Es. 5 - Abstract congressi (non più di 6 autori) 1. Bianchi AG, Rossi AV. Immunologic effect of donor lymphocytes in bone marrow transplantation [Abstract]. Haematologica. 2002; 19: (Suppl. 1): S178. Ringraziamenti Riguarda persone e/o gruppi che, pur non avendo dignità di AA., meritano comunque di essere citati per il loro apporto alla realizzazione dell articolo. Edizioni Internazionali Srl Divisione EDIMES EDIZIONI MEDICO SCIENTIFICHE - PAVIA Via Riviera, Pavia Tel r.a. Fax edint.edimes@tin.it

4 3 Editoriale GIORGIO LAMBERTENGHI DELILIERS Fondazione IRCCS Ca Granda, Ospedale Maggiore Policlinico di Milano Il rapido sviluppo delle conoscenze scientifiche e delle tecnologie hanno fatto fiorire nell ultimo decennio in campo oncoematologico un numero elevato d informazioni che hanno portato a modificare classificazioni patogenetiche e cliniche, nonché proporre nuove strategie terapeutiche. Tali avanzamenti hanno anche creato nuovi quesiti e aperto discussioni che Seminari di Ematologia Oncologica propone in questo numero limitatamente ad alcune neoplasie del sangue. La domanda è se l analisi dell espressione genica, la FISH, la PCR quantitativa rappresentano un indispensabile alternativa o sono equivalenti alla tradizionale citogenetica e alle indagini morfologiche e immunofenotipiche. La risposta è nella maggior parte dei casi affermativa per la loro documentata utilità nel perfezionamento della diagnosi, nel monitoraggio della malattia minima residua e nella stratificazione prognostica. Tuttavia non si può escludere che ulteriori studi sperimentali e clinici sono spesso necessari per giustificare e standardizzare il loro uso nell ambito di una routine clinica. Anche la possibilità di valutare il rischio clinico sulla base di fattori prognostici vecchi e nuovi, e la recente introduzione di farmaci non citotossici ad attività elettiva sulle lesioni molecolari o sul microambiente, hanno drammaticamente modificato l approccio terapeutico di alcune malattie come il mieloma multiplo, la leucemia mieloide cronica e le sindromi mieloproliferative. Ma nella stesso tempo hanno obbligato a programmare studi clinici randomizzati con l obiettivo di definire il trattamento migliore per ogni singolo paziente. Anche l opzione trapiantologica che oggi viene sempre più frequentemente offerta anche a pazienti in età avanzata, non è scevra di controversie per quanto riguarda il tipo di sorgente di cellule staminali, l aggressività del condizionamento e la scelta del donatore. Per risolvere queste e altre controversie sono in corso ricerche cliniche che hanno il compito di raggiungere un parere unanime su quale sia la migliore scelta in termini di diagnosi circostanziata, sopravvivenza e qualità di vita per i pazienti.

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6 5 Diagnostica citogenetica e molecolare CRISTINA MECUCCI Ematologia, Università di Perugia, Ospedale Universitario Cristina Mecucci n INTRODUZIONE Gli sviluppi tecnologici degli ultimi decenni, grazie al progetto genoma, hanno fatto fiorire un numero impressionante di nuove informazioni biologiche. L ematologia, una disciplina all avanguardia nella ricerca traslazionale, facendo tesoro di nuove tecnologie e nuove acquisizioni, ne ha costantemente incorporato e interpretato il significato al fine di arricchire i test diagnostici, migliorare le classificazioni patogenetiche e cliniche, nonché disegnare nuovi approcci terapeutici. Nelle prossime pagine saranno discusse alcune domande ancora aperte e punti di vista sull utilizzo di approcci diagnostici che forniscono informazioni sulle caratteristiche biologiche delle emopatie maligne. I paragrafi che seguono sono dedicati ad alcune domande che a tutt oggi possono non vedere il totale accordo di vedute e/o necessitino di ulteriori studi sperimentali e clinici. Parole chiave: citogenetica, FISH, diagnosi, prognosi. Indirizzo per la corrispondenza Cristina Mecucci Ematologia Università di Perugia Ospedale Universitario P.zza Università, Perugia crimecux@unipg.it n IL GENE EXPRESSION PROFILE (GEP) SOSTITUISCE LA DIAGNOSI CITOGENETICO-MOLECOLARE NELLE LEUCEMIE ACUTE? Mentre l analisi del DNA ci informa sulle aberrazioni del codice genetico da cui la cellula maligna è affetta, l analisi dell espressione genica ci dice come la cellula stia funzionando, attraverso il riconoscimento e dosaggio degli RNA messaggeri trascritti dall intero genoma codificante, e in un singolo test. Sono state sviluppate varie piattaforme per ottenere profili di espressione sempre più completi. Affymetrix è una delle prime tecnologie disponibili e da anni rappresenta la piattaforma più citata nelle pubblicazioni scientifiche in materia. Illumina è un altra piattaforma molto interessante che si è affermata più di recente nel campo degli arrays, dalla genotipizzazione al GEP. Leucemie acute mieloblastiche (LAM) La classificazione corrente vede l integrazione dell esame morfologico con l immunofenotipo, la citogenetica e la biologia molecolare. L identificazione dei cosiddetti marcatori citogenetico-molecolari ha modificato a fondo la classificazione (1), dal momento che il riarrangiamento genico si è dimostrato dominante dal punto di vista del fenotipo clinico e in particolare della prognosi della leucemia associata, a prescindere anche dalla morfologia dei blasti, almeno secondo i criteri standardizzati dal Gruppo FAB, e dall espres-

