UK NEQAS nel processo di preparazione di cellule staminali CD34+ geneticamente modificate per autotrapianto

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Giustino Ippolito
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1 UK NEQAS nel processo di preparazione di cellule staminali CD34+ geneticamente modificate per autotrapianto 7 UK NEQAS USERS MEETING Milano, 13 Novembre 2014 Margherita Neri Development Supervisor

Cos è MolMed Società di biotecnologie mediche quotata in Borsa focalizzata su ricerca, sviluppo

di prodotti terapeutici avanzati (terapia genica e cellulare) Manipolazione ex-vivo

virali e banche cellulari Azienda farmaceutica (produzione e rilascio di prodotti medicinali

2 Cos è MolMed Società di biotecnologie mediche quotata in Borsa focalizzata su ricerca, sviluppo e validazione clinica di terapie innovative GMP facility autorizzata da AIFA per la produzione di prodotti terapeutici avanzati (terapia genica e cellulare) Manipolazione ex-vivo paziente-specifica di cellule staminali ematopioietiche e di linfociti Produzione di vettori virali e banche cellulari Azienda farmaceutica (produzione e rilascio di prodotti medicinali clinical grade) Controllo Qualità Assicurazione Qualità Qualified Person Sviluppo processi e metodi analitici 2

Cos è MolMed 125 dipendenti 2/3 dello staff con formazione

Stanze Grado B per Gene Therapy: selezione cellulare, trasduzione e

colture cellulari e selezione cellule staminali 2 Stanze Grado C:

3 Cos è MolMed 125 dipendenti 2/3 dello staff con formazione scientifica Struttura di 1500 m 2 : GMP Manufacturing area: 3 Stanze Grado B per Gene Therapy: selezione cellulare, trasduzione e filling asettico del vettore 2 Stanze Grado B per Cell Therapy: colture cellulari e selezione cellule staminali 2 Stanze Grado C: produzione vettori virali Laboratori per il Controllo Qualità e lo Sviluppo Magazzino 3

4 Prodotti MolMed Proteine ricombinanti Terapia genica NGR-hTNF TK Malattie genetiche rare Tumour vascular targeting Prodotto pazientespecifico per leucemie ad alto rischio Terapie geniche e cellulari pazientespecifiche Academic partners Industrial partners 4

5 Struttura operativa Raw materials Processo produttivo Prodotto finito Rilascio In Process Controls IPC Rilascio 5

6 Controllo Qualità: Metodi Analitici 108 differenti metodi analitici svolti in MolMed: Test cellulari/virologici Test molecolari Test microbiologici Test biochimici Test di citofluorimetria I metodi analitici servono per controllare i prodotti in termini di: Funzionalità Identità Sicurezza Impurezze 6

7 Documenti di riferimento European Pharmacopoeia (e USP) ICH guidelines (International Conference of Harmonization): armonizzazione dell industria farmaceutica tra Europa, Giappone, USA Eudralex: Volume 4: GMP Guidelines for good manufacturing practices for medicinal products for human and veterinary use Annex 2 Manufacture of Biological active substances and Medicinal Products for Human Use Annex 13 Manufacture of Investigational Medicinal Products REGULATION (EC) No 1394/2007: ATMPs Certificazione di AIFA 7

8 Terapia genica Malattie monogenetiche Ex-vivo Vettori retrovirali e lentivirali: In grado di trasferire il gene corretto Integranti nel DNA ospite Difettivi per la replicazione 8

Terapia genica su CD34 ADA-SCID: fine fase II Immunodeficienza combinata grave caratterizzata da linfopenia (1:500000) Carenza dell enzima Adenosina Deaminasi Terapia genica con RV-ADA

9 Terapia genica su CD34 ADA-SCID: fine fase II Immunodeficienza combinata grave caratterizzata da linfopenia (1:500000) Carenza dell enzima Adenosina Deaminasi Terapia genica con RV-ADA Wiscott-Aldrich syndrome (WAS): fine fase II Immunodeficienza primaria caratterizzata da microtrombocitopenia (1:100000) Causata dalla carenza dell enzima WASP Terapia genica con LV-WAS Leucodistrofia metacromatica (MLD): fine fase II Malattia da accumulo lisosomiale con coinvolgimento delle cellule mielinizzanti nel SNC e nel SNP (1:40000) Carenza dell enzima Arilsulfatasi A (ARSA) Terapia genica con LV-ARSA 9

10 Processo di trasduzione CD34 con vettori virali Midollo osseo o sangue mobilizzato Selezione CD34 CD34 pure CONDIZIONAMENTO DAY 0 DAY 3/4 QC testing Trasduzione con vettore virale QC testing CD34 trasdotte formulate CD34 trasdotte 10

