Analisi genetica del ciclo cellulare

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1 Analisi genetica del ciclo cellulare Sistema sperimentale basato sull uso di eucarioti semplici come i lieviti che sono funghi unicellulari Saccharomyces cerevisiae Lievito che si riproduce per gemmazione (Budding yeast) Schizosaccharomyces pombe Lievito che si riproduce per scissione (Fission yeast) 1

2 Schema del ciclo cellulare di S. cerevisiae Le cellule figlie al momento della nascita sono più piccole delle cellule madri e devono crescere più a lungo in G1 prima di poter avere dimensioni compatibili con la successiva fase S 2

3 Schema del ciclo cellulare di S. pombe Le cellule più lunghe sono in procinto di entrare in mitosi, mentre quelle più corte sono state appena prodotte dalla citocinesi 3

4 Mancanza di nutrienti causa meiosi e sporulazione S. cerevisiae Proliferazione diploide Proliferazione aploide Coniugazione dopo la schiusa delle spore Mancanza di nutrienti causa coniugazione S. pombe Proliferazione aploide Proliferazione diploide Dopo la coniugazione si ha meiosi e sporulazione 4

5 In organismi unicellulari la DIVISIONE CELLULARE coincide con la RIPRODUZIONE La mancanza di nutrienti potrebbe causare l arresto del ciclo cellulare, ma i lieviti posseggono due meccanismi per impedire l effetto letale della mancanza di cibo: le cellule mantengono sempre una quantità minima di nutrienti necessaria per affrontare UNA replicazione, UNA mitosi e UNA divisione cellulare; le cellule reagiscono alla mancanza di nutrienti arrestando il ciclo cellulare in un punto preciso 5

6 Due parametri regolano la proliferazione cellulare: Velocità di crescita (Vc) Velocità di divisione cellulare (Vd) Quando Vc = Vd le dimensioni cellulari rimangono costanti durante ogni ciclo cellulare Quando o se Vc > Vd si producono cellule sempre più grandi ad ogni generazione Quando o se Vc < Vd si producono cellule sempre più piccole ad ogni ciclo di divisione Poiché il ritmo di crescita è regolato dall ambiente esterno (nutrienti), la lunghezza del ciclo cellulare deve essere regolabile in maniera corrispondente 6

7 Controllo delle dimensioni della cellula tramite il controllo del ciclo cellulare 7

8 Yeast Size and Morphology Through the Cell Cycle 8

9 Growth Regulation in Yeast Fission yeast grow in G1; - G2/M highly regulated Budding yeast grow in G1; - G1/S highly regulated S-phase regulation better understood in Budding yeast where G1/S more highly regulated than in Fission yeast 9

10 Esistono dei punti di controllo delle dimensioni sia in G1 che in G2 In S. cerevisiae il punto di controllo della taglia in G1 (START) è il più importante: se una cellula passa il punto di START supererà anche il punto di controllo in G2. G1 è sensibile all ambiente esterno. In S. pombe il punto di controllo in G2 (INGRESSO MITOTICO) è il più selettivo per il controllo delle dimensioni. G2 è sensibile all ambiente esterno. Nei mammiferi il punto di controllo fondamentale è in G1 ed è definito PUNTO DI RESTRIZIONE 10

11 S. pombe cell cycle Mutants have been identified that are stuck at some point in this cycle (= cell division cycle, or cdc mutants). Such mutants are lethal, and are maintained as ts (temperature sensitive) alleles. 11

12 I mutanti cdc possono essere selezionati solo se il loro fenotipo è CONDIZIONALE, cioè se il prodotto del gene smette di funzionare soltanto in certe condizioni. Di solito i mutanti condizionali TEMPERATURA-SENSIBILI (ts). sono Un ceppo cdc-ts cresce a bassa temperatura (CONDIZIONI PERMISSIVE) e non cresce più a temperatura alta (CONDIZIONI NON PERMISSIVE). 12

13 Both yeasts have been useful for the identification of cell division cycle (CDC) genes through conditionally lethal mutation CDC-ts mutants fail to cycle at restrictive temperature, but they DO grow. This allows one to distinguish them from simple lethals. Like any other ts mutation, the wild-type allele at this locus can be cloned by complementation with a plasmid library 13

