Applicazioni cliniche in Microbiologia. Diamante Paola Microbiologia e Virologia - Pordenone

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1 Applicazioni cliniche in Microbiologia Diamante Paola Microbiologia e Virologia - Pordenone

2 SFIDA Ridurre il tempo analitico rispetto alle procedure standard, in modo da ottenere sostanziali benefici per la gestione delle malattie infettive. Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.

3 In questo modo i risultati di microbiologia diventano sempre più utili in termini clinici. Camporese A. Inf Med 2004;12:

4 Raggiungere l obbiettivo l è possibile, mediante nuove tecnologie, automazione e test rapidi in grado di migliorare il flusso di lavoro provvedendo nello stesso tempo a mantenere l alta qualità dei risultati. Camporese A. Inf Med 2004;12:

5 La rapidità delle tecniche Molecolari combinate con l automazione l e con un più facile utilizzo dei software, ha permesso anche nella pratica microbiologica,una significativa diffusione di strumentazione ad esse dedicate. Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology. Tang, Yi-Wei; Stratton, Charles W. (Eds), 2006.

6 Infectious diseases diagnosis and empirical approach Physicians embraced an empirical approach to the management of many infectious diseases, favouring overuse of antibiotics. Bissonnette L and Bergeron MG. CMI 2010.

7 Ancor oggi i tempi necessari per giungere alla identificazione del patogeno e al rilevamento delle relative resistenze, implicano una terapia antibiotica empirica ad ampio spettro basata sull epidemiologia del reparto e sui fattori di rischio del paziente.

8 Questo comporta un aumentato rischio di effetti collaterali avversi,, favorisce l insorgenza di resistenza ai farmaci antibatterici, induce un generale incremento della mortalità ed aumenta i costi di gestione dei pazienti.

9 Obbiettivi di una diagnosi eziologica Evitare un trattamento antibiotico empirico. Permettere un utilizzo più ristretto dello spettro di antibiotici disponibili o un uso più appropriato di farmaci antivirali. Provvedere ad una più accurata informazione epidemiologica per provvedere a formulare raccomandazioni e terapie appropriate. Diminuire i tempi di ospedalizzazione e ridurre i costi di gestione. Ieven, M. J Clin Virol. 2007

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11 L approccio diagnostico basato sui test Molecolari costituisce il principale strumento che può alleviare dal bisogno di colture e consentire l dentificazione di uno o più patogeni da uno spettro di microorganismi associati ad una sindrome infettiva. Bissonnette L and Bergeron MG. CMI 2010.

12 In casi di sindromi cliniche particolari come la sepsi,, possono aiutare a individuare velocemente una situazione in cui la terapia antibatterica è rilevante. Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.

13 Nelle infezioni virali delle basse vie respiratorie, può limitare la prescrizione di terapie antibatteriche e la necessità di test addizionali. Clerc O and Greub G. Clin Microbiol Infect 2010.

14 Entrance into the diagnostic cycle (0 6 hours): patient arrival, triage, primary evaluation, questionnaire and physical examination by physician, presumptive diagnosis, physician laboratory analysis request(s), clinical sampling,, transfer to laboratories,, etc. Conventional diagnostics Molecular diagnostics in Microbiology and Virology Approximately 1 h 1 h 12 h or more 24 h or more Microbiology Laboratory Antigen tests and/or screening methods Positive culture results Identification and drug susceptibility Approximately 1 h 12 h or more Serological confirmation Microbiology Laboratory Rapid, multiparametric tests Conventional Molecular test Results of analyses and healthcare decision process transmission of results, interpretation,, patient management, therapeutic intervention, confirmatory testing,, treatment adjustment,, etc. process (hours to days): Immediate healthcare decision hours to days Bissonnette L and Bergeron MG. CMI Modified.