7 6 Seminari di Ematologia Oncologica sione di antigeni cellulari rilevati dall analisi immunofenotipica con anticorpi monoclonali. La validazione clinica dell approccio citogeneticomolecolare è patrimonio dell ematologia clinica in tutto il mondo e orienta la scelta sui diversi approcci terapeutici incluso il trapianto di midollo. Si può ancora migliorare? Probabilmente sì, e il potenziale informativo del GEP ha ovviamente ulteriormente sollecitato questa domanda. È indubbio che il raggruppamento unsupervised di casistiche di LAM sulla base dell espressione genica è in grado di selezionare sottogruppi che coincidono con la lesione citogenetico-molecolari, tipicamente t(8;21); t(15;17); inv(16); mutazioni di NPM1(2-5). Un punto importante nell analisi di sottogruppi sulla base del GEP è che i clusters vengono estrapolati in considerazione delle somiglianze che però possono prescindere dalla lesione citogenetico-molecolare ed essere legate ad altri fattori, come ad esempio lo stadio di maturazione delle cellule appartenenti alla popolazione leucemica, come rappresentato dalle caratteristiche immunofenotipiche. Questa è una delle ragioni che potrebbero spiegare le differenze osservate nel GEP all interno di sottogruppi molecolari, come ad esempio le leucemie con t(15;17) (6) o leucemie con mutazioni di CEBPA (7). Esistono sottogruppi prognostici di LAM definiti dal GEP e non dall approccio citogenetico-molecolare? La risposta sembra essere affermativa se si considerano ad esempio le LAM a cariotipo normale all interno delle quali Metzeler et al. (8) hanno mostrato che la ipo- o iper-espressione di un set di 86 geni può identificare due situazioni distinte in termini di sopravvivenza e ricaduta. Appare abbastanza chiaro che la potenza analitica del GEP abbia un impatto non solo sulla comprensione della biologia delle LAM ma anche sulla conduzione clinica e la scelta delle strategie terapeutiche (9). Il GEP oggi ha quindi un ruolo nell algoritmo diagnostico a integrazione delle analisi citogenetico-molecolari e ulteriori avanzamenti sono attesi attraverso validazioni multicentriche e miglioramenti tecnologici che favoriscano la riproducibilità e la facilità di preparazione del materiale biologico da analizzare, nonché riducano i prezzi dell analisi. Un ulteriore aspetto affascinante sarà l arricchimento dei software con analisi simultanea del GEP e dei profili di microrna e SNPs. Tutto ciò in una prospettiva di ricerca di base e applicata. Leucemie Acute Linfoblastiche (LAL) L impatto clinico dei sottogruppi citogeneticomolecolari nelle LAL-B è stato particolarmente curato nella recente classificazione WHO (1). Il GEP ha un buon valore predittivo, per ciò che riguarda la t(12,21) (10), le traslocazioni coinvolgenti il gene MLL (11); la t(1,19) nella fusione TCF3/PBX1 (11) e la traslocazione Burkitt t(8;14) - IgH/MYC (12), ma il grande limite di tale approccio è di non riconoscere uno dei più importanti sottogruppi dal punto di vista prognostico, segnatamente quello associato alla traslocazione Philadelphia t(9,22)-bcr/abl1 (13). Nelle LAL-T i contributi diagnostici della citogenetica convenzionale sono stati scarsissimi, mentre recentemente si sta delineando una classificazione più completa a partire dai risultati della genotipizzazione, delle mutazioni geniche e del GEP. Sono stati così proposti quattro grandi raggruppamenti funzionali (difetti del ciclo cellulare, del differenziamento, della proliferazione e sopravvivenza e della capacità di autoriproduzione) il cui significato prognostico deve essere però ancora chiarito (14). Un indicazione importante viene dal GEP per la distinzione della LAL-T dal linfoma linfoblastico T, in quanto la prima mostra alti livelli di espressione di CD47, mentre il secondo di MLL (15), evidenziando differenze molecolari in due condizioni cliniche fino ad oggi per lo più considerate come una stessa entità biologica. n CITOGENETICA, FISH, RQ-PCR: UNO O PIÙ TEST NEL MONITORAGGIO DELLA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA IN TRATTAMENTO CON INIBITORI DELLE TIROSIN CHINASI? L introduzione nella pratica clinica del primo inibitore delle tirosin-chinasi (TKI), l imatinib mesilato, ha modificato completamente le prospettive terapeutiche dei pazienti affetti da leucemia mieloide cronica Philadelfia positiva (LMC-Ph+)

8 Diagnostica citogenetica e molecolare 7 (16, 17). Oltre il 90% delle LMC de novo ottiene oggi una risposta citogenetica completa. Tuttavia una frazione di pazienti può mostrare resistenza al trattamento con imatinib dovuta a mutazioni di ABL1, potenziale bersaglio di inibitori delle tirosin chinasi di seconda generazione. L evoluzione delle opzioni terapeutiche per i pazienti LMC Ph+ ha reso necessario un monitoraggio particolarmente accurato. Citogenetica convenzionale La citogenetica convenzionale (CC) al momento della diagnosi è sicuramente ancora il metodo più convalidato e universalmente riconosciuto in quanto permette di definire una serie di informazioni che possono successivamente essere utili nel monitoraggio. Circa il 5-10% dei casi di LMC mostra la presenza di traslocazioni varianti o complesse con il coinvolgimento di uno o più cromosomi/loci oltre il 9 e il 22 (18) (Figura 1). Tuttavia, se nei pazienti trattati con interferone veniva descritta l associazione delle traslocazioni varianti con una prognosi più severa rispetto alla t(9;22) classica, questo dato sembrerebbe annullarsi in era imatinib in termini di risposta al trattamento, durata della risposta, sopravvivenza (19, 20). L analisi del cariotipo permette inoltre di evidenziare la presenza di anomalie cromosomiche addizionali (trisomia del cromosoma 8, doppio FIGURA 1 - Cariotipo dopo bandeggio G: 46,XX,t(5;9;22) (q12;q34;q11). Le frecce indicano i 3 cromosomi coinvolti nella traslocazione complessa che include il cromosoma Philadelphia con riarrangiamento BCR/ABL1. Anomalia Numero (%) Cromosoma 8 60 (37%) Cromosoma 7 27 (17%) del 7q 8 inv(7)(p15q22) 1 Cromosoma (7%) del 20q 11 Cromosoma Y 29 (18%) -Y 25 + Y 4 Cromosoma 1 3 (2%) dup(1)(q21q42) 1 dup(1)(q11q21) 2 Traslocazioni 16 (10%) t(x;17)(q22;q36) 1 t(15;16)(q15;q24) 1 t(11;17) 1 t(6;7)(p24;q21) 1 t(3;11)(q27;q13) 1 t(7;22)(q22;q13) 1 t(2;3)(q21;p14) 1 t(1;6)(p32;p24-25) 1 t(3;21)(q27;q22) 1 t(3;10)(q26;q22) 1 t(7;17)(q11;q21) 1 t(6;12)(p23;q13) 1 t(10;15) 1 t(4;8)(q22;p22) 1 t(2;6)(p23;q23) + 1 ns 2 Altre 15 (9%) inv(1)(q12q32),del(7)(q22) 1 ider(20)(q10),t(20;21)(q22;q22) 1 -Y,+15 1 ins(3;4)(q21;q31.1) 1 der(5)ins(5;5)(p15;q22q12), del(5)(q31q35),del(6)(q23) 1 del(5q),add(21)(p+) 1 add(12)(p13);del(18)(q21) 1-7,der(17)ins(7;17)(p?;p?) 1-22+mar 1 +8+mar 1 inv(1)(p?32.3p?31.2), del(10)(q24q24) 1 del(5)(q13q33),add(21)(p11.2) 1-5,-7,add(12)(p11.2),+mar 1 del(10)(q26) 1 anomalia cromosoma 10 non specificata 1 Totale Pazienti: Totale con anomalie emergenti: 161 (4.13%) TABELLA 1 - Anomalie citogenetiche clonali descritte nelle cellule Philadelphia negative in pazienti con LMC in trattamento con imatinib.