14 Isolating Temperature Sensitive Mutants in Haploid Yeast 14

15 Identificazione di mutanti cdc-ts di S. cerevisiae Isolamento del gene CDC-28 wild-type 15

16 Alla temperatura permissiva il prodotto dei geni cdc viene sintetizzato Alla temperatura non permissiva (o restrittiva) il gene non viene espresso T. permissiva per S. cerevisiae C T. restrittiva per S. cerevisiae C 16

17 Comportamento di un mutante cdc sensibile alla temperatura 17

18 The Behavior of a Temperature Sensitive cdc Mutant cdc mutant growing at permissive temp (23 C) cdc mutant growth arrested after 6 hrs at non-permissive temp (36 C) 18

19 Da S. pombe sono stati isolati due tipi di mutanti con difetti nei meccanismi di regolazione del ciclo cellulare Tipo I Mutanti cdc che, alla t. permissiva, non riescono a passare attraverso una delle fasi del ciclo cellulare; essi formano cellule più grandi che non sono capaci di dividersi mutante cdc 219

20 Rappresentazione schematica dei fenotipi mutanti cdc 2 condizionali di S. pombe cdc 2+ cdc 2cdc 2D 20

21 Screening of cdc mutants with different phenotypes identified those that initiated mitosis early If mutations that block Mitosis are cdc2 (big) mutations that initiate mitosis early will be small wild type wee1 Probably Regulators of mitosis Screening for such mutants, discover of the wee mutants From Nurse (2002) ChemBioChem 3:596 21

22 Da S. pombe sono stati isolati due tipi di mutanti con difetti nei meccanismi di regolazione del ciclo cellulare Tipo II Mutanti wee che, alla t. permissiva, mancano delle proteine che normalmente impediscono alle cellule di dividersi se sono troppo piccole; essi formano cellule più piccole mutante wee 1 22

23 Rappresentazione schematica dei fenotipi mutanti condizionali di S. pombe cdc 2+ cdc 2cdc 2D wee 1 23

24 La mutazione wee1 è recessiva ts Alla t. permissiva (25 C) il mutante wee1 ha la taglia come il wild type Alla t. restrittiva (37 C) il mutante wee1 ha la taglia ridotta La durata del ciclo cellulare a 25 C e 37 C è uguale? Le cellule del mutante wee1 sono più piccole perché il ciclo cellulare è più corto? 24

25 Taglia minima richiesta per entrare in mitosi 25

26 La mutazione wee1 influenza il ciclo cellulare Quale è la funzione della proteina Wee1? In quale momento del ciclo cellulare è necessaria la sua presenza? Quale è la transizione che viene inibita dalla proteina Wee1 mutante? La normale funzione della proteina Wee1 è di ritardare l ingresso in mitosi finchè le cellule non hanno raggiunto la taglia necessaria. Wee1 agisce come un meccanismo omeostatico che mantiene costante la taglia delle cellule. 26

27 Mutanti di S. pombe che influenzano la taglia Ingresso normale in M Blocco ingresso in M Blocco ingresso in M Accellerazione ingresso in M Ingresso normale in M La funzione di Cdc25 è quella di superare la abilità di Wee1 di inibire l ingresso in Mitosi Cdc25 e Wee1 hanno un effetto antagonistico 27

28 La Mitosi viene indotta da un cambiamento della quantità di Cdc2 o della sua attività? Copie addizionali di Cdc2 e Cdc13 non influenzano il ciclo E importante la ATTIVITA piuttosto che la quantità Copie addizionali di Wee1 causano un ritardo nell ingresso in M. Copie addizionali di Cdc25 anticipano M. E importante la QUANTITA di Cdc25 e di Wee1 piuttosto che la attività. 28

29 Mutante cdc25- Mutante cdc25d Non entra in M Prematuro ingresso in M (cellule lunghe) (cellule piccole) La proteina Cdc25 stimola l attività di MPF Mutante wee1- Mutante wee1d Prematuro ingresso in M Non entra in M (cellule piccole) (cellule lunghe) La proteina Wee1 inibisce l attività di MPF 29

30 attivatore inibitore 30

31 The real power of yeast genetics emerged not from the identification of a mutant here and there, but from the possibility of getting multiple of alleles of any one gene Even then, CDC genetics was mostly an intellectual exercise until molecular biology made it possible to clone the genes, obtain their sequences, and purify the corresponding gene products 31