15 Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate al S.Maria degli Angeli di Pordenone Laboratorio di Microbiologia-Virologia SEPSI Leptospira Antrace

16 Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate al S.Maria degli Angeli di Pordenone Laboratorio di Microbiologia-Virologia MRSA VIRUS H1-N1 BK MDR

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18 Sepsi: una complessa cascata di eventi INFEZIONE MEDIATORI ANTIINFIAMMATORI MEDIATORI PROINFIAMMATORI AUMENTO PAI-1 INFIAMMAZIONE DANNO ENDOTELIALE ESPRESSIONE FATTORE TISSUTALE ATTIVAZIONE DELLA COAGULAZIONE GENERAZIONE DI TROMBINA ATTIVAZIONE TAFI SOPPRESSIONE FIBRINOLISI CONSUMO DI PROTEINA C CARENZA DI PROTEINA C COAGULOPATIA OCCLUSIONE MICROVASCOLARE IPOPERFUSIONE/ISCHEMIA DISFUNZIONE D ORGANO/SHOCK MORTE

19 Scatenata dalla presenza di un processo infettivo grave e consistente es. polmone, addome, vie urinarie dovuta all interazione tra l agente infettivo e l ospite, che porta ad una risposta infiammatoria sistemica e abnorme, con alterazioni emodinamiche, respiratorie, metaboliche e immunologiche. L invasione microbica del circolo ematico non è indispensabile dal momento che la diffusione sistemica dei prodotti microbici è sufficiente a innescare tale reazione (LPS, peptidoglicano, esotossine)

20 E una sindrome complessa che è difficile definire, diagnosticare e trattare. Alcuni dei sintomi della sepsi come la febbre o la tachicardia o la dispnea sono generici e si possono riscontrare in una serie di altre situazioni. Ciò crea un ritardo nella formulazione della diagnosi o addirittura la formulazione di una diagnosi errata.

21 L efficacia complessiva delle emocolture è bassa ed il risultato può essere falsato da molteplici fattori: quantità di sangue prelevata Momento e frequenza di campionamento. Modalità e sede di prelievo dei campioni. Presenza di antibiotici nel flacone per terapia antibiotica in atto Germi difficili o germi con esigenze colturali diverse. Fenomeni di autolisi (es pneumococco). Sviluppo e crescita estremamente lenti. Localizzazione endocellulare non si può mettere in evidenza con i normali sistemi

22 Emocolture Una grande limitazione delle emocolture è di avere i risultati disponibili non prima di 2 giorni. Questo comporta l utilizzo l di una terapia antibiotica empirica. Paolucci M, Landini MP, Sambri V. International Journal of Antimicrobial Agents. 2010

23 Turnaround time medio emocolture 2010: Media italiana: >90% entro 72 ore 80% entro 96 ore Goglio A, Nicoletti P. Microbiol Med 2004; 19: 1-13

24 Sepsi Nella diagnostica della sepsi la variabile tempo è un valore di assoluta rilevanza in termini di outcome clinico In caso di sepsi grave la probabilità di sopravvivenza e l outcome clinico si esprimono in termini di ore Ogni giorno perso per la diagnosi aumenta di una due volte la probabilità di decesso del paziente Bouza E. e altri Clin Infect Dis 2004

25 High-speed testing is essential for the rapid treatment Administration of antibiotics 1 hr delay 8% Increase of mortality rate <Medical Information of Eulji General Hospital Pharmacy Department July, 2008>

26 Sepsi Quanto più l accertamento eziologico in corso di sepsi avviene rapidamente tanto più è possibile intervenire prontamente con una terapia corretta ed appropriata arrivare ad una concreta riduzione della mortalità

27 PCR in batteriologia L uso della PCR in batteriologia richiede un attenzione differente rispetto alla PCR in virologia. Diversi microrganismi sono presenti sulla pelle o sulle superfici di lavoro

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29 Attrezzatura di laboratorio Indossare un camice monouso Evitare di toccare il palmo e le dita dei guanti indossandoli. Evitare l esposizione della pelle. Indossare i guanti sopra le maniche del camice da laboratorio. In caso di contaminazione, sostituire immediatamente i guanti o trattarli con un reagente di decontaminazione del DNA Yes No

