Patogenicità ed evoluzione

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1 Patogenicità ed evoluzione PATOGENESI VIRALE Processo attraverso il quale un virus è in grado di causare malattia nell ospite Conflitto evolutivo I virus cercano un vantaggio riproduttivo nell ospite naturale ed evolvono verso forme di interazione che garantiscano permanenza e/o trasmissione senza eliminare l ospite stesso (bassa virulenza o elevata capacità di trasmissione) Molte infezioni virali sono asintomatiche

2 EVOLUZIONE E VIRULENZA La virulenza è determinata geneticamente e una specie virale comprende varianti dotate di diversa virulenza Ceppi di virus estremamente virulenti hanno difficoltà di trasmissione e sono quindi selezionati negativamente Mantenimento di morbilità e mortalità elevata a lungo termine solo se questo non incide negativamente sulla possibilità di trasmissione Persistenza e lungo periodo di incubazione (es. HIV) Esistenza di una specie animale serbatoio (es. Ebola) L identificazione dei determinanti di virulenza è un passo essenziale nello sviluppo dei vaccini

3 DIVERSE FASI DELLA PATOGENESI Ingresso Impianto e disseminazione locale Diffusione agli organi bersaglio Eliminazione e trasmissione

4 1) FASE DI INGRESSO

5 Vie di ingresso e di diffusione delle infezioni virali

6 Vie di ingresso delle infezioni virali CUTE Strato corneo protettivo (cellule morte) Possibilità di ingresso per: Trauma Punture di artropodi (es. Toscana virus, TBE) Morsi di animali (es. v. rabbia, Hantavirus, Ebola) Inoculazione parenterale (es. chirurgia, dentista, droghe endovena, tatuaggi, piercing) (es. HBV, HCV, HIV, CMV) Scarsa importanza come via di uscita e diffusione (VZV)

7 Vie di ingresso delle infezioni virali VIE RESPIRATORIE Difese specifiche (immunità mucosale) e non (epitelio ciliato, muco) Una delle principali via di trasmissione nei paesi industrializzati Inalazione di aerosol (<1 µm diametro) contenenti virus Virus che si moltiplicano solo nel tratto respiratorio ( virus respiratori ) causando raffreddore, faringite, bronchiolite, polmonite Altri virus possono causare infezione sistemica Grande importanza come via di uscita e diffusione

8 Virus che entrano attraverso il tratto respiratorio

9 Vie di ingresso delle infezioni virali VIA ALIMENTARE Difese specifiche (immunità mucosale) e non (HCl, sali biliari) Via di ingresso importante nei paesi in via di sviluppo Moltiplicazione nelle cellule epiteliali dell intestino tenue ed eliminazione attraverso le feci Infezione sintomatica o asintomatica Buona resistenza in ambiente extracorporeo Possibilità di epidemie attraverso il circuito oro-fecale (es. HAV)

10 Virus entrano attraverso il tratto alimentare

11 Vie di ingresso delle infezioni virali TRATTO GENITALE Difese specifiche (mucosa vaginale) e non (muco) Infezioni localizzate (HSV, HPV) o sistemiche (HIV, HTLV, HBV) Rilascio attraverso le urine Alcuni virus umani (es. CMV, v. rosolia, v. morbillo) ma ruolo epidemiologico non importante Alcuni virus animali che possono poi essere trasmessi all uomo (es. Arenavirus e Hantavirus nei roditori)

12 Vie di ingresso delle infezioni virali CONGIUNTIVA Sito relativamente esposto e poco protetto Infezioni da parte di HSV, Adenovirus, Enterovirus In alcuni casi l infezione della congiuntiva deriva dalla diffusione di virus per via ematica (es. v. morbillo, EBV)

13 Trasmissione verticale Infezione delle cellule germinali Infezione transplacentare (inf. intrauterina, congenita ) (es. CMV, virus della rosolia, HIV, HBV) Infezione alla nascita (inf. neonatale ) (es. HSV, HIV, HBV) Infezioni tramite allattamento (inf. perinatale ) (es. HIV, CMV, HBV)