9 8 Seminari di Ematologia Oncologica Philadelphia, isocromosoma 17q e trisomia del cromosoma 19) che si osservano in corso di accelerazione di malattia (20-40%) e più frequentemente nell evoluzione verso la crisi blastica (>80%) (21). L impatto clinico delle anomalie clonali addizionali vede le anomalie complesse associate a cattiva prognosi, mentre tra le anomalie singole la perdita del cromosoma Y si associa ad una buona risposta al trattamento a differenza della trisomia 8, del(5q) e alterazioni a carico del cromosoma 17 (22). La valutazione della quantità di cellule Philadelphia positive effettuata su un numero di metafasi, convenzionalmente fissato a 20, consente di differenziare il tipo di risposta al trattamento con imatinib: assente (100%), minima (95%), minore (95%-66%), parziale (65%-36%), completa (nessuna). L analisi del cariotipo, durante il trattamento, permette anche di valutare la possibile comparsa di anomalie addizionali nel clone Ph- (Tabella 1). Molti gruppi di lavoro hanno riportato l insorgenza di queste aberrazioni citogenetiche durante il trattamento con TKI. È ancora poco chiaro quale sia l incidenza, l eziologia e il valore prognostico di tali anomalie (23, 24). La trisomia del cromosoma 8 è sicuramente l anomalia più frequente, in alcuni casi è anche descritta la monosomia del cromosoma 7 (25, 26). Questi cloni cellulari sembrano mostrare un andamento fluttuante e sono stati anche descritti casi di negativizzazione spontanea (27). D altro canto, nonostante le anomalie che insorgono nel clone Ph- siano spesso quelle tipiche delle sindromi mielodisplastiche (SMD), l associazione di queste aberrazioni con una franca SMD è abbastanza rara, ma definitivamente provata per le alterazioni del cromosoma 7 e i cariotipi complessi (28-30). Da tutto ciò risulta evidente come al momento non si possa prescindere dall analisi di citogenetica convenzionale alla diagnosi e nel monitoraggio del paziente in trattamento con TKI. Con quale frequenza? Le nuove linee guida proposte dallo European Leukemia Net (ELN) suggeriscono la valutazione citogenetica a 3 e a 6 mesi dall inizio del trattamento; poi ogni 6 mesi fino al raggiungimento della risposta citogenetica completa e successivamente ogni 12 mesi nei casi in cui sia possibile effettuare un monitoraggio molecolare e in ogni caso in cui si sospetti una risposta sub-ottimale o l insorgenza di una resistenza alla terapia (31). FISH: in alternativa o valore aggiunto? La definizione di risposta citogenetica completa sulla base del cariotipo richiede l analisi di un adeguato numero di metafasi e questo non è sempre facilmente ottenibile su campioni di pazienti sottoposti a trattamento. Anche per questo motivo, negli ultimi anni, l utilizzo dell ibridazione in situ in fluorescenza su nuclei interfasici (I-FISH) è notevolmente aumentato, soprattutto nei casi privi di metafasi valutabili. La FISH si è dimostrata molto utile per la caratterizzazione di quell 1% dei pazienti con LMC che mostrano un cariotipo normale e una biologia molecolare positiva per il riarrangiamento BCR-ABL1. Un analisi dettagliata in FISH di questi casi mostra che il prodotto di fusione BCR-ABL1 si origina con meccanismi diversi: per inserzione diretta del gene BCR in ABL1 e viceversa (Figura 2), oppure con riarrangiamenti complessi che possono FIGURA 2 - La FISH in metafase con la sonda LSI BCR/ABL dual color dual fusion (Vysis, Abbott) rivela l inserzione criptica del gene ABL1/9q34 nel gene BCR/22q11: segnale di fusione rosso/verde (freccia). I due segnali rossi sui cromosomi 9 corrispondono ad ABL1; il segnale verde sul cromosoma 22 corrisponde al gene BCR non coinvolto nel riarrangiamento.