30 Diagnosi molecolare di sepsi con SeptiFast Roche Diagnostics A partire da 3 ml di sangue intero in provette contenenti EDTA permette la diagnosi eziologica di sepsi in circa 5 ore Il sistema è una PCR real-time di tipo multiplex in grado di rilevare ed identificare a livello di specie un pannello di 25 patogeni batterici e fungini, complessivamente responsabili di più del 90% dei casi di sepsi microbiologicamente confermati

31 E utilizzato come supporto nella gestione di pazienti con sospetta sepsi ed altre infezioni di natura batterica o micotica del torrente circolatorio in combinazione con le evidenze cliniche e con i risultati delle emocolture (metodo gold standard)

32 Vantaggi del test vs emocoltura più veloce : possibilità di intervento terapeutico tempestivo individua patogeni vivi/morti e acido nucleico libero elevata sensibilità di rilevazione dei funghi capacità di rilevare infezioni multiple

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34 E in grado di rilevare/identificare contemporaneamente 25 diversi patogeni (batteri e funghi) direttamente da un singolo campione di sangue intero, senza necessità di coltura preliminare E impiegato per l identificazione di quei batteri che, essendo già trattati con antibiotici, non potrebbero essere rilevati con i tradizionali metodi di coltura. Fornisce i risultati in meno di 5 ore (contro i 2-5 giorni richiesti dalle tradizionali metodologie).

35 LightCycler SeptiFast Sangue intero 3 ml Purificazione del DNA PCR real-time Gram (-) Gram (+) Funghi Staphylococcus epidermidis1 Staphylococcus haemolyticus1 Streptococcus agalactiae2 Streptococcus pyogenes2 Streptococcus mitis2 MRSA (meca) ~ 90% dei microrganismi isolati

36 LightCycler SeptiFast Test Regione target Internal Transcribed Spacer si trova tra i geni per rrna 16S e 23S dei batteri o 18S e 28S dei funghi. primer Spacer Region (ITS) (Internal Transcribed Spacer) primer Presente in copie multiple > sensibilità analitica Ben conosciuta Adatta per identificazione di specie

37 LightCycler SeptiFast Test Flusso di lavoro Estrazione del campione (3 ml sangue-edta) lisi meccanica purificazione, preparazione MM e dispensazione 1 MagNA Lyser PCR Real-time Analisi di melting Interpretazione automatica dei risultati Identificazione di specie SepstiFast Identification Software (SIS) 2 3 LightCycle r 2.0

38 SeptiFast LysTest 1 MagNA Lyser

39 SeptiFast PrepTest Purificazione 1

40 SeptiFast Test 1

41 1 Sample Negative Control Lysis Extraction The LightCycler Instrument Reagent Control G+/G-/Fungi The LightCycler SeptiFast Kit Purified NA Gram (-) Gram (+) Fungi

42 Accessori Capillari 100µl and 20µl Caroselli per capillari da 100µl e 20µl 1 Dispensazione MM Neg.Control (NC)

43 Amplificazione PCR in tempo reale del DNA bersaglio in 3 reazioni parallele batteri Gram positivi, batteri Gram negativi, Funghi e rivelazione con sonde di ibridazione specifiche fluorescenti 2 LightCycler 2.0

44 LightCycler 2.0 IVD Caratteristiche Monitoraggio della fluorescenza in tempo reale Termociclazione ad alta velocità Software versatile Eliminazione dei rischi di contaminazione Analisi muliplex/ multicolor detection Rapida identificazione del prodotto con l analisi della Melting-Curve

45 LightCycler Termociclazione accurata e rapida Riscaldamento ad aria Capillari in borosilicato

46 3 Identificazione automatica delle specie e dei controlli mediante softwere dedicato.

