Le nuove opportunità e limitazioni nel settore dei derivati della carne suina e avicola

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1 Le nuove opportunità e limitazioni nel settore dei derivati della carne suina e avicola Problematiche di export legate alla presenza di batteri patogeni in prodotti a base di carne: effetti della tecnologia e nuove soluzioni analitiche Enrico Novelli e Angiolella Lombardi Dip. di Biomedicina Comparata e Alimentazione, Università degli Studi di Padova Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari-Veneto Agricoltura, Thiene (VI) Cremona,

2 Esempi di RTE come identificati da standard FSIS Il processo produttivo di ciascun RTE deve garantire la riduzione dei patogeni fino a livelli specifici oltreché impedire la crescita di patogeni target oltre i livelli prefissati

3 Lo stabilimento che produce RTE (per i quali non sono necessarie indicazioni relative le modalità di preparazione in etichetta) deve ottemperare quanto previsto al 9 CFR 317.2(I) e (b) Per ogni categoria di RTE, FSIS suggerisce un lethality performance standard Es., prodotti cotti, batterio target Salmonella Riduzione di 6,5 log.. cooked beef, roast beef, cooked corned beef Riduzione 5 log uncured meat patties Riduzione 7 log. cooked poultry

4 Altro concetto aggregato al trattamento letale è lo stabilization process FSIS - Nello specifico, lo stabilimento deve adottare una procedura efficace per impedire la moltiplicazione di C. botulinum e C. perfringes

5 La normativa USA ritiene Listeria monocytogenes grave un pericolo Per i prodotti a base di carne, tolleranza uguale a zero (a prescindere dal fatto che questi supportino o meno la crescita del batterio) Si applica ai prodotti RTE Per la legislazione USA un alimento nel cui processo di produzione non intervenga un trattamento listericida è da considerarsi non RTE (indicazioni modalità di preparazione in etichetta)

6 Listeria e ambiente Ampia diffusione (comportamento simil saprofita) Suolo Acqua Letame e liquami Vegetazione Razione per animali (insilato con fermentazioni anomale) Listeria monocytogenes isolata da 42 specie di mammiferi fra domestici e selvatici 17 specie di volatili fra domestici e selvatici oltre che da vertebrati e invertebrati marini e insetti L. monocytogenes è presente nell intestino dell uomo (1-5% della popolazione) che ne funge da portatore

7 Gli animali domestici possono essere portatori asintomatici e contaminare le carni laddove il materiale fecale entri in contatto con la carcassa

8 Limiti di crescita per Listeria monocytogenes (ICMFS 1996) Minimo Ottimale Massimo Temperatura -0,4 C 37 C 45 C Attività dell acqua 0,92 ph 4,39 7,0 9,4 Sale 10%

9 L. monocytogenes colonizza gli ambienti di lavorazione, si moltiplica soprattutto in particolari siti (harborage) ove le condizioni di umidità sono favorevoli (anche se freddo) Attenzione ad attrezzature e macchine nei loro dettagli meno accessibili alle operazioni di sanificazione Forma biofilm su superfici a contatto e non

10 L. monocytogenes e malattia alimentare Fasce di popolazione a rischio (YOPI) Gli alimenti sono il principale veicolo Trasmissione transplacentare Forma clinica non sistemica Forma clinica sistemica Per il 2010, anno con i dati più completi, sono stati stimati casi di Listeria monocytogenes in tutto il mondo, dei quali si sono rivelati fatali. Di questi casi, quasi il 21 per cento ha colpito le donne in gravidanza e neonati.

11 L. monocytogenes viene facilmente devitalizzata mediante cottura o pastorizzazione Il rischio riguarda soprattutto i cosiddetti RTE food che possono essere contaminati dal germe durante una o più procedure tecniche che hanno luogo dopo il trattamento letale

12 Diminuzione del rischio 9 CFR Gestione del pericolo Lm nei prodotti RTE, esposti in ambiente post letale Gli stabilimenti che producono RTE che sono esposti dopo il trattamento letale ad una potenziale contaminazione da Lm devono prevedere nelle proprie procedure HACCP o SSOP, misure di controllo atte a impedire l adulterazione del prodotto con Lm Alternative d intervento disponibili Alternativa 1 Trattamento post-letale e agente/processo antimicrobico Alternativa 2 Trattamento post-letale o agente/processo antimicrobico Alternativa 3 Utilizzo di misure di sanificazione Non deli o hot dog Deli o hot dog