10 Diagnostica citogenetica e molecolare 9 FIGURA 3 - A) Cariotipo dopo bandeggio G: 46,XY,t(9;22)(q34;q11); B) Rappresentazione di un pattern di ibridazione normale e in presenza del riarrangiamento BCR-ABL1 (LSI BCR-ABL dual color dual fusion, Vysis-Abbott). C) Pattern di ibridazione in paziente Philadelphia-positivo in cui sono presenti delezioni accompagnanti la traslocazione: perdita del 5 ABL1 (nucleo a sinistra); perdita del 5 ABL1 e del 3 BCR (nucleo a destra). coinvolgere materiale cromosomico fiancheggiante i geni BCR e ABL1 e anche altri cromosomi oltre il 9 e il 22 (32). I pazienti che mostrano questo tipo di riarrangiamenti criptici in presenza di un cariotipo normale non possono avvalersi della CC per il monitoraggio durante il trattamento e quindi in tutti questi casi la FISH è sicuramente di grande aiuto. L analisi in FISH ha anche permesso di evidenziare alcuni pattern di ibridazione anormali che, in circa il 10-15% dei pazienti con LMC Ph+, coincidevano con delezioni submicroscopiche adiacenti al punto di rottura sul der(9) (33, 34) (Figura 3). La presenza delle delezioni sul der(9) non correla con caratteristiche cliniche particolari, rischio Sokal o fase della malattia, ma l eventuale valore prognostico in pazienti trattati con TKI è ancora motivo di dibattito (34-36). Uno studio cooperativo tedesco ha concluso per il valore prognostico della dimensione del tratto genomico deleto: le delezioni più estese a livello molecolare correlerebbero con una prognosi sfavorevole (36). Il GIMEMA CML WP (Gruppo Italiano Malattie Ematologiche Adulto Chronic Myeloid Leukemia Working Party) ha recentemente pubblicato un lavoro in cui la citogenetica convenzionale viene paragonata alla I-FISH nella definizione di risposta citogenetica completa durante il monitoraggio. Storicamente, la definizione del numero di cellule Ph+ presenti in un controllo normale è stata falsata dall utilizzo di sonde che mostravano la singola fusione e che determinavano una quota di falsi positivi molto alta, maggiore o uguale al 5%. L utilizzo di sonde di nuova generazione ha permesso di abbassare notevolmente il cutoff fissandolo intorno all 1%. Pazienti che avevano ottenuto una risposta citogenetica completa sono stati valutati anche con I-FISH ed è emerso che un 13% avevano una quota di nuclei positivi compresi tra l 1 e il 5%; e che il 4% aveva più del 5%, a dimostrazione che la I-FISH ha una sensibilità maggiore rispetto alla CC nel definire la quota di malattia minima residua durante il trattamento (37). Di rilievo pratico è che molti lavori mostrano una buona concordanza nell utilizzo della I-FISH su sangue periferico in alternativa al midollo osseo (38-40). RQ-PCR come unico strumento di monitoraggio Le metodologie utilizzate per identificare i trascritti BCR-ABL1 si sono evolute negli anni. All inizio era solo possibile identificare la presenza o l as-

11 10 Seminari di Ematologia Oncologica FIGURA 4 - Sensibilità delle metodiche utilizzate per valutare la risposta al trattamento. senza dei trascritti attraverso un singolo step di amplificazione o 2-step nested con primers interni per aumentare la sensibilità (41-43). Successivamente il numero dei trascritti veniva espresso come microgrammi di RNA (44) o come ratio BCR-ABL/ABL in scala logaritmica (45). Questa metodica è stata poi adattata alla real time PCR quando questa è diventata disponibile (46, 47). La quantificazione del trascritto BCR- ABL su scala logaritmica è stato applicato su una grande casistica di pazienti con LMC seguiti per un follow-up di 5 anni e arruolati nell International Randomized Study of Interferon versus STI 571 (IRIS study). Questo lavoro ha dimostrato che nessun paziente con risposta citogenetica completa e riduzione del livello di trascritto minimo di 3 log, equivalente ad una risposta molecolare maggiore (RMM) a 12 e 18 mesi, ha una progressione di malattia a 60 mesi dall inizio dell imatinib. D altra parte il residuo della quantità di trascritto a 12 mesi, quantificato attraverso RQ-PCR in termini di riduzione logaritmica, ha un significato predittivo per il rischio di progressione nei pazienti che hanno ottenuto la remissione citogenetica completa (48). Molti altri lavori hanno evidenziato che la rapidità nell ottenimento della RMM ha un significato prognostico (49-51). Sulla base di questi dati, visto il suo importante significato prognostico, ora la RQ-PCR è considerata fondamentale nel monitoraggio dei pazienti con LMC sottoposti a trattamento con TKI e il non raggiungimento della risposta molecolare maggiore a 18 mesi dall inizio del trattamento è considerata una risposta sub-ottimale e richiede una attenta rivalutazione e una possibile variazione del trattamento (52). Proprio per questo motivo un altro aspetto fondamentale è la standardizzazione dei protocolli internazionali e l armonizzazione della quantificazione di BCR-ABL1 al fine di riportare i risultati su scala internazionale (53, 54). Il National Institutes of Health (NIH), ha proposto di eliminare il concetto di riduzione logaritmica introducendo quello di numeric International Scale (IS) che esprime l ammontare del trascritto come percentuale rispetto ad un gene di controllo in presenza di 2 controlli interni di valore noto. Il primo valore, cioè il basale, è stato designato al 100% mentre il secondo rappresenta la RMM, cioè la riduzione di 3 log dal basale fissato allo 0,1%. La conversione dei valori dei singoli laboratori in IS è possibile con l applicazione di fattori di conversione specifici per ogni diverso laboratorio (55). Ovviamente il fine di qualsiasi trattamento con TKI è l ottenimento della risposta molecolare completa (RMC), che non significa eradicazione della leucemia ma assenza di trascritto BCR- ABL determinabile con la PCR. Nella gestione