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49 SeptiFast Identification Software Interpretazione automatica dei dati

50 Turnaround time (TAT) medio a confronto in rapporto agli isolati rilevato a Pordenone Microrganismo SeptiFast (range) Colorazione di GRAM Identificazione biochimica FUNGHI 14 ( 5/29 ) 36 ±12 96 ±12 BACILLI GRAM - 14 ( 5/29 ) 36 ±12 84±12 COCCHI GRAM + 14 ( 5/29 ) 36 ±12 84±12 Diamante et al RIMeL / IJLaM 2010

51 Il tempo necessario per refertare un risultato negativo con l emocoltura l è stabilito dagli standard CLSI (Clinical and Laboratori Standard Institute,, 2007) in 7 giorni. Test molecolare diretto: risposta negativa in 5 h

52 PCR vs EMOCOLTURA: pro e contro Il valore predittivo negativo è elevato. E già questo giustifica ampiamente l utilizzo l del test. Nel caso di SeptiFast, la sensibilità appare comunque nettamente superiore a quella espressa dalla emocoltura. Avolio et al. Congresso Trento gennaio 2011 Non influenzata dalla terapia antibiotica e/o antimicotica Non consente (perché non sono disponibili i rispettivi target) di identificare alcuni microrganismi. Consente di ottenere solo un identificazione di specie e non un test di sensibilità.

53 Infezione/ Trauma SIRS Sepsi Sepsi Grave Shock Settico MODS SIRS = Systemic Inflammatory Response Syndrome non necessariamente a eziologia infettiva Temperatura > 38 C o < 36 C Battito > 90 battiti / min Respirazione > 20 / min o PaCO2 <32 mm Hg Leucociti > /mm3 o < 4.000/mm3 or >10 % immature SEPSI=risposta infiammatoria sistemica ad una infezione accertata SIRS più infezione e sito di infezione documentato SEPSI GRAVE= Sepsi associate a disfunzione d organo e ipoperfusione o ipotensione

54 Indicazioni per l'utilizzo del SeptiFast sepsi/sepsi grave/shock settico criteri SIRS + diagnosi accertata o sospetta di infezione ± disfunzione d organo Sospetta endocardite* e/o infezioni da protesi endovascolari Pazienti con quadro clinico di polmonite Infezioni di cute e tessuti molli Pazienti settici immunodepressi** Sospetta infezione fungina invasiva Pazienti non responder alla terapia (anziché colturale dopo wash-out out) *Casalta et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009 ** Varani et al. Journal of Infection 2009

55 Dall esperienza clinica sperimentale alla condivisione di un percorso diagnostico nei pazienti candidati ad impianto di endoprotesi aortica. Avolio et al. Congresso Trento gennaio 2011

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57 MRSA

58 Multidrug Resistant S.aureus (MRSA) MRSA è attualmente il patogeno antibiotico-resistente più comune identificato negli ospedali in molte parti del mondo. Gordon RJ and Lowry FD. CID, 2008

59 MRSA epidemiology and background Approximately 20% of individuals are persistently nasally colonized with S.aureus and 30% are intermittently colonized. Colonization clearly increases the risk for subsequent infection. Gordon RJ and Lowy FD. CID, 2008 Werthein HF et al. Lancet Infect Dis, 2005

60 Lo studio ISABEL (Italian Staphylococcus Aureus Benchmarketed Epidemiology), che tra settembre 2004 e maggio 2005 ha arruolato 3648 pazienti in 27 ICU(Unità di Terapia Intensiva), italiane ha dimostrato nei pazienti positivi allo screening al momento del ricovero una % di malattia da MRSA pari al doppio rispetto ai pazienti negativi ed una % quasi 10 volte superiore durante la degenza. PROTOCOLLO PER LA SORVEGLIANZA DI MRSA IN AOSMA. Comitato infeioni settembre 2008

61 SOLUZIONE Ridurre le infezioni associate all RMSA mediante una rapida ed attiva sorveglianza.

62 Procedure adottate per il contenimento della diffusione di MRSA nelle strutture sanitarie. Scrupolosa igiene delle mani Adeguati programmi di controllo dell uso degli antibiotici (antibiotic stewardship) Sorveglianza attiva per l identificazione di pazienti con infezione e/o colonizzazione Eventuale decolonizzazione e isolamento del paziente colonizzato.