14 2) Impianto e moltiplicazione nel sito di ingresso

15 Impianto e moltiplicazione nel sito di ingresso Dipende da: Dose infettante Infettività del virus Virulenza Diffusione Malattia

16 3) disseminazione

17 Disseminazione locale Diffusione alle cellule adiacenti Via extracellulare (rilascio virioni e attacco su membrana cellulare di altri elementi; es. adenovirus) Via intracellulare (fusione, situazione protetta; es. Herpesvirus, Paramyxovirus) Diffusione mediante cellule che migrano localmente (linfociti, macrofagi)

18 Diffusione del virus in una infezione localizzata

19 Permanenza in sede locale Sito di ingresso coincide con organo bersaglio (es. Rhinovirus, v. influenza, v. parainfluenza nel tratto respiratorio; Rotavirus nel tratto gastroenterico; HPV su epidermide)

20 Diffusione sistemica Sangue (es. v. morbillo, Poliovius) Linfatici afferenti tessuto linfatico linfatici efferenti circolazione del sangue (VIREMIA) fuoriuscita in organi bersaglio per: Attraversamento di gap tra cellule e a livello tissutale Replicazione in cellule endoteliali Trasporto attraverso i linfociti Nervi (es. HSV, v. rabbia) Via al riparo da anticorpi

21 Diffusione sistemica attraverso il circolo sanguigno

22 Diffusione sistemica attraverso il sistema nervoso

23 Moltiplicazione negli organi bersaglio Bersaglio viene generalmente raggiunto tardivamente Necessita di passare dal sito di ingresso all organo bersaglio Difese immunitarie vengono spesso attivate durante le fasi precedenti la moltiplicazione nell organo bersaglio (IFN, infiammazione, risposta immune) Sede delle manifestazioni cliniche Organo-specifiche Sintomi sistemici (linfochine, mediatori infiammzione) Sovrapposizione di infezioni batteriche a causa dell azione immunosoppressiva esercitata dal virus

24 Il feto: un bersaglio particolare Difese immunitarie e risposta mediata dall IFN immature Barriera placentare impedisce in parte il passaggio di specifici anticorpi materni Grande vulnerabilità degli organi in formazione (spec. I trimestre) Suscettibilità all infezione condizionata dallo stato indifferenziato delle cellule fetali e dai cambiamenti ormonali nella madre Passaggio da placenta a circolazione fetale e organi bersaglio Soprattutto CMV e virus della rosolia (molti altri virus occasionalmente)

25 Tropismo Affinità per specifici tessuti e tipi cellulari Barriere fisiche Temperatura (es. Rhinovirus nelle vie respiratorie superiori) ph (es. Enterovirus resistenti al passaggio in ambiente acido) Recettori di membrana Fattori trascrizionali cellulo/tessuto specifici

26 5) rilascio

27 Rilascio Soprattutto vie respiratoria e tratto alimentare Sangue (es. HIV, HBV, HCV, HTLV) Latte materno (es. HIV, HBV, CMV) Tratto genitale (es. HIV, HBV, HSV, HPV) Alcuni virus hanno vie di rilascio multiple (es. HIV, CMV)

28 Infezione e malattia Requisiti Superamento delle barriere fisiche Superamento delle difese aspecifiche e specifiche dell ospite Diffusione agli organi bersaglio Moltiplicazione in quantità sufficiente per danneggiare l organo Citopatologia diretta (morte cellulare) Induzione di rilascio di fattori tossici Innesco di reazioni immunopatologiche

29 Risposta immunitaria all infezione virale

30 Immunità innata nei confronti dell infezione virale: Toll-like Receptors (TLR) e Retinoic Inducible GeneI (RIG-I)-RNA Helicase (PRR Pattern Recognition Receptors) TIR: Toll Interleukin1 Receptor RIG I DExD/Hbox RNA Helicase 925AA Nterm: CARD: Caspase Recruitment Domain Cterm: Helicase domain DD: Death Domain