12 Diagnostica citogenetica e molecolare 11 clinica del paziente in trattamento con TKI le linee guida suggeriscono che la RQ-PCR venga eseguita ogni 3 mesi anche nei pazienti che abbiano raggiunto la RMM. Un incremento sequenziale del livello di trascritto può servire a identificare precocemente i pazienti che stanno perdendo la risposta o suggerire lo studio delle mutazioni di BCR-ABL. In conclusione, alla luce di quanto sopra è ancora difficile scegliere un solo approccio per il monitoraggio dei pazienti con LMC Ph+ sottoposti a trattamento con TKI. Va da sé che la PCR quantitativa, in quanto metodica di più alta sensibilità e specificità, deve riscuotere il massimo di attenzione negli affinamenti tecnologici e validazione clinica (Figura 4). La citogenetica convenzionale mantiene comunque un suo ruolo, sia dal punto di vista quantitativo che qualitativo anche dopo l ottenimento della RMC, almeno fino a quando non si capirà il significato clinico delle aberrazioni citogenetiche che insorgono durante il trattamento con TKI nel clone Philadelfia negativo. n LA DELEZIONE 20Q E LA MONOSOMIA Y (-Y) ISOLATE SONO ANOMALIE CLONALI SUFFICIENTI PER LA DIAGNOSI DI SINDROME MIELODISPLASTICA IN ASSENZA DI SEGNI MORFOLOGICI? La delezione del braccio lungo del cromosoma 20 è una delle più comuni anomalie cromosomiche associate a disordini mieloidi. È stato postulato che questa delezione possa risultare nella perdita di eterozigosi o nell aploinsufficienza di geni soppressori che potrebbero contribuire alla patogenesi di disordini mieloidi, quali le SMD. Sebbene il gene/i target sia (no) ancora da identificare, l ampiezza della delezione è variabile e il restringimento con SNP arrays ha definito due regioni comuni di delezione: la prima di 2.5Mb tra la banda 20q11.23 e 20q12, la seconda che comprende 1.8 Mb all interno nella banda 20q13.12 (56, 57). La delezione del braccio lungo del cromosoma 20 rappresenta generalmente un fattore prognostico favorevole soprattutto quando presente come anomalia citogenetica isolata fin dalla diagnosi. Il significato clinico cambia se un 20q- si sviluppa più tardivamente, come anomalia addizionale, anche in piccoli subcloni, indicando un evoluzione di malattia ed una prognosi infausta (58). Se esistano differenze molecolari tra i cromosomi 20q- identificati in fasi diverse di malattia non è noto. Un osservazione interessante è che in pazienti con sindrome di Shwachman, che comprende una citopenia, neutropenia, e un aumentato rischio di SMD, una delezione 20q può essere identificata come anomalia clonale, a volte fluttuante, spontaneamente e senza sviluppo di mielodisplasia anche in follow-up di molti anni (59, 60). Il 20qè l anomalia citogenetica più frequente in casi di SMD che si presentano con trombocitopenia isolata (61) ed è stata inoltre ampiamente documentata in pazienti privi di evidenti segni di displasia all analisi morfologica, raramente anche in presenza di disordini autoimmuni (62), o in associazione ad anomalie morfologiche minime nelle prime fasi dell evoluzione della malattia (63, 64). Inoltre una delezione del braccio lungo del cromosoma 20 è stata identificata in pazienti con precedente diagnosi di porpora trombocitopenica idiopatica (ITP) suggerendo la necessità di una precisa diagnosi differenziale (65) con forme di SMD che si presentino con trombocitopenia isolata. In quest ottica uno dei punti chiave del passaggio tra la terza e la quarta edizione della classificazione WHO (1) è stato quello di identificare una serie di anomalie citogenetiche clonali che, quando presenti in pazienti con citopenie refrattarie, consentano di effettuare una diagnosi di SMD, anche in assenza di segni morfologici displastici. Tra queste non è compresa la delezione del braccio lungo del cromosoma 20 (1). La perdita del cromosoma Y (-Y) è un fenomeno fisiologico correlato all invecchiamento, comune nelle cellule midollari dei soggetti con età superiore ai 70 anni (66, 67). Ciò nonostante è stato suggerito che possa rappresentare un evento leucemico clonale come evidenziato dalla scomparsa del clone-y e ripristino delle cellule XY durante la remissione da leucemia acuta (68, 69). L associazione tra la perdita del cromosoma Y come anomalia cromosomica isolata ed i disor-

13 12 Seminari di Ematologia Oncologica dini ematologici, quali LAM e SMD, è stato, ed è tuttora, oggetto di dibattito scientifico a causa della correlazione di entrambi i disordini con l età avanzata. Un ampio studio su 215 pazienti maschi che mostravano -Y come anomalia isolata ha evidenziato che soltanto il 10% dei pazienti di controllo perdeva il cromosoma Y in più del 75% delle cellule, in contrasto con il 29% dei soggetti affetti da malattia ematologica. In base a questi dati gli autori hanno suggerito che soltanto cloni -Y di entità superiore al 75% dovrebbero essere considerati marcatori indicativi di disordine ematologico (66). In linea con queste osservazioni, in un recente lavoro finalizzato a valutare il significato dell entità del clone -Y, è stato confermato che la perdita del cromosoma Y isolata correla con patologie mieloidi solo quando la dimensione del clone supera il 75% delle cellule. D altra parte negli individui in cui è presente una proporzione di cellule -Y compresa tra il 75 e il 99% si osserva un incremento dell incidenza di SMD/LAM di circa 4 volte rispetto ai controlli. Ciò ha spostato l attenzione sulla completa assenza di cellule midollari normali per l evidenziazione di SMD/LAM (70). A complicare l interpretazione del fenomeno, in pazienti affetti da disordine ematologico, la perdita del cromosoma Y può comportarsi come lesione genetica secondaria in associazione a t(8;21) (71) e t(9;22) (72). A questo proposito è interessante citare un recente studio retrospettivo multicentrico che ha messo a confronto la risposta all imatinib di 30 pazienti affetti da leucemia mieloide cronica (LMC) con -Y in aggiunta a t(9;22) con quella di 30 pazienti maschi di controllo che presentavano LMC e t(9;22) isolata. L impatto negativo della perdita del cromosoma Y è risultato estremamente marcato quando questa era presente come sub-clone dimostrando che tale anomalia dovrebbe essere presa in considerazione nella valutazione prognostica dei pazienti maschi affetti da LMC (73). In rari pazienti con leucemia acuta promielocitica (LAP) è stata riportata perdita del cromosoma Y come fenomeno clonale non correlato all età (74), nonché descritta come unica anomalia cariotipica in un paziente affetto da LAP con delezione submicroscopica dell intera porzione al 3 di uno dei due alleli del gene RAR (75). n LA CITOGENETICA CONVENZIONALE E LA FISH SONO EQUIVALENTI NELLA DIAGNOSI DI SINDROME 5Q-? La delezione del braccio lungo del cromosoma 5 è un aberrazione cromosomica