63 Precauzioni da contatto e sorveglianza attiva ottenuta con lo screening hanno la capacità di ridurre morbilità e mortalità nei pazienti risultati colonizzati.

64 Questi pazienti, infatti, se non individuati tempestivamente,, possono essere esposti a un maggiore rischio di sviluppare un infezione MRSA correlata durante la degenza, soprattutto in contesti ad elevata criticità,, quali ad esempio le Unità di Terapia Intensiva (ICU).

65 Inoltre, è dimostrato che i pazienti asintomatici colonizzati rappresentano la più efficace fonte di trasmissione di MRSA nelle strutture sanitarie.

66 GeneXpert GeneXpert automatizza le fasi di preparazione del campione eseguendo tutti gli step necessari all estrazione ed alla real time PCR, mediante un sistema avanzato di cartuccia microfluidica.

67 La base di questa tecnologia sono le cartuccie brevettate monouso che nelle differenti camere contengono tutti i reagenti in forma liofilizzata necessari all estrazione e all amplificazione amplificazione in real time PCR del target. La cartuccia deve essere ricostituita all inzio dell esperimento esperimento aggiungendo nelle diverse camere le soluzioni fornite con la cartuccia stessa (unico( step manuale della metodica).

68 GeneXpert è un sistema che automatizza i tre processi necessari per eseguire una real time PCR: : preparazione del campione, amplificazione e rilevamento. E un sistema modulare che consente di eseguire da 1 a 4 analisi contemporaneamente anche per differenti analiti.

69 Il software del GeneXpert è completamente automatico ed elimina le problematiche relative alla soggettiva interpretazione dei risultati. I risultati qualitativi sono visualizzabili mediante le curve di Real Time PCR che appaiono a monitor per ogni modulo dello strumento.

70 Xpert MRSA provvede a dare una risposta in 66 minuti circa contro i due/tre giorni dei metodi colturali.

71 PROTOCOLLO DI SORVEGLIANZA PER MRSA IN ICU Analisi eseguita con metodo molecolare rapido (GeneXpert-Cepheid)) e refertata in giornata. Identificazione tempestiva di eventuale colonizzazione nasale da MRSA in tutti i pazienti che afferiscono in ICU.

72 Il monitoraggio individua tempestivamente eventuali portatori di MRSA, mettendo in atto immediatamente tutte le procedure previste per la decolonizzazione e l isolamento del paziente e per indirizzare in modo tempestivo e mirato la terapia in caso di sviluppo di malattia infettiva correlabile a MRSA.

73 In caso di positività per MRSA Decolonizzazione nasale con mupirocina (Bactroban pomata) endonasale (3 applicazioni/die per 5 gg). Decolonizzazione generale con clorexidina gluconato al 5% (Neoxene Soluz 5%), una volta al giorno per 5 gg. Isolamento del paziente in stanza singola o per coorte e applicazione delle precauzioni da contatto. In caso di insorgenza di malattia da infezione Campionamento microbiologico rapportato alla sede di infezione Inizio trattamento con vancomicina o altro farmaco anti-mrsa, da scegliersi in base alla farmacocinetica rapportata al sito di infezione e alla MIC rilevata, se disponibile.

74 MRSA NASAL CARRIERS (ICU, Mar 09- Sept 10) Number of patients (7%) MRSAP MRSAN TOT ADMISSIONS 0 1

75 Tecniche di Biologia Molecolare utilizzate al S.Maria degli Angeli di Pordenone Laboratorio di Microbiologia-Virologia Virologia RESPIRATORI Virus H1-N1 VIROLOGIA Respiratori

76 Infezioni respiratorie acute sono la principale causa di malattia nel mondo Herman Goossens BMJ 2006

77 Le infezioni delle basse vie respiratorie LRTI (lower respiratory tract infections) sono le più comuni infezioni di adulti e bambini. Murdoch DR. APMIS 112: , 2004 La popolazione più a rischio per lo sviluppo di una malattia respiratoria fatale sono bambini, anziani ed immunocompromessi. Herman Goossens BMJ 2006