32 32

33 Phosphorylation changes structure and function phosphate group added by protein kinase phosphate group removed by phosphatase Phosphorylation on: Ser, Thr and Tyr residues 33

34 Why is phosphorylation such a common mechanism for regulating the activity of proteins? Reversible Large negative charge of phosphate group can cause major changes in protein structure that result in changes in function 34

35 Phosphorylation Addition of phosphate group to protein Catalyzed by protein kinases Reversible (phosphate group removed by protein phosphatases) Regulates activity of protein Involved in cell signaling pathways Proteins can be phosphorylated at multiple sites 35

36 Cdc2 was cloned and sequenced, revealing a Protein Kinase Cdc2 Cdc28 Kin28 Smk1 Hog : MEN-YQKVEKIGEGTYGVVYKA---RHKLSGRIVAMKKIRLEDESEGVPSTAIREISLLKEVNDENN: 1: MSGELAN-YKRLEKVGEGTYGVVYKALDLRPGQGQRVVALKKIRLESEDEGVPSTAIREISLLKELKDDN-: 1: MKVNME--YTKEKKVGEGTYAVVYLGCQ---HSTGRKIAIKEIKTSEFKDGLDMSAIREVKYLQEMQHPN-: 1:MNCTLTDNTRAINVASNLGAPQQRTIFAKERISIPGYYEIIQFLGKGAYGTVCSVKFKGRSPAAR-IAVKKISNIFNKEILLKRAIRELKFMNFFKGHKN: 1:----MTTNEEFI RTQIFGTVFEITNRYNDLNPVGMGAFGLVCSATDTLTSQP---VAIKKIMKPFSTAVLAKRTYRELKLLKHLR-HEN: Cdc2 64:RSNCVRLLDILHAES-KLYLVFEFLDMDLKKYMDRISETGATSLDPRLVQKFTYQLVNGVNFCHSRRIIHRDLKPQNLLIDKEGNLKLADFGLARSFGVP:162 Cdc28 69:---IVRLYDIVHSDAHKLYLVFEFLDLDLKRYMEGIPKDQPLGAD--IVKKFMMQLCKGIAYCHSHRILHRDLKPQNLLINKDGNLKLGDFGLARAFGVP:164 Kin28 65:---VIELIDIFMAYDN-LNLVLEFLPTDL----EVVIKDKSILFTPADIKAWMLMTLRGVYHCHRNFILHRDLKPNNLLFSPDGQIKVADFGLARAIPAP:157 Smk1 100:IVNLIDLEIVTSSPYDGLYCYQELIDYDLAKVIH-----SSVQLSEFHIKYFLYQILCGLKYIHSADVIHRDLKPGNILCTLNGCLKICDFGLARGIHAG:194 Hog1 82:LICLQDIFL---SPLEDIYFVTELQGTDLHRLLQ-----TRPLEKQF-VQYFLYQILRGLKYVHSAGVIHRDLKPSNILINENCDLKICDFGLAR-----:167 Cdc2 Cdc28 Kin28 Smk1 Hog :LRN YTHEIVTLWYRAPEVLLGSRHYSTGVDIWSVGCIFAEMIRRSPLFPGDSEIDEIFKIFQVLGTPNEEVWPGVTLLQDYKST-----FP: :LRA YTHEIVTLWYRAPEVLLGGKQYSTGVDTWSIGCIFAEMCNRKPIFSGDSEIDQIFKIFRVLGTPNEAIWPDIVYLPDFKPS-----FP: :HEI LTSNVVTRWYRAPELLFGAKHYTSAIDIWSVGVIFAELMLRIPYLPGQNDVDQMEVTFRALGTPTDRDWPEVSSFMTYNKLQI---YP: :FFKCHSTVQ-PHITNYVATRWYRAPELLLSNQPYSKSVDIWAVGCILAEFYARKPVFMGRDSMHQIFEIIKVLGTPDKDILIKFGTIKAWNLGK-NSNNP: : IQDPQMTGYVSTRYYRAPEIMLTWQKYDVEVDIWSAGCIFAEMIEGKPLFPGKDHVHQFSIITDLLGSPPKDVI---NTICSENTLKFVTSLP:257 Cdc2 Cdc28 Kin28 Smk1 Hog :RWKRMDLHKVVPNGEEDAIELLSAMLVYDPAHRISAKRALQQNYLRDFH : :QWRRKDLSQVVPSLDPRGIDLLDKLLAYDPINRISARRAAIHPYFQES : :PPSRDELRKRFIAASEYALDFMCGMLTMNPQKRWTAVQCLESDYFKELPPPSD-PSSIKIRN : :VYKKIPWSNIFPFASHEAINLIESLLHWDSTHRLNVEQAISHPFLNEVRKPDDEPVCLQGPFDFTYESELNSMSKLRDYLVEEVKNFKTDLSSSSL----: :HRDPIPFSERFKTVEPDAVDLLEKMLVFDPKKRITAADALAHPYSAPYHDPTDEPVA-DAKFDWHFNDADLPVDTWRVMMYSEILDFHKIGGSDGQIDIS: Cdc2 : : Cdc28 : : Kin28 : : Smk1 : : Hog1 357:ATFDDQVAAATAAAAQAQAQAQAQVQLNMAAHSHNGAGTTGNDHSDIAGGNKVSDHVAANDTITDYGNQAIQYANEFQQ:435 36