31 Recettori Toll-Like Scoperti in Drosofila melanogaster come fattori coinvolti nella morfogenenesi e successivamente riconosciuti come proteine transmembrana deputate al riconoscimento di antigeni batterici o fungini Scoperti 10 omologhi Umani (TLR 1-10) in grado di riconoscere diversi antigeni o acidi nucleici virali e batterici e indurre risposta infiammatoria delle cellule effettrici (IFNα/β/γ, IL-6, IL-8) Ubiquitari in macrofagi, neutrofili, Cellule NK, a livello della membrana citoplasmatica e del sistema vescicoloendosomale (localizzazione extra/intra cellulare) Attivi come omo/etero dimeri, necessaria l interazione per attivare la cascata di trasduzione del segnale

32 Toll-like receptors: dimerizzazione e attivazione della cascata di trasduzione del segnale Interazioni tra TLR e le diverse classi di virus Alcuni recettori (TLR2-4) sono localizzati sulla membrana citoplasmaticae riconoscono proteine virali, altri (TLR 9-7/8-3) sono localizzati a livello del sistema vescicolo endosomale e riconosco gli acidi nucleici.

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34 TLR Riconoscimento di sequenze nucleotidiche in compartimenti intracitoplasmatici

35 RIG like Receptors: Riconoscimento di ssrna e dsrna citoplasmatici

36 The virus fights back When APOBEC (red) is expressed in the PRODUCER CELL, it is incorporated into the budding virion together with other components of the virus, including its genomic RNA. HIV- 1 Vif (green) can reduce or eliminate APOBEC3G incorporation into budding virions by targeting it for proteasomal degradation.

37 The mechanism of Vif-dependent APOBEC3G degradation Vif binds APOBEC3G and forms a complex that recruits the cellular proteins elongin B and elongin C (B and C in the figure), which then mediate cullin-5 (CUL5) ring-box-1 (RBX1)- dependent ligation of ubiquitin (Ub) to APOBEC3G. The E2 ubiquitin-conjugating enzyme receives its ubiquitin from an E1 enzyme. Ubiquitylated APOBEC3G is subsequently degraded by the proteasome.

38 IL RUOLO DELL INTERFERONE

39 INTERFERENZA VIRALE Cellule infettate da virus non possono essere ulteriormente infettate da ceppi omologhi (1935), né da ceppi virali antigenicamente diversi (1937) Il fattore che determina resistenza alla superinfezione (INTERFERENZA) è un fattore proteico solubile rilasciato nel mezzo di coltura (INTERFERONE) (1957)

40 INTERFERONI UMANI IFN α E β: prodotti da quasi tutti i tipi di cellule infette IFN γ: prodotto solo in SPECIFICI linfociti attivati

41 Tre tipi di IFN: IFN-alfa (detto anche IFN leucocitario) IFN-beta (IFN dei fibroblasti) IFN-gamma (anche noto come IFN immune) IFN-alfa e IFN-beta sono anche detti IFN di Tipo I, mentre IFN-gamma è detto IFN di tipo II Ci sono 20 sottotipi di IFN-alfa, ma solo 1 sottotipo di IFN-beta e di IFN-gamma. Gli IFN hanno caratteristiche differenti che possono essere utilizzate per distinguerli (ad es. stabilità al ph ).

42 INTERFERONI (IFN) α e β Induzione rapida, transiente e poco specifica INDOTTI da : dsrna endotossine proteine virali inibitori trascrizione e traduzione Non richiedono replicazione virale Agiscono solo su cellule che esprimono recettori specifici Non possiedono attività antivirale diretta La loro azione antivirale non è specifica per il virus inducente Sono dotati di specie/specificità Inducono uno STATO ANTIVIRALE preventivo in grado di inibire la replicazione di virus che potrebbero penetrare nella cellula

43 INDUZIONE DELLO STATO ANTIVIRALE

44 INDUZIONE DELLO STATO ANTIVIRALE Gli enzimi indotti da IFN si attivano solo in presenza di una infezione virale, preservando quindi le cellule NON infette da traumi non necessari

45 MECCANISMI DI INDUZIONE DI IFN NF-kB è un fattore di trascrizione; legato a IkB è inattivo e si trova nel citoplasma L RNA a doppio filamento attiva PKR (proteina Kinasi RNA dip) PKR fosforila IkB e determina il rilascio del fattore NF-kB. NF-kB entra nel nucleo e attiva la trascrizione di geni che codificano IFN, coinvolti nella risposta antivirale.