che può essere associata a diverse condizioni cliniche e molecolari. Quando la del(5q) è isolata, identifica la sindrome del 5q-, un entità clinico-ematologica specifica, mentre quando è presente in cariotipi complessi si associa a SMD e LAM, de novo o secondarie a trattamenti chemio- e/o radio-terapici (1). Quando isolato il 5q- correla con una buona prognosi (sopravvivenza: mesi), la presenza di un anomalia citogenetica addizionale riduce la sopravvivenza media, mentre la presenza di un 5q- in un cariotipo complesso conferisce una prognosi severa con elevato rischio di trasformazione leucemica. Quindi il contesto citogenetico in cui si configura un 5q- è di fondamentale importanza ai fini del corretto inquadramento clinico-ematologico del paziente in termini di stratificazione prognostica e conseguente scelta terapeutica. Pertanto, la diagnosi di 5q- è imprescindibile dal contesto genomico in cui l evento molecolare si inserisce. Malgrado il 5q- sia caratterizzato da una grande variabilità di estensione da paziente a paziente anche nell ambito della stessa malattia (76), gli studi in FISH hanno identificato due distinte regioni di delezione minima comune, che possono essere perse simultaneamente o alternativamente. In particolare nella sindrome del 5q- è tipicamente deleta la banda 5q33 mentre nelle altre SMD/LAM con 5q- è deleta la banda 5q31. Mentre la FISH è stata di enorme aiuto nella caratterizzazione molecolare del 5q-, permettendo di identificare geni critici nell aploinsufficienza determinata dalla perdita di materiale del 5q-, il suo contributo nella diagnosi è ancora piuttosto controverso (77-80). Infatti, la FISH con l utilizzo delle sonde commerciali attualmente disponibili per le bande 5q31 e 5q33-34 ha mostrato che in presenza di un esame cariotipico adeguato per numero di metafasi la FISH in interfase correla perfettamente con la citogenetica, mentre, nei casi con crescita cellulare subottimale, la pos-

14 Diagnostica citogenetica e molecolare 13 FIGURA 5 - FISH su nuclei interfasici con la sonda LSI CSF1R(5q31)/LSI D5S721-D5S23 (5p15). Il nucleo in alto a sinistra mostra un pattern di ibridazione normale (2 rossi/2 verdi) mentre gli altri due un pattern compatibile con una delezione del locus 5q31 (2 verdi/1 rosso). sibilità di studiare anche le cellule non proliferanti fa aumentare la sensibilità per la diagnosi di 5q- (Figura 5). La delezione del 5q può rappresentare un evento molecolare criptico, cioè al di sotto del limite di risoluzione del bandeggio convenzionale nel 2-4% dei casi di SMD/LAM a cariotipo normale (81, 82). Inoltre, l applicazione della FISH a casi di SMD/ LAM con cariotipo complesso ha rivelato che la perdita di materiale a livello del 5q può essere un evento male interpretato a causa della complessità delle anomalie citogenetiche (83). La FISH, invece, non sembrerebbe più sensibile rispetto alla citogenetica convenzionale nel monitoraggio di malattia in casi di SMD in trattamento con lenalidomide (79). Malgrado la FISH determini un aumento della sensibilità diagnostica per il 5q-, sono state riportate FISH falsamente negative in casi con 5q- alla citogenetica convenzionale (79, 80). Questo dato è spiegabile dal fatto che il clone 5q- positivo potrebbe avere un basso indice proliferativo ed essere scarsamente rappresentato nel compartimento cellulare non proliferante esplorato dalla FISH in interfase. Alternativamente le sonde utilizzate per l analisi potrebbero non essere appropriate per rilevare la regione 5q specificatamente deleta nel singolo paziente. Infatti, le differenze di estensione delle regioni delete pongono il quesito sul tipo di test da utilizzare per non avere o ridurre al minimo il rischio di falsi negativi. Un solo studio, a tutt oggi, ha messo a confronto due sonde, la sonda per il gene EGR1/5q33 e quella per CSF1R/5q31, al fine di stabilire eventuali differenze nella sensibilità dell analisi in FISH del 5q- (80). In sintesi la FISH con sonde genomiche specifiche per il 5q31-33 ha una sensibilità maggiore del cariotipo per la diagnosi di 5q- nei casi in cui l evento è citogeneticamente criptico o mascherato; mentre la citogenetica convenzionale fornisce l informazione sullo stato genomico globale della cellula leucemica. L uso integrato delle due metodiche nello screening diagnostico delle SMD/AML garantisce un adeguata caratterizzazione patogenetica. Nei casi in cui la citogenetica è informativa la FISH non sembra essere indispensabile per la diagnosi e il monitoraggio. n L ARS-T È DA CONSIDERARE UN ENTITÀ NELL AMBITO DELLE SINDROMI MIELODISPLASTICHE O DEI DISORDINI MIELOPROLIFERATIVI CRONICI? Le SMD sono caratterizzate da ematopoiesi insufficiente e pancitopenia periferica, mentre le sindromi mieloproliferative croniche (SMC) sono tipicamente associate ad una produzione in eccesso di cellule ematopoietiche mature. Tuttavia è oggi riconosciuta l esistenza di condizioni che presentano caratteristiche intermedie tanto che la classificazione dell Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) prevede la categoria di condizioni borderline SMD/SMC. Tra queste, l anemia refrattaria con sideroblasti ad anello, associata a marcata trombocitosi (ARS-T), è un disordine clonale della cellula staminale caratterizzato da displasia eritrocitaria, eritroblasti con accumulo di ferritina a livello dei mitocondri perinucleari (i cosiddetti sideroblasti ad anello), maturazione eritrocitaria difettiva, anemia e trombocitosi (84-86). A supporto della componente mieloproliferativa di questo disordine è stato ampiamente documentato che pazienti che rispettano i criteri di classificazione WHO per le ARS-T presentano