37 Cdc28 is the Budding Yeast Cdc2 Homologue - Cdc28 regulates entry into S-phase and mitosis - Cdc28 is a protein kinase that complements cdc2ts Cdc28 is 63% Identical to Cdc2 Cdc28 Cdc :MSGELANYKRLEKVGEGTYGVVYKALDLRPGQGQRVVALKKIRLESEDEGVPSTAIREISLLKELKDDN----IVRLYDIVHSDAHKLYLVFEFLDLDLK: 96 1:----MENYQKVEKIGEGTYGVVYKARHKLSG---RIVAMKKIRLEDESEGVPSTAIREISLLKEVNDENNRSNCVRLLDILHAES-KLYLVFEFLDMDLK: 92 Cdc28 Cdc :RYMEGIPKD--QPLGADIVKKFMMQLCKGIAYCHSHRILHRDLKPQNLLINKDGNLKLGDFGLARAFGVPLRAYTHEIVTLWYRAPEVLLGGKQYSTGVD:194 93:KYMDRISETGATSLDPRLVQKFTYQLVNGVNFCHSRRIIHRDLKPQNLLIDKEGNLKLADFGLARSFGVPLRNYTHEIVTLWYRAPEVLLGSRHYSTGVD: Cdc28 195:TWSIGCIFAEMCNRKPIFSGDSEIDQIFKIFRVLGTPNEAIWPDIVYLPDFKPSFPQWRRKDLSQVVPSLDPRGIDLLDKLLAYDPINRISARRAAIHPY:294 Cdc2 193:IWSVGCIFAEMIRRSPLFPGDSEIDEIFKIFQVLGTPNEEVWPGVTLLQDYKSTFPRWKRMDLHKVVPNGEEDAIELLSAMLVYDPAHRISAKRALQQNY:292.. Cdc28 295:FQES-:298 Cdc2 293:LRDFH:297 37

38 Limited biochemistry confirmed that Cdc2 is a Protein Kinase Functional characterization: - Cdc2 immunoprecipitates have kinase activity - this kinase activity peaks at G2/M - the kinase activity from cdc2ts lysates disappears at high temperature Studies of genetic interactions suggested, however, that Cdc2 did not function alone: Cdc13 mutations had just the same phenotype as Cdc2, and mild alleles of the two genes were additive, an example of a synthetic genetic interaction. 38

39 Cloning and sequencing of Cdc13 showed that it was a cyclin Cdc13 functions at the same time in mitosis as Cdc2 - Cdc13 required for Cdc2 function CDC13 Cloning reveals that Cdc13 is a Cyclin - Homology to Starfish Cyclin B (Tim Hunt) - Cdc13 protein levels cycle - correspond with Cdc2 activity - Cdc13 is required for Cdc2 function in-vitro and in-vivo Nurse and collaborators propose that Cdc2 is Cyclin-Dependent Kinase, but clarifying this with authority required biochemistry. 39

40 Cyclins Regulatory subunits of Cdk (cyclindependent kinase) complexes (heterodimeric protein kinases) Turn on kinase activity (phosphorylation) Levels vary cyclically during cell cycle Degraded by proteolysis at specific points in the cell cycle 40

