midollare, possano coesistere diversi sub-cloni, geneticamente differenti tra loro, in grado di dare origine alla malattia. [3] In base a questi
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- Donata Lanza
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1 Caratterizzazione dei differenti stadi maturativi del clone neoplastico di mieloma multiplo mediante un analisi multiparametrica di citofluorimetria a flusso. BACKGROUND Il Mieloma Multiplo (MM) è una malattia neoplastica caratterizzata dall accumulo dei linfociti B e dalla proliferazione incontrollata delle plasmacellule nel compartimento midollare e più raramente in tessuti extramidollari. La comparsa del Mieloma Multiplo è caratterizzata da un processo di evoluzione multistadio, con progressivo incremento dell eterogeneità biologica, clinica ed epidemiologica. Gli stadi che caratterizzano la progressione multistep del Mieloma Multiplo, anche se non tutti identificabili nei pazienti affetti, sono i seguenti: - stadio preclinico di malignità asintomatica (MGUS);. I cloni plasmacellulari nel MGUS costituiscono meno del 10% delle cellule del midollo osseo, sono quiescenti non completamente trasformati e non causano danni d organo; - stadio intermedio Smoldering (SMM) che rappresenta uno stadio clinico intermedio tra MGUS e Mieloma Conclamato; tale stadio si è caratterizzato da una percentuale di plasmacellule midollari che si avvicina al 10%, dall assenza di sintomi e di danni d organo; - stadio intermedio intramedullare o Mieloma Conclamato, caratterizzato da una percentuale di plasmacellule maggiore del 10%; le caratteristiche cliniche di questa fase sono anemia, ipercalcemia, osteoporosi, lesioni osteolitiche soprattutto a livello dello scheletro assiale, disfunzione renale, deposizione di Ig monoclonale e aumentato rischio d infezione; - stadio extramedullare ovvero lo stadio terminale della malattia noto come Leucemia Plasmacellulare (PCL, Plasma Cell Leukemia); questa fase è caratterizzata da un elevata proliferazione delle plasmacellule mielomatose che, in seguito all accumulo di mutazioni acquisiscono la capacità di localizzarsi e crescere in zone extra-midollari, e pertanto riscontrabili a livello della circolazione sanguigna, del liquido pleurico e a livello epidermico. L evoluzione clinica del MM è caratterizzata da un processo di evoluzione multistadio, con progressivo incremento dell eterogeneità biologica, clinica ed epidemiologica. Nella visione classica, il processo di patogenesi e progressione del MM prevede la graduale e lineare acquisizione, da parte di un clone di plasmacellule, di diverse alterazioni genetiche che ne alterano la biologia, e che possono conferire un vantaggio di sopravivenza rispetto alle cellule presenti nell ambiente circostante. Negli ultimi anni, grazie all introduzione di tecnologie progressivamente più sofisticate di sequenziamento massivo del genoma, questo modello di tumorigenesi lineare è stato messo più volte in discussione. [1,2] Infatti, dall analisi delle caratteristiche genetiche delle cellule coinvolte nelle diverse fasi della malattia (ad esempio diagnosi e recidiva), emerge che, nella maggior parte dei casi, il clone prevalente nella fase di recidiva è geneticamente differente rispetto al clone della diagnosi. Questo suggerisce che, all interno dello stesso microambiente
2 midollare, possano coesistere diversi sub-cloni, geneticamente differenti tra loro, in grado di dare origine alla malattia. [3] In base a questi nuovi elementi, è sempre più chiaro che dopo la comparsa della malattia, un susseguirsi di eventi genetici sia necessario per la progressione e che l evoluzione clonale non sia un processo che avviene in maniera lineare, ossia coinvolgente un unico clone di cellule neoplastiche, bensì ramificata, cioè coinvolgente più cloni caratterizzati da instabilità genetica. Negli ultimi anni, un ulteriore livello di eterogeneità è stato studiato nel mieloma: studi recenti suggeriscono che, all interno del microambiente