15 14 Seminari di Ematologia Oncologica le mutazioni JAK2V617F e MPLW515L con un incidenza relativa pari a quella riscontrata nelle trombocitemie essenziali (TE) (87-90). Esiste effettivamente una stretta relazione tra ARS-T e TE, inclusa la prognosi. La peculiarità che distingue queste due entità è la proporzione dei sideroblasti ad anello (>15%) che, comunque, non è specifica dato che può essere riscontrata in altri disordini mieloidi cronici (86). D altro canto la morfologia midollare, megacariociti compresi, dell ARS-T coincide con quelle dell anemia refrattaria con sideroblasti ad anello (ARS) (91). È stato suggerito che l ARS-T si sviluppi a partire da una preesistente ARS in seguito all acquisizione di anomalie genetiche aggiuntive quali mutazioni di JAK2, MPL o altri geni (84). Più recentemente sono state riportate in pazienti con diagnosi di ARS-T mutazioni nei geni TET2 e ASXL1 in assenza delle mutazioni JAK2V617F e MPLW515L, indicando che lo stesso fenotipo clinico possa originarsi in associazione con diverse anomalie molecolari in presenza di un evento comune da definire (92). È stato anche proposto che l ARS-T possa derivare dalla coesistenza nello stesso soggetto di due condizioni: TE e RARS (93, 94). L incidenza annuale della ET è di nuovi casi su persone mentre le ARS colpiscono 2 persone su ogni anno (95, 96). La probabilità che questi due eventi concomitino è stata calcolata nell ordine di 10 9, di gran lunga inferiore all incidenza della ARS-T (86). In conclusione se l ARS-T rappresenti un entità clinica distinta, una forma di progressione da ARS o una particolare forma di TE rimane a tutt oggi oggetto di dibattito scientifico. Il bagaglio diagnostico di questa rara entità è relativamente ricco e gode di informazioni che derivano prevalentemente dall analisi mutazionale di geni coinvolti sia in SMD che SMC. n LEUCEMIA LINFATICA CRONICA: CITOGENETICA, FISH O ENTRAMBI? La valutazione delle anomalie genetiche nella leucemia linfatica cronica (LLC) dà ragione dell eterogeneità clinica ed è fondamentale per l individuazione di sottogruppi prognostici nell indirizzo delle scelte terapeutiche. La citogenetica convenzionale a fatica, e solo con lo sviluppo di colture cellulari con stimolazione selettiva dei linfociti B, ha consentito di ottenere informazioni in circa il 40% dei casi. Più recentemente, le tecniche di coltura delle LLC hanno avuto un sensibile miglioramento in relazione all utilizzo dell interleuchina 2 e del CpG-oligonucleotide DSP30, in grado di indurre la progressione del ciclo cellulare delle cellule leucemiche di LLC in vitro. È possibile così ottenere metafasi analizzabili in oltre il 90% dei casi (97, 98). Nel più comune screening di FISH (revisione in bibliografia n.99) vengono esaminate la delezione 13q14, coinvolgente due microrna (MIRN15A e MIRN16-1) che svolgono un ruolo post-trascrizionale negativo su BCL-2; la delezione 11q22- q23, coinvolgente il gene ATM, a prognosi negativa e sviluppo di linfadenopatia; la delezione 17p13/TP53 che raggiunge il 30% dei casi resistenti a chemioterapia; la trisomia del cromosoma 12 presente in circa il 15-25% dei casi, con un indice prognostico intermedio. Questo screening, attualmente praticato in molti centri ematologici, è in grado di identificare anomalie genetiche in circa l 80% dei casi e si è rivelato molto utile nella stratificazione prognostica. Si tratta pertanto di un eccellente approccio di valutazione del paziente con LLC. La FISH inoltre, in quanto test mirato ad evidenziare lesioni specifiche e note, può essere integrata ad hoc. Un esempio molto importante è l indagine del riarrangiamento IgH/BCL1, peculiare dei linfomi mantellari (MCL) o di un sottogruppo di LLC a fenotipo atipico (100). Le due malattie in realtà possono avere molte caratteristiche comuni, sia dal punto di vista immunofenotipico che morfologico e clinico. Caratteristica comune è la positività per l antigene CD5, oltre che per il CD19 e il CD20. Le LLC sono tipicamente CD23+, FMC7- e mostrano una bassa espressione delle immunoglobuline di superficie (sig), mentre i MCL sono generalmente CD23-, FMC7+ e mostrano una moderata espressione di sig. Tuttavia, alcuni studi segnalano la presenza di casi di LLC CD23-/FMC7+/ alta espressione sig. Trovare, quindi, caratteristiche genetiche che possano orientare verso una diagnosi differenziale

16 Diagnostica citogenetica e molecolare 15 è senz altro un obiettivo da raggiungere ai fini prognostici e delle scelte terapeutiche (100). Cuneo et al. (101) hanno mostrato che circa il 21% dei casi di LLC atipiche (secondo la classificazione FAB), ma con caratteristiche cliniche sostanzialmente diverse dalla presentazione leucemica di linfomi MCL presentava un riarrangiamento IgH/BCL1, frequentemente associato a delezione del cromosoma 13. Vizcarra et al. (102) hanno descritto un sottogruppo di disordini linfoproliferativi B, con presentazione clinica indistinguibile da una LLC, positivo per IgH/BCL1 ed associato ad anomalie addizionali. Haferlach (98) ha confermato questo dato identificando alcuni casi (circa il 3%) di LLC con immunofenotipo tipico, t(11;14)(q13;q32) ed anomalie addizionali. Su 28 casi CD5+,con immunofenotipo tipico di MCL (alta espressione di CD20, CD23-, FMC7+ ed espressione di sig), l applicazione di un set di sonde FISH tipicamente utilizzate nella diagnosi di LLC e della sonda specifica per la t(11;14)(q13;q32), ha identificato il riarrangiamento IgH/BCL1, compatibile con la diagnosi di MCL, nel 57% dei casi (16/28) (100). Inoltre 11/16 casi presentavano anomalie aggiuntive (6 casi con delezione 13q14, 1 caso con +12, 3 casi del TP53, 2 casi del 11q22). Il 32% dei casi non ha mostrato positività per la t(11;14) mentre presentava anomalie citogenetiche comuni nella LLC. L insieme di questi dati ha mostrato un sottogruppo di disordini linfoproliferativi B, con immunofenotipo tipico del MCL, ma con caratteristiche genetiche peculiari della LLC sottolineando l impor tanza dell analisi molecolare IgH/BCL1 per la diagnosi differenziale tra MCL e LLC. Nel confronto tra il ruolo della citogenetica convenzionale e molecolare, il cariotipo, tecnica grossolana per l analisi dei geni, ma molto informativa sull assetto dell intero genoma cellulare, viene sempre considerato superiore per l acquisizione di nuove informazioni oltre alla possibilità di avere una diagnosi genetica in caso di negatività dei test standard di FISH (103). Ad esempio, in 500 LLC alla diagnosi, la citogenetica convenzionale ha consentito di individuare anomalie addizionali nel 34% di un sottogruppo di pazienti con delezione del 13q a prognosi favorevole (definita sulla base dei risultati di FISH), con importanti risvolti sul piano prognostico e terapeutico (98). Ancora un nuovo riarrangiamento cromosomico ricorrente alla CC è rappresentato da un dic(17;18)(p11.2-p11.2), associato a caratteristiche specifiche di