41 Cdk (cyclin-dependent kinase) complexes Heterodimeric (two different subunits) protein kinases that regulate cell cycle Cyclin: regulatory subunit Cdk (cyclin-dependent kinase): catalytic subunit Phosphorylate proteins involved in cell cycle Different Cdk complexes for different cell-cycle phases (G1, S, M) 41

42 La fosfatasi Cdc25 ha una azione ATTIVATRICE su MPF La chinasi Wee1 ha una azione INIBITRICE su MPF Ulteriori studi hanno rivelato è una FOSFATASI e che la che la Cdc25 Wee1 è una CHINASI 42

43 43

44 Regolazione della attività di MPF di S. pombe MPF Wee1 CAK Cdc25 Cdc13/Cdc2 (ciclinab/cdk) chinasi (effetto inibitorio) chinasi (effetto attivatorio) fosfatasi (effetto attivatorio) 44

45 Le attività di Cdc25 e di Wee1 sono regolate durante il ciclo cellulare INTERFASE bassa [Cdc25] alta [Wee1] bassa [Wee1] alta [Cdc25] MITOSI 45

46 Ruolo del residuo di Tyr 15 fosforilato dalla Wee1 15 N C Cdc2+ T Y G mutagenesi sito-specifica N C Cdc2-F15Y T F G I mutanti Cdc2-F15Y MPF è sempre attivo Prematuro ingresso in hanno fenotipo wee Mitosi 46

47 Struttura della Cdk2 umana, omologa alla subunità Cdc2 di MPF Zona di contatto con la ciclina in giallo Il T loop contiene Thr stimolatoria (T160) ATP rappresentato con sfere 47

48 Complesso Cdk2-ciclina A non fosforilato (bassa attività) Il legame della ciclina A provoca uno spostamento del T loop che, però, non consente la completa attività chinasica 48

49 Complesso Cdk2-ciclina A fosforilato (elevata attività) La fosforilazione della Thr stimolatoria aumenta la affinità dei substrati proteici da fosforilare 49

50 Basi strutturali dell attivazione della Cdk 50

51 Il modo in cui una Cdk agisce da integratore di segnali CAK attivatrice Cdc25 attivatrice Sito di attivazione (Thr 161) Sito di inibizione (Tyr 15) Wee1 inibitrice 51

52 Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae Mutants have been identified that are stuck at some point in this cycle (= cell division cycle, or cdc mutants). Such mutants are lethal, and are maintained as ts (temperature sensitive) alleles. 52

53 Mutanti cdc di S.cerevisiae T. permissiva = C T. restrittiva = C Alla temperatura non permissiva solo i mutanti cdc si arrestano sempre allo stesso punto del ciclo cellulare Mutante cdc28ts di S. cerevisiae Omologo di cdc2ts di S. pombe53

54 Dimostrazione sperimentale del punto di START in S. cerevisiae 54

55 INTERFASE PRECOCE DI S. CEREVISIAE ts cdc7 Inizia la sintesi di DNA Si forma la gemma Si duplica il corpo del fuso polare Mutanti che non iniziano la sintesi di DNA alla T. restrittiva ts Mutanti che non formano la gemma alla T. restrittiva ts Mutanti che non duplicano il corpo del fuso polare alla T. restrittiva ts Mutanti che alla T. restrittiva bloccano TUTTI gli eventi a valle cdc24 cdc31 cdc28 55

56 Mappa logica del ciclo cellulare di S. cerevisiae 56

57 ts I mutanti cdc7, cdc24ts e cdc31ts bloccano eventi a valle individuali cdc28ts è un componente chiave del macchinario del ciclo cellulare 57

58 La scoperta del mutante cdc28 di S. cerevisiae ha consentito di definire il punto di START: ts Lo START viene definito come il momento in cui la replicazione del DNA, la formazione della gemma e la duplicazione del corpo del fuso polare diventano insensibili alla perdita di funzione di Cdc28; Il punto di START rappresenta la fine di un processo che impegna irreversibilmente le cellule a replicare il proprio DNA; Quando le cellule oltrepassano il punto di START sono irrevocabilmente destinate ad entrare in S 58

59 Cellule che completano un ciclo cellulare in un tempo inferiore a quello richiesto per raddoppiare la propria taglia diventerebbero progressivamente sempre più piccole Tutte le cellule eucariotiche replicano il proprio DNA e segregano i cromosomi in tempi inferiori a quelli richiesti per raddoppiare le proprie dimensioni Si impiega meno tempo a completare un ciclo di divisione cellulare che a raddoppiare le dimensioni cellulari 59