13 Contaminazione di ambienti/attrezzature di lavorazione Alcuni ceppi possono radicarsi negli ambienti di lavorazione e li permanere anche per anni. Periodicamente Lm può migrare da questi loci e contaminare il prodotto in lavorazione o le superfici a contatto (rischio se ciò avviene fra la fase letale e il confezionamento) L utilizzo della PFGE (pulsed-fiel gel electrophoresis) per la tipizzazione batterica, fornisce indicazioni circa la presenza di una nicchia, evidenziata dall osservazione dello stesso profilo ricorrente nel tempo Obbligo d invio dei ceppi di Listeria monocytogenes isolati da campioni di prodotti e superfici anche se prelevati in autocontrollo, all IZS competente per territorio per la determinazione del profilo genetico mediante PFGE.

14 Alternativa 3 prodotti Deli: un caso Multinazionale canadese del settore alimentare (fondata più di 100 anni fa) 58 impianti produttivi fra Canada, Stati Uniti, Messico e Regno Unito dipendenti Fatturato nel 2008: 5,2 miliardi di dollari Presidente e Dirigente esecutivo: Michael H. McCain Qual è stato il problema dell azienda? Presenza in alimenti RTE di Listeria monocytogenes (nell impianto di Bartor Road) Gli eventi si sono susseguiti tra LUGLIO-AGOSTO mesi DICEMBRE 2008 morte 23 persone e numerosi malati Ritirati e distrutti ca. 200 lotti (pari a 84 tir) La class action contro l azienda fissa in 27 milioni di $ il totale dei risarcimenti alle vittime Costo totale per l azienda: 43 milioni di $ (esclusa la class action)

15 BACTERIAL BARCODING GENE 16S Identificazione di genere/ specie Multi Locus Sequence Typing Identificazione di specie/ceppo

16 DNA cromosomale Multilocus Sequence Typing (MLST) Amplificazione di frammenti di sette geni house-keeping 500 bp Sequenza dei frammenti dei sette geni Ogni differente sequenza in un locus corrisponde ad un diverso allele identificato da un numero Il profilo allelico di un isolato è dato dalla combinazione dei numeri degli alleli di ognuno dei sette loci Confronto del profilo allelico dell isolato a quelli di tutti gli isolati registrati in un database condiviso via internet ( (Cardazzo, 2013)

17 Strain 1 Strain 2 Strain 3 Strain 4 Strain 5 Strain 6 Strain 7 Strain 8 Strain 9 Strain 10 Strain 11 Strain La sequenza dei sette numeri è come un codice a barre per il ceppo Viene definito ST, SEQUENCE TYPE Dendrogramma basato sulle differenze tra i profili allelici Linkage Distance Clonal complex Clone 0.0 Strain 8 Strain 4 Strain 12 Strain 10 Strain 5 Strain 2 Strain 9 Strain 7 Strain 3 Strain 11 Strain 1 Strain 6 (Cardazzo, 2013)

18 Multilocus sequence typing (MLST) campionamento 67 ceppi da matrici alimentari o da superfici dell industria alimentare estrazione DNA amplificazione abcz (ABC transporter) bgla (beta glucosidase) cat (catalase) dape (succinyl diaminopimelate desuccinylase) dat (D-amino acid aminotransferase) ldh (L-lactate dehydrogenase) lhka (histidine kinase) sequenziamento confronto con database Assegnazione allelica Sequence type (ST) (Cardazzo, 2013)

19 (Cardazzo, 2013) Sequence type (640 al 09/2013) Confronto con database isolati (2606 al 09/2013)

20 Lineage II (48 campioni) (1/2 a, 1/2 c ) Attribuzione ST Attribuzione Lineage e sierotipo RELAZIONI CLONALI Distribuzione campioni: LINEAGE I e II Lineage I (12 campioni) (4b, 1/2b) (Cardazzo, 2013)

21 (Cardazzo, 2013) Risultati ST (19) Isolati Lm (62) Lineage Serotipo 2 1 I 4b 4 5 I 1/2b 5 1 I 4b 6 4 I 4b 9 7 II 1/2c 14 1 II 1/2a 18 3 II 1/2a 26 1 II 1/2a 37 3 II 1/2a II 1/2a II 1/2a II 2a I 1/2b II 2a I? 4b? II 1/2a II 1/2c new 1 II? 1/2a?