midollare, coesistono diversi sub-cloni di plasmacellule in stadi differenti della loro maturazione, in grado di svolgere un ruolo predominante nel processo di propagazione tumorale; Questo aspetto suggerisce che alla diagnosi, il clone neoplastico sarebbe costituito da diverse sottopopolazioni di cellule, caratterizzate da con profili citogenetici, fenotipici e capacità clono-geniche diverse tra loro; [4] il clone tumorale di mieloma quindi non sarebbe caratterizzato solo da un eterogeneità intra-clonale nel compartimento completamente differenziato (plasmacellule CD138+), ma anche da un eterogeneità nel livello di maturazione. [5] Nel midollo di pazienti con mieloma pertanto, sarebbero identificabili quattro diverse sottopopolazioni, organizzate in maniera gerarchica l una, rispetto all altra: al vertice della gerarchia vi sarebbero (1) le cellule B, CD19+, seguite da (2) i plasmablasti, da (3) le plasmacellule immature (definite Pre-PC), CD19-, CD38+, CD319+ e CD138- e infine da (4) le plasmacellule mature, CD19- CD138+ Il clone neoplastico nel mieloma sarebbe quindi costituito sia da cellule esprimenti il marcatore tipico delle plasmacellule (il CD138) che da cellule che non esprimono il CD138. Il ruolo di quest ultima popolazione cellulare (CD138-) nella patogenesi della malattia non è del tutto chiaro: infatti, nonostante spesso sia stato suggerito che queste sottopopolazioni del lineage B rappresentino il compartimento delle "cellule staminali proliferanti del Mieloma Multiplo, questa rimane una questione dibattuta, poiché tali cellule ancora non sono state funzionalmente caratterizzate. Quindi entrambe le popolazioni plasmacellulari, sia le CD138+ sia le CD138-, mostrano un ruolo attivo nella propagazione del mieloma; queste cellule costituiscono due stati dinamici e interconvertibili della stessa popolazione clonale che mostra una differenziale risposta al trattamento. [6] Relativamente al concetto di eterogeneità maturativa del clone neoplastico, negli ultimi anni l attenzione è stata rivolta all espressione di due marcatori CD19 e CD81, e recentemente è stato, infatti, suggerito che la diversa espressione di questi due marcatori da parte del clone plasmacellulare permette l identificazione di almeno tre stadi di maturazione: uno stadio in cui le cellule mostrano un fenotipo più immaturo costituito dall espressione positiva di entrambi i marcatori, uno stadio intermedio in cui le cellule mostrano una mancata espressione del CD19 e un espressione positiva del CD81, e infine uno stadio maturo in cui le cellule si caratterizzano per l espressione negativa di entrambi i marcatori. La coesistenza di questi sub-cloni aventi stadi maturativi differenti sembra essere correlata alla prognosi di malattia,infatti i pazienti aventi plasmacellule con fenotipo più immaturo mostrano una prognosi peggiore di malattia a differenza dei pazienti aventi plasmacellule con fenotipo maturo i quali mostrano una prognosi migliore. [7]
3 SCOPO DEL PROGETTO Lo scopo di questo progetto è caratterizzare l eterogeneità maturativa del clone di mieloma, ovvero identificare l eventuale presenza di sottopopolazioni neoplastiche caratterizzate da stadi maturativi diversi, per valutarne il possibile impatto sulla prognosi di malattia. Per condurre questo studio verranno utilizzate metodiche di citofluorimetria multiparametrica. Il razionale di questo studio si basa sull ipotesi - supportata da dati recentemente pubblicati - che il clone di MM sia costituito da diverse sottopopolazioni, clonalmente correlate tra di loro, caratterizzate non solo da background genomici, ma anche da fenotipi diversi tra loro, che suggeriscono in ciascun paziente l esistenza di subcloni più o meno maturi all interno dello stesso clone. [7] PIANO SPERIMENTALE Questo progetto prevede la caratterizzazione di una coorte di 100 pazienti, il cui campione verrà raccolto alla diagnosi e possibilmente anche alla ricaduta; per ciascun paziente inserito nello studio, sarà identificata e caratterizzata