46 REGOLAZIONE GENICA INDOTTA DA IFN Jak=Janus Kinasi STAT= Signal Transducer of Activation of Trancription ISRE= Interferon Stimulated Responsive Element GAS= Gamma (Interferon) Activation Sequence

47 IL Pathway dell IFN

48 ATTIVAZIONE RAPIDA di IFN di tipo I Un solo minuto di contatto fra IFN di tipo I e recettore è sufficiente per indurre l attivazione, che si completa in 30 minuti con la produzione di mrna per le proteine effettrici Il massimo di protezione viene raggiunto dopo 3-5 ore L attivazione da IFN II richiede tempi più lunghi

49 EFFETTI DELL IFN SULL ORGANISMO STATO ANTIVIRALE: Indotto mediante la trascrizione di più di 100 geni: PKR : blocco della sintesi proteica 2-5 Oligo A Sintetasi: produzione di 2-5 oligoa Attivazione di RNAsi L : degradazione degli RNA virali e cellulari Sintesi di proteine: ADAR: RNA specific adenosina deaminasi Proteine proapoptotiche: agiscono sulla cellula infetta e su quelle limitrofe (effetto cauterizzante, limita la diffusione del virus) MxA: GTPasi che inibisce la replicazione virale Proteine che esercitano un controllo negativo sul ciclo cellulare MHCI e MHCII

50 Inibizione sintesi proteica tramite PKR ds RNA

51 Degradazione degli mrna mediata da RNAsi L

52 STATO ANTIVIRALE: Riepilogo

53 FUNZIONI IMMUNOMODULATORIE DI IFN γ Attiva l espressione di MHC di classe I e II Aumenta l attività del proteasoma e quindi l efficienza di presentazione dell antigene Attiva i macrofagi inducendo NADPH ossidasi e NO sintetasi Aumenta la citotossicità delle cellule NK aumentando la sintesi di perforine Regola lo sviluppo e la maturazione dei linfociti B Stimola la divisione delle cellulet di memoria

54 FUNZIONI DI IFN gamma

55 TRATTAMENTO CON INTERFERON Terapia antivirale: virus dell Epatite B, C e D, Papillomavirus genitali e cutanei Produzione a livello industriale: da cellule in coltura indotte con vari trattamenti alla produzione di IFN da batteri trasformati con vettori d epressione plasmidica contenenti il gene per IFN Effetti globali: blocco della sintesi proteica e della proliferazione cellulare attivazione delle cellule NK e dei macrofagi induzione di geni deleteri Conseguenze fisiologiche: febbre, nausea e malessere

56 SOMMARIO

57 MECCANISMI DI EVASIONE IMMUNE come i virus bloccano l azione dell interferone Inibizione della produzione di Interferone: sintesi di proteine virali che legano l RNAds minimizzando l induzione di IFN (NS1 del virus influenzale e E3L del Vaccinia Virus) Inibizione della trasduzione del segnale indotta da IFN: Sintesi di proteine virali omologhe al recettore solubile per IFN, proteine virali che legano, inattivandole, le proteine Jak e STAT (poxvirus, Paramyxo e HCMV) Inibizione degli enzimi antivirali indotti da IFN Proteine virali che legano dsrna sottraendolo a PKR o a OligoA Sintetasi Proteine che inibiscono PKR direttamente (E2 di HCV e K3L di Vaccinia Virus); Attivazione di fosfatasi che defosforilano, riattivandola, eif2 (gamma 34.5 di HSV) Piccoli dsrna virali che inibiscono PKR in maniera competitiva (VAI di Adenovirus, EBER di EBV)