22 (Cardazzo, 2013) MLST: Tracciabilità dei ceppi Verificare se un ceppo isolato nel prodotto finito deriva dalla materia prima o da una contaminazione durante la produzione Ceppo già isolato in azienda

23 (Cardazzo, 2013) OGGI (2014) Quanto costa la genomica? Sequenziare un genoma batterico/comunità da alimento: 200 euro (Illumina Hiseq 2500/Miseq) 2011 Sequenziare un genoma batterico/comunità da alimento: 5000 euro (Roche 454 GS-FLX)

24 log ufc/g Alternativa 2b) prevede l utilizzo di un AMA o AMP per controllare la crescita di Lm nel corso del periodo di conservabilità del prodotto. AMA o AMP vanno indicati nel proprio piano HACCP oppure SSOP. Tale AMA o AMP devono dimostrare che non si ottiene una crescita maggiore di 2 logaritmi di Lm nel corso del periodo di conservabilità del prodotto Challenge per verifica potenziale di crescita di L. monocytogenes (Lm) in prosciutto cotto inoculato con un ceppo di Carnobacterium maltaromaticum produttore di batteriocina (doc. AFSSA) A Lm ufc/g LMG 13305, 596, 237 B Lm ufc/g LMG 13305, 596, 237 C. maltaromaticum 5x10 5 ufc/g ATM (60% CO 2, 40% N 2 ) incubate a 6.5 C x 30g 4 3,5 3 2,5 2 Listeria monocytogenes Vaschetta A L. monocytogenes cresce di circa 2.5 log ufc/g Vaschetta B L. monocytogenes ridotta di circa 1 log ufc/g 1,5 1 0, g listeria listeria+carnobacterium (Lombardi, 2013)

25 L. monocytogenes e risposta allo stress ambientale Adattamento al freddo (stress termico) Listeria monocytogenes reagisce allo stress termico (freddo) attraverso l accumulo di sostanze ad azione crioprotettiva

26 L. monocytogenes e risposta allo stress ambientale Adattamento all ambiente acido L ambiente a media acidità (5,0 5,5) è sub-letale e stimola il batterio alla sintesi di proteine ad azione protettiva ma soprattutto adattativa Contemporaneamente a questa risposta aumenta anche la resistenza verso lo shock termico (52 C) e la forza osmotica (25-30% di sale) L. monocytogenes si trova invece a proprio agio a ph superiori a 6

27 L. monocytogenes e risposta allo stress ambientale Adattamento alla forza osmotica (osmoadattamento) La salagione stimola il batterio ad accumulare sostanze osmoprotettive prendendole direttamente dal substrato bilanciando così la nuova pressione osmotica del mezzo.

28 L. monocytogenes e risposta allo stress ambientale Adattamento verso i presidi di sanificazione L errato utilizzo dei mezzi di sanificazione delle superfici e delle attrezzature (effetto sub-letale) stimola la resistenza del batterio verso i composti quaternari dell ammonio

29 Caratteristiche degli insaccati stagionati Si utilizzano colture d avviamento (acidificano l impasto in fase di asciugatura) Nonché additivi ad azione conservante e antiossidante oltre a mono- e disaccaridi

30 Processo di stagionatura - ph impasto giorni Fermentazione e stagionatura sono processi che controllano la crescita di Lm e di altri microrganismi diminuendo il ph e l umidità nel prodotto. Questi processi sono considerati AMP se risulta che nel prodotto finito a w e ph sopprimono o limitano la crescita di Lm. Le colture starter usate nei salami sono considerate AMA se nel prodotto finito si raggiunge un ph <4.6 e lo stabilimento documenta che questo livello di ph nel prodotto specifico sopprime o limita la crescita di Lm (effetto sinergico con a w ) Processo di stagionatura - attività dell'acqua impasto giorni Nella produzione degli insaccati da stagionare lo stress acido viene prima di quello osmotico

31 Come interagiscono gli ostacoli dispiegati nella produzione di insaccati da stagionare Effetto combinato acidificazione e nitrito di sodio Impasto 20% grasso, 2,5% sale, 20 C Inoculo di L. monocytogenes 10 4 UFC/g 0 ppm NaNO mm acido lattico L. monocytogenes rimane costante 75 ppm NaNO mm acido lattico L. monocytogenes diminuisce 150 ppm NaNO mm acido lattico L. monocytogenes diminuisce Karina e coll. (2011)