immunofenotipicamente la popolazione plasma cellulare; i pazienti saranno stratificati in sottogruppi in base all espressione di specifici marcatori, in grado di identificare i differenti stadi maturativi; verranno infine eseguite delle correlazioni prognostiche per valutare l impatto clinico della stratificazione proposta dallo studio. Il piano sperimentale di questo progetto prevede: 1) Identificazione di un pannello di anticorpi adatto a descrivere il clone neoplastico!, con il supporto dei dati presenti in letteratura, è stato definito un pannello di 11 anticorpi (CD138, CD38, CD45, CD56, CD19, CD81, CD27, CD20, CD28, CD44, CD54) da utilizzare per caratterizzare la popolazione plasmacellulare ma soprattutto per studiare le differenti fasi maturative del clone neoplastico di mieloma. 2) Caratterizzazione della popolazione plasmacellulare! Per ciascun paziente con mieloma inserito nello studio, identificazione della popolazione plasmacellulare normale e/o neoplastica e caratterizzazione del profilo fenotipico 3) Stratificazione dei pazienti in sottogruppi! I pazienti con mieloma inseriti nello studio saranno stratificati in tre sottogruppi in base alla diversa espressione dei marcatori CD19 e CD81; successivamente questi tre gruppi saranno caratterizzati in base all espressione di seguenti marcatori: CD54, CD44, CD27, CD28, CD38 e CD56; 4) Correlazione dei sottogruppi in differenti stadi maturativi con le con le caratteristiche cliniche! l obiettivo di questo progetto è quello di correlare i dati ottenuti mediante l analisi citofluorimetrica con le caratteristiche cliniche dei pazienti;
4 RISULTATI ATTESI: MESE 1-6: Raccolta dei campioni in fasi diverse di malattia, individuazione della popolazione plasmacellulare e caratterizzazione immunofenotipica: popolazione plasmacellulare normale e/o neoplastica; caratterizzazione delle fasi maturative del clone neoplastico e individuazione dei vari sottogruppi. MESE6-12: Confronto dei differenti profili fenotipici dello stesso paziente, e successiva stratificazione dei pazienti nei vari sottogruppi identificati, studiare lo stadio maturativo delle plasmacellule soprattutto ai pazienti alla diagnosi, ma anche alla ricaduta permetterà di comprendere l andamento della malattia ed infine correlazione dei risultati ottenuti mediante analisi multiparametrica con le caratteristiche cliniche di ciascun paziente in modo tale da suggerire al clinico, l eventuale possibilità di un diverso intervento terapeutico, mirato sulle caratteristiche di ciascun paziente. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI 1. Egan JB, Shi C-X, Tembe W. et al Whole-genome sequencing of multiple myeloma from diagnosis to plasma cell leukemia reveals genomic initiating events, evolution, and clonal tides. Blood 2012; 120(5): Bolli N, Avet-Loiseau H, Wedge DC, Van Loo P, Alexandrov LB, Martincorena I, et al. Heterogeneity of genomic evolution and mutational profiles in multiple myeloma. Nat Comun. 2014;5: Brian A. Walker, Christopher P. Wardell, Lorenzo Melchor et al. Intraclonal heterogeneity and distinct molecular mechanisms characterize the development of t (4; 14) and t (11; 14) in Multiple Myeloma. Blood, August 2, 2012; 120 (5) : PainoT, Paiva B,Sayaguès JM, Mota I et al. Phenotypic identification of subclones in multiple myeloma with different chemoresistant, cytogenetic and clonogenic potential. Leukimia 2015 May;29(5): Chaidos A, Barnes CP, Cowan G, May PC, Melo V, Hatjiharissi E, et al. Clinical drug resistance linked to interconvertible phenotypic and functional states of tumor- propagating cells in multiple myeloma. Blood. 2013;121(2): Paiva, N Puig, M-T Cedena, B G de Jong, Y Ruiz, et al. Differentiation stage of myeloma plasma cells: biological and clinical significance. Leukemia 2016;September.
5 7. Rawstron AC, Orfao A, Beksac M, et al. Report of the European Myeloma Network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders. Haematologica 2008; 93(3):
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