60 Nel lievito S. cerevisiae la divisione produce due cellule figlie di dimensioni differenti. Se fosse necessario SOLO raddoppiare la taglia per poter andare incontro ad un altro ciclo di divisione cellulare si avrebbero degli effetti catastrofici!! 60

61 La crescita cellulare e il ciclo di divisione cellulare sono coordinati La cellula figlia deve crescere più della cellula madre per arrivare alla taglia critica necessaria per passare attraverso il punto di START, quindi l intervallo G1 è più lungo 61

62 I lieviti che si riproducono per gemmazione usano il punto di START come punto di controllo delle dimensioni e delle condizioni esterne. Cosa succede se mancano i nutrienti? Le cellule mantengono sempre una quantità di minima di nutrienti sufficiente per affrontare UNA replicazione, UNA mitosi ed UNA divisione cellulare; Le cellule reagiscono alla mancanza di nutrienti arrestando il ciclo cellulare in un punto preciso 62

63 Destino alternativo di S. cerevisiae in prossimità del punto di START 63

64 La scoperta del mutante cdc28 di S. cerevisiae ha consentito di definire il punto in cui le cellule si bloccano e verificano se ci sono tutte le condizioni per passare attraverso il punto di START. ts Lo studio della coniugazione di cellule aploidi di S. cerevisiae ha consentito di chiarire quali sono i fattori in grado di regolare il passaggio attraverso il punto di START 64

65 Le cellule aploidi di lievito producono fattori di accoppiamento (feromoni) e i loro recettori In presenza di una quantità sufficiente di nutrienti le cellule si moltiplicano come diploidi, ma in loro assenza sono indotte alla meiosi 65

66 Accoppiamento nel budding yeast Affinchè avvenga la coniugazione è necessario: Che le due cellule aploidi siano di tipo differente Che le due cellule si trovino nella stessa fase del ciclo cellulare (G1) 66

67 Quando i feromoni a e α legano i rispettivi recettori attivano una trasduzione del segnale intracellulare che prevede due differenti strade: Arresto del ciclo cellulare allo START Espressione di geni coinvolti nel processo dell accoppiamento Questo meccanismo consente la coniugazione solo alle cellule che sicuramente hanno già duplicato correttamente il proprio DNA e che sono in sosta allo START 67

68 PATHWAY DI SEGNALAZIONE feromoni a o α legati ai rispettivi recettori Arresto in G1 (prima dello START) Attivazione di geni di accoppiamento 68

69 I mutanti resistenti all accoppiamento possono essere distinti in due gruppi: MUTANTI ARRESTO-DIFETTIVI MUTANTI DI SEGNALAZIONE 69

70 Regulation of G1/S transition (start/restriction point) Identification of yeast G1 cyclin Genetic screen: add α-mating factor to yeast culture Screen for ts mutants that continue to grow at 37oC in presence of α-mating factor CLN3 mutant: unable to respond to α-mating factor mutant cells smaller than wild type CLN3 cloned: weakly homologues to CyclinB Levels of CLN3 affect ability of yeast to pass START 70

71 Dosage effect of CLN3 La selezione di mutanti arresto-difettivi ha portato all isolamento del gene CLN3 cln3 indica assenza del gene CLN3-1D indica il mutante in cui è presente una delezione al C-ter che stabilizza la proteina 71

72 N C Cicline mitotiche N C Cicline G1 Box di distruzione riconosciuto dalla ubiquitina Box di distruzione: sequenza PEST Regione di elevata omologia fra le cicline 72

73 La ricerca di mutanti capaci di sopperire alcune mutazioni cdc28ts ha portato all isolamento di altre cicline G1 CLN1 e CLN2 73

74 Dimostrazione che le cicline G1 regolano l ingresso in S in S. cerevisiae Delezione dei geni codificanti per le cicline G1 (CLN1, 2, 3) Trasformazione delle cellule prive di CLN1, 2 e 3 con vettore di espressione in cui CLN3 è sotto il controllo del promotore forte GAL1 (inibito da glucosio) Inibizione della espressione di CLN3 in presenza di glucosio Espressione di CLN3 in assenza di glucosio 74