32 Alternativa 2b) prevede l utilizzo di un AMA o AMP per controllare la crescita di Lm nel corso del periodo di conservabilità del prodotto. AMA o AMP vanno indicati nel proprio piano HACCP oppure SSOP. Tale AMA o AMP devono dimostrare che non si ottiene una crescita maggiore di 2 logaritmi di Lm nel corso del periodo di conservabilità del prodotto Impasto 70:30 magro:grasso Sale 2,5% Pepe L. curvatus e S. xylosus Challenge test per Lm in salame stagionato L 100 ufc/g Lm LMG ceppi di campo LN 100 ufc/g Lm LMG ceppi di campo E252+E ppm LF 100 ufc/g Lm LMG ceppi di campo Estratto puro fenoli 750 ppm L giorni vs misure aw 0,952 0,956 0,946 0,935 0,932 0,891 ph 5,02 5,12 5,31 5,62 5,65 5,73 LN aw 0,954 0,956 0,946 0,938 0,931 0,913 ph 5,00 5,19 5,38 5,56 5,69 5,74 Per validare uno specifico AMA, questi deve permettere una crescita inferiore ai 2 logaritmi di Lm nel corso del periodo di conservabilità del prodotto (Novelli, 2013)) LF aw 0,954 0,948 0,934 0,917 0,904 0,891 ph 5,03 5,05 5,17 5,20 5,23 5,27 t C

33 Temperatura C Log (CFU/g) log ufc/g Temperatura C Log (CFU/g) Temperatura C Log (CFU/g) Tesi L Profilo_termico Tesi LF Profilo_termico aw0.89/ph5.0 MIN aw0.89/ph5.03 MIN Ore aw0.93/ph5.4 MED aw0.95/ph5.7 MAX Dati Sperimentali L Ore aw0.924/ph5.15 MED aw0.954/ph5.2 MAX Dati Sperimentali LF L LN LF Tesi LN Profilo_termico 4,0 3, aw0.913/ph5.03 MIN 3, Ore aw0.939/ph5.4 MED aw0.95/ph5.7 MAX Dati Sperimentali LN 2,5 2,0 1,5 1, Giorni (Novelli, 2013))

34 Risultati screening per la presenza della regione SSI-1 Isola di resistenza agli stress Quest isola genica comprenda 5 geni denominati lmo0444, lmo0445, lmo0446, lmo0447, lmo ceppi di Listeria spp. isolati da matrici varie 19 ceppi di Listeria spp. isolati da salsicce fresche e insaccati stagionati di varia origine (suino, cinghiale, cervo, capriolo) Ceppi con doppio amplificato Ceppi con amplificato di 2,2 kb Ceppi dotati di SSI-1 Ceppi non dotati di SSI-1 5% 15% 17% 63% Ceppi dotati di SSI-1 35% Ceppi non dotati di SSI-1 65% Cappelletti, 2014)

35 Valutazione di concentrazioni sub-mic dell estratto fenolico Per ciascun ceppo, sono state testate 3 differenti concentrazioni di estratto fenolico equivalenti a ½ MIC, ⅓ MIC e ¼ MIC Concentrazione ottimale per studi di espressione genica: ⅓ MICV Cappelletti, 2014)

36 Analisi dell espressione genica del ceppo L 70 di L. monocytogenes trattato con estratto fenolico Estrazione RNA Retrotrascrizione Analisi espressione genica mediante saggi qrt-pcr Gene Funzione Significatività agra Quorum sensing p<0.05 agrb Quorum sensing p< cyoa Produzione energia p< degu Produzione biofilm p< dnak Produzione biofilm Ns flaa Sintesi flagello Ns flig Sintesi flagello Ns inla Internalina A p< mogr Motilità Ns prfa Attivazione fattori di virulenza Ns soda Formazione ROS p< trg Chemiorecezione p< uvra Riparazione danno nucleotidi Ns yqhd Risposta stress tipo ossidativo p< Cappelletti, 2014)

37 Trattamento ad alta pressione (HPP) Trattamento impiegato come: - parte integrate del processo produttivo come trattamento letale per i patogeni considerati - come trattamento post letale (- 1 log per Lm) - 9 CFR 430 Applicabile a prodotti cotti e stagionati ma anche alimenti liquidi Batteri Gram positivi più resistenti dei Gram negativi Allungamento shelf-life > 120 g

38 Trattamento ad alta pressione (HPP) È un processo a freddo Pressione fino a 6000 bar applicata in tutte le direzioni Tempo di applicazione 3 minuti Ogni ciclo dura circa 7.5 minuti Applicabile anche a prodotti in confezione ATM Lo stabilimento da cui origina il prodotto deve includere il trattamento con HPP nel proprio diagramma di flusso, nell analisi dei pericoli e nel piano HACCP