11 Controllo Qualità su CD34 trasdotte con LVV Test Specifiche Sicurezza Endotossina 2.5 EU/ml Sterilità (EP ) Negativo Mycoplasma (PCR) Negativo RCL Negativo Identità/Funzionalità Immunofenotipo For Information Only Vitalità cellulare 80% Test Clonogenico For Information Only Efficienza di trasduzione For Information Only Numero di copie di vettore For Information Only Espressione del transgene/funzionalità Presenza Impurezze E1A DNA LLOQ Large T Ag DNA LLOQ 11

Controllo Qualità: Immunofenotipo Midollo osseo o sangue mobilizzato Conta assoluta CD34 Composizione cellulare del campione resa del processo di selezione CD34 pure CD34 trasdotte Conta

12 Controllo Qualità: Immunofenotipo Midollo osseo o sangue mobilizzato Conta assoluta CD34 Composizione cellulare del campione resa del processo di selezione CD34 pure CD34 trasdotte Conta assoluta CD34 CD34 purezza e identità Caratterizzazione impurezze (CD34-) CD34 purezza e identità Caratterizzazione impurezze (CD34-) Impatto del processo sullo stato di differenziamento delle CD34 12

Immunofenotipo: metodo analitico Popolazione CD15 FITC CD34 PE 7AAD CD19 PE-Cy7 CD16+CD56 APC CD45 APC-H7 CD3 V450 Flowcount Marcatori Unico tubo Analisi in duplicato Conta assoluta FMO control per

13 Immunofenotipo: metodo analitico Popolazione CD15 FITC CD34 PE 7AAD CD19 PE-Cy7 CD16+CD56 APC CD45 APC-H7 CD3 V450 Flowcount Marcatori Unico tubo Analisi in duplicato Conta assoluta FMO control per CD34 Incubazione a temperatura ambiente Lisi rossi con ammonio cloruro Lyse/no wash Esclusione morte con 7-AAD Cellule staminali Linfociti B Linfociti T Natural Killer Granulociti e monociti Progenitori linfoidi Progenitori mieloidi CD45+/CD34+/lowFSC (Ishage) CD45+/CD19+/CD34-/lowFSC CD45+/CD3+/CD34-/lowFSC CD45+/CD3-/CD16+/CD56+/lowFSC CD45+/CD15+ CD45+/CD34+/CD19+ CD45+/CD34+/CD15+ 13

14 Immunofenotipo: gating 14

15 CD34 - percentuale Pre-Manipolazione Post-Selezione Fine processo 15

16 CD34 - fenotipo Pre-Manipolazione Post -Selezione Fine processo 16

17 Composizione media campioni 17

18 UK-NEQAS for Leucocyte immunophenotyping European Pharmacopoeia : «To ensure reliability in the data obtained or to check inter-laboratory reproducibility, partecipation in a proficiency testing study is strongly recommended» CD34 Stem Cell Programme Immune Monitoring Programme Popolazione Cellule staminali Linfociti B Linfociti T Natural Killer Granulociti e monociti Progenitori linfoidi Marcatori CD45+/CD34+/lowFSC (Ishage) CD45+/CD19+/CD34-/lowFSC CD45+/CD3+/CD34-/lowFSC CD45+/CD3-/CD16+/CD56+/lowFSC CD45+/CD15+ CD45+/CD34+/CD19+ Progenitori mieloidi CD45+/CD34+/CD15+ 18

19 Performances iniziali CD34 stem cells 19

20 Implementazioni Controllo del ph della soluzione lisante a base di NH 4 Cl compreso tra 7.2 e 7.4 Pipettata inversa Sessioni di pipettatura su bilancia analitica per affinare «l arte della pipettatta» Introduzione di 0,1% BSA nel buffer di marcatura Acquisizione di almeno 2000 eventi Flowcount e/o almeno 1000 eventi CD34+ 20

21 Performances successive 21

22 Gestione interna Tutti gli operatori eseguono l esercizio su tutti gli strumenti Valutazione retrospettiva della performance Operatore #1, Strumento #1 Operatore #1, Strumento #2 3,00 3,00 2,00 2,00 z-value 1,00 0,00-1,00-2,00 CD34 ABS CD34 % z-value 1,00 0,00-1,00-2,00 CD34 ABS CD34 % -3,00-3,00 Operatore #2, Strumento #1 Operatore #2, Strumento #2 3,00 3,00 2,00 2,00 z-value 1,00 0,00-1,00-2,00 CD34 ABS CD34 % z-value 1,00 0,00-1,00-2,00 CD34 ABS CD34 % -3,00-3,00 22

23 Conclusioni L adesione ai controlli interlaboratorio UK-NEQAS permette di: Monitorare l operato degli analisti Monitorare la performance della strumentazione Monitorare la qualità dei reagenti Verificare la strategia di gating Inoltre viene sfruttata per: Svolgere l addestramento degli operatori Validare il metodo analitico Certificare il metodo analitico di fronte agli organi competenti 23

24 Margherita Neri Bruno Brando Molmed Fractal Laura Garavaglia Giuliana Vallanti Alessio Palini 24

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