malattia (bassa età alla diagnosi, rapida progressione, e maggiore resistenza al trattamento) simili ma più aggressive rispetto ai pazienti con perdita di TP53/del(17p) (104). Ancora, Haferlach et al. (105) hanno proposto un sistema di valutazione del rischio prognostico basato su una serie di parametri (età, conta dei globuli bianchi, stato mutazionale di IgVH, delezioni di ATM e di TP53, traslocazioni coinvolgenti il locus IgH/14q32) in cui anche la valutazione del numero di anomalie genetiche, valutate con la citogenetica convenzionale, ha un impatto prognostico rilevante, specialmente nelle fasi precoci di malattia. Su questa base è prevedibile che il massimo successo di informazione diagnostica e di conoscenza sarà in un futuro prossimo verosimilmente ricoperto in questa patologia, come in altre, dal cariotipo su microarrays che consente una genotipizzazione completa identificando non solo tutto ciò che è individuabile con la FISH, ma rivelando anche anomalie complesse e un fenomeno affatto particolare come la uniparental disomy (UPD) ignorato da altre tecniche (106). n DIAGNOSI E STRATIFICAZIONE PROGNOSTICA DEL MIELOMA MULTIPLO: SOLO FISH, SOLO CITOGENETICA CONVENZIONALE O ENTRAMBI? La sopravvivenza nel mieloma multiplo (MM) è notevolmente migliorata nell ultimo decennio grazie all uso di nuovi agenti per il trattamento. Nonostante questo il decorso della malattia rimane altamente variabile anche in conseguenza delle diverse anomalie genetiche sottostanti (Tabella 2). È fuori discussione che la I-FISH, in una patologia a basso indice mitotico, presenti un vantaggio tecnico molto importante. La FISH consente inoltre di individuare anomalie criptiche alla CC, come le traslocazioni atipiche associate alla regione 14q32, ed ha maggiore sensibilità in termini

17 16 Seminari di Ematologia Oncologica Eventi genetici primari Eventi genetici secondari Cariotipo non iperdiploide Monosomia 13/delezione 13q (ipodiploide, pseudodiploide) (RB1, D13S319, D13S25, 13q14) Cariotipo iperdiploide Delezione 17p (TP53, 17p13) (numerose trisomie, principalmente +3, +5, +7, +9, +11, +15, +19, +21) Delezione 1p (p18, 1p32.3) Traslocazioni IgH Delezione 12p (CD27, 12p13) t(11;14)(q13;q32) IGH/BCL1 t(4;14)(p16;q32) IGH/FGFR3-IGH/MMSET Delezione 6q (6q21) t(14;16)(q32;q23) IGH/C-maf t(6;14)(p21;q32) IGH/CCND3 Amplificazione 1q (traslocazioni sbilanciate, isocromosomi, t(14;20)(q32;q11) IGH/MAFB traslocazioni jumping, amplificazione CKS1B, 1q21) Traslocazioni C-myc TABELLA 2 - Principali anomalie citogenetiche e molecolari nel MM suddivise in eventi genetici primari e secondari, questi ultimi intesi come fattori di progressione della malattia. di popolazione minima identificabile affetta dall anomalia. Tuttavia la FISH prevede l utilizzo di sonde locus specifiche e quindi in qualche modo condiziona l analisi in regioni già note per essere coinvolte; mentre la CC consente uno studio genomico completo in ogni paziente, permettendo eventualmente di individuare anomalie più rare o assolutamente nuove. Studi di high density acgh hanno mostrato come virtualmente il 100% di pazienti con MM presenti anomalie cromosomiche (107, 108), in contrasto con i dati in letteratura relativi alla CC che individua il cariotipo anormale in meno del 30% dei pazienti. Questo è spiegato dal basso indice mitotico delle plasmacellule maligne nonché dalla bassa proporzione di plasmacellule totali nel preparato biologico per citogenetica. È da notare come casi precedentemente considerati citogeneticamente normali siano dovuti all analisi di metafasi di cellule mieloidi normali. La FISH risolve questo problema consentendo la ricerca di anomalie cromosomiche specifiche in pazienti affetti da MM su preparati arricchiti del tipo cellulare di interesse, nella fattispecie cellule CD 138+ (109). Diversi gruppi hanno affrontato la controversia FISH/CC risolvendola a favore della prima almeno in studi multicentrici, in termini di risparmio di tempo, e di capacità investigativa estesa alle anomalie criptiche (110). È interessante che, come recentemente mostrato in uno studio su 290 casi di MM (111), il contributo dei componenti di un modello per la stratificazione prognostica che include FISH, CC, e labelling index delle plasmacellule, veda un alto grado di correlazione con la prognosi per la FISH e la CC, ma non per il labelling index. Un ulteriore dato è che in pazienti stratificati come standard risk da uno dei due test, FISH o CC, il secondo può aggiungere ulteriori informazioni utili per la classificazione prognostica, evidenziando che le due tecniche possono essere utili quando impiegate in modo integrato in percorsi diagnostici personalizzati. La FISH risulta da preferire come primo approccio grazie alla maggiore rapidità di realizzazione, alla possibilità di applicazione su popolazioni plasmacellulari arricchite, e all alto grado di risoluzione/sensibilità in termini di danno genetico rilevato. L integrazione con la CC potrebbe essere riservata a casi di difficile inquadramento attraverso la sola FISH. n BIBLIOGRAFIA 1. Swerdlow SH, Campo E, Lee Harris N, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. 4 th Edition. International Agency for Research on Cancer. Lyon, 2008.

18 Diagnostica citogenetica e molecolare Schoch C, Kohlmann A, Schnittger S, et al. Acute myeloid leukemias with reciprocal rearrangements can be distinguished by specific gene expression profiles. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: Vey N, Mozziconacci NJ, Groulet-Martinec A, et al. Identification of new classes among acute myelogenous leukemias with normal karyotype using gene expression profiling. Oncogene. 2004; 23: Debernardi S, Lillington DM, Chaplin T, et al. Genome-wide analysis of acute myeloid leukemia with normal karyotype reveals a unique pattern of homeobox gene expression distinct from those with translocation-mediated fusion events. Gen Chrom Canc. 2003; 37: Verhaak RG, Goudswaard CS, van Putten W, et al. Mutations in nucleophosmin (NPM1) in acute myeloid leukemia (AML): association with other gene abnormalities and previously established gene expression signatures and their favorable prognostic significance. Blood. 2005; 106: Marasca R, Maffei R, Zucchini P, et al. 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