78 Se la diagnosi clinica di LRTI è relativamente facile da fare, determinare l agente l eziologico responsabile può essere più difficile a causa dei test diagnostici convenzionali limitati Murdoch DR. APMIS 112: , 2004 Durante gli anni recenti un notevole numero di agenti respiratori sconosciuti sono stati scoperti e di questi, le culture in vitro sono o molto lunghe o irrealizzabili. Ieven, M. J Clin Virol In generale solo nel 50% dei casi l agente l eziologico viene identificato Loens K et al. J Clin Microbiol 2009

79 I test tradizionali virologici e sierologici per la determinazione di microorganismi responsabili di polmoniti hanno una bassa sensibilità,, necessitano di molto tempo per la loro identificazione ed individuano solo uno o alcuni dei numerosi agenti eziologici Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008

80 Nuova filosofia e organizzazione in Virologia Passaggio da una filosofia colturale a una filosofia molecolare. Acquisizione di nuove tecnologie.

81 Nel solo 2008 sono state introdotte 25 nuove diagnostiche molecolari,, che garantiscono oggi il più esteso panel di diagnostiche molecolari del Dipartimento e la massima efficienza ed efficacia diagnostica in numerosi contesti clinici.

82 Con le colture cellulari il TAT di una risposta negativa è tra i 10/15 giorni In Europa il 90/95% degli antibiotici viene usato al di fuori delle strutture ospedaliere e la gran parte viene prescritta per le infezioni delle basse vie respiratorie acquisite in comunità. Herman Goossens BMJ 2006

83 Pneumonia in immuno-competent adults National Standard Method Multiplex Real Time PCR Multiplex Real Time PCR

84 Parainfluenza virus 1 Parainfluenza virus 2 Parainfluenza virus 3 Adenovirus A/B/C/D/E Coronavirus 229E/NL63 Coronavirus OC43 Rhinovirus A/B/C Influenza A virus RSV A RSV B 4 ore e 15 Bocavirus 1/2/3/4 Influenza B virus Parainfluenza virus 4 Enterovirus

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87 elettrodi gel

88 Seeplex RV 15 ONE STEP Parainfluenza virus 1 Parainfluenza virus 2 Parainfluenza virus 3 Adenovirus A/B/C/D/E Coronavirus 229E/NL63 Dual Priming Oligonucleotide technology (Seegene) Coronavirus OC43 Rhinovirus A/B/C Influenza A virus RSV A RSV B Bocavirus 1/2/3/4 Influenza B virus Parainfluenza virus 4 Enterovirus M.pneumoniae C.pneumoniae L.pneumophila S.pneumoniae H.influenzae B.pertussis

89 Infezioni respiratorie ad eziologia virale a Pordenone: gennaio ottobre gennaio gennaio marzoaprile maggio luglio luglio ottobre settembre ENTERO CORON BOCA ADE CORON RHINO ADE RHINO MPV MPV PIV PIV INFLB INFLB INFLA INFLA RSV RSV test eseguiti con RV12 RV15 SEEGENE

90 Influenza virus type A and B, parainfluenza virus type 1, 2, 3, respiratory syncytial virus (RSV) type A and B, and adenovirus are major causes of lower respiratory tract infections in infants and young children under 5 yr old. Human metapneumovirus, also identified in children with respiratory infection, rhinovirus, and coronavirus are known as causative agents of the common cold. Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008

91 La disponibilità di metodi rapidi per la diagnosi virale permetterà d ora in poi di decidere in modo più accurato il trattamento, riducendo così l uso di inutili agenti antimicrobici ed abbreviando i tempi di ospedalizzazione per i pazienti. Kyoung Ho Roh et al. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2008

92 GRAZIE PER L ATTENZIONE Tecniche convenzionali Tecniche molecolari