75 Proof that G1 Cyclins control Start Inducible Cln3: To examine cell cycle state: stain with DNA dye pass through fluorescence-activated cell sorter 2 peaks: G1 cells (1N) and G2 cells (2N) 75

76 Il prodotto dei geni CLN1, 2 e 3 è indispensabile per passare attraverso il punto di START 76

77 Le cicline CLN1, 2 e 3 sono intercambiabili C è bisogno almeno di una ciclina G1 per passare attraverso il punto di START 77

78 Regolazione delle cicline G1 Loop di feedback positivo che prevede sia attivazione post-trascrizionale che post-traduzionale 78

79 Destino alternativo di S. cerevisiae in prossimità del punto di START 79

80 La attivazione di proteine G da parte dei feromoni porta all arresto del ciclo cellulare Il pathway di segnalazione è molto complesso e richiede molti componenti Il pathway di segnalazione mediato da feromoni in S. cerevisiae è molto simile a quello delle cellule di mammifero che è mediato da fattori di crescita I feromoni e i fattori di crescita regolano la stessa transizione G1/S 80

81 MECCANISMI DI SEGNALAZIONE 81

82 Attivazione mediata da proteine G trimeriche 82

83 camp: secondo messaggero 83

84 84

85 IP3 e DAG: secondi messaggeri 85

86 86

87 Via di segnalazione mediata da Ras 87

88 Sinergia fra vie di trasduzione del segnale 88

89 Cascata di proteine chinasi che trasmette segnali a valle di proteine G trimeriche nella via di segnalazione mediata da feromoni in S. cerevisiae 89

90 Fattore di accoppiamento Attivazione Prot. G trimerica Attivazione cascata di Chinasi Fus3 Far1 Far1-P Stop allo START Fus3-P Ste12 Ste12-P Trascrizione geni per accoppiamento 90

91 91

92 Differenti pathways di segnalazione a confronto 92

93 La mancanza di nutrienti causa l arresto in G0 Selezione di mutanti che presentano difetti nel meccanismo di monitoraggio della disponibilità di nutrienti Questi mutanti bloccano il passaggio attraverso lo START alla T. non permissiva e si comportano come se le cellule si trovassero in carenza di nutrienti 93

94 Isolamento del mutante cdc35ts Il prodotto di cdc35+ è la adenilato ciclasi che catalizza la formazione di AMP ciclico a partire dall ATP L AMP ciclico attiva la chinasi dipendente da camp 94

95 di cdc35+ causano un abbassamento dei livelli di camp e quindi una riduzione della attività della chinasi camp-dipendente. Mutazioni Una minore attività della chinasi camp-dipendente causa una diminuzione della velocità di sintesi proteica La velocità di sintesi delle cicline G1 determina la possibilità o meno di passare attraverso il punto di START 95

96 + La attività della adenilato ciclasi Cdc35 + è regolata da Ras (p21ras) 96

97 Small GTP-binding proteins: active in the GTP-bound form 1. Intrinsic GTPase activity is poor 2. The catalytic cycle is regulated by other proteins: GEFs (Guanine nucleotide exchange factors) and GAPs (GTPase-activating proteins) Stimulated by GAP Stimulated by GEF 97

98 La attività di Ras (p21ras) + è regolata da Cdc25 Il prodotto di cdc25+ è la proteina che scambia nucleotidi guanilici (GEF). Mutanti cdc25ts si bloccano allo START (G0) perché Ras si accumula nella sua forma inattiva Ras-GDP 98

99 + La attività di Cdc35 + è regolata da Ras (p21ras) Velocità della sintesi proteica OK Cicline G1 Crescita OK La capacità delle cellule di arrestare il ciclo cellulare in mancanza di nutrienti è controllata dalla attività di almeno due proteine (cdc25+ e cdc35+) 99

100 Pathway di segnalazione mediato dalla mancanza di nutrienti (arresto in G0) Cdc25 p21ras-gtp Cdc35 ATP (proteina che scambia nucleotidi guanilici) (Proteina G monomerica) (adenilato ciclasi) camp Chinasi camp-dipendente Effetto sulla velocità della sintesi proteica Sintesi cicline G1 OK Crescita e progressione del ciclo cellulare 100

101 Destino di S. cerevisiae durante la transizione G1/S Arresto in G0 Arresto in G1 G1 Sporulazione (cellule diploidi) Accoppiamento (cellule aploidi) 101