58 EVASIONE DELLA RISPOSTA IMMUNITARIA

59 EVASIONE DELLA RISPOSTA IMMUNITARIA

60 EVASIONE DELLA RISPOSTA IMMUNITARIA ds RNA

61 VIRUS DELL EPATITE C NS5A ed E2: interagiscono con PKR inattivandolo identificata una regione di 40AA in NS5A correlata alla resistenza a IFN (ISDR IFN Sensitivity determinant region) NS5A: blocca il signalling a valle di Jak/Stat NS34A: proteasi che taglia CARDIF e TRIF interferendo con il signalling di RIG

62 POXVIRUS A46R : Contiene TIR domains e compete con i TIR adaptors nel signalling dipendente da TLR B8R, B18R: recettori solubili per IFNγ, ne prevengono il legame con il recettore cellulare E3L:dsRNA binding protein; Blocca PKR, OAS e inibisce ADAR; blocca il pathway TLR e RIG VH1 Phosphatase: defosforilando alcuni componenti del pathway Jak/Stat ne bloccano l attività K3L:omologo di eif2α; potenzia la traduzione nelle cellule infette neutralizzando l azione di PKR

63 HERPES SIMPLEX VIRUS IFN alfa può essere indotto in colture cellulari coltivate in presenza di gd ICP0: interagisce con il proteasoma alterando la stabilità di specifiche proteine indotte da IFN Blocca Jak/Stat signalling Downregola il livello di alcuni geni indotti da IFN ICP34.5 defosforila eif2α reclutando la Proteina Phosphatase 1 α (PP1 α) US11: in mutanti deleti di ICP34.5 è un inibitore di PKR 2 5 Adenosina derivati bloccano OAS e RNAsi L

64 Immunità innata scatenata dal virus dell influenza

65 INFLUENZA NS1 Virus deleti in NS1 particolarmente sensibili a IFN Sono virus molto attenuati in sistemi IFN competenti Assenza di NS1 è correlata ad un forte aumento dell espressione genica di prodotti indotti da IFN NS1: attiva p58, che inibisce PKR Limita la produzione di IFN: Lega dsrna (inibizione pretrascrizionale) Inibisce RIG, PKR, OAS e RNAsiL

66 Proteina NS1del virus dell influenza FUNZIONI Regolazione temporale della sintesi di RNA Controllo dello splicing dell mrna Aumento della traduzione di mrna virale Regolazione della morfogenesi delle particelle virali Soppressione delle risposte immuni dell ospite

67 Proteina NS1del virus dell influenza Limita l induzione di IFN Limita lo stato antivirale Blocca la maturazione di mrna cellulare ( e quindi anche di IFN) Rafforza la traduzione di mrna virale

68 MECCANISMI di evasione della risposta immunitaria

69 MECCANISMI di evasione della risposta immunitaria

70 DISCOVERY of TETHERIN AS INNATE CELLULAR FACTOR IN RESTRICTING HIV-1 PARTICLE RELEASE It is constitutively expressed in Vpudependent HeLa cells but not in Vpuindependent 293T or HT1080 cells; its expression is enhanced by INF-α treatment. HeLa Vpu counteracts tetherin leading to HIV-1 Vpudeficient virus particle release. In cells where HIV-1 virions release requires Vpu, depletion via sirna of tetherin abolishes this requirement. (Neil et al., 2008)

71 HUMAN TETHERIN BST-2 or CD317 or HM1.24 antigen 180 aa, MW kda It regulates the growth of B cells It is expressed on bone marrow stromal cells, on terminally differentiated B cells and in neoplastic B cells (multiple myeloma). Type II transmembrane glycoprotein: - N-terminus cytoplasmic tail - TM portion - extracellular coiled-coil domain - C-terminal GPI anchor Dimer (Perez-Caballero et al., 2009) N-Glycosylation Localization (Perez-Caballero et al., 2009) (Andrew et al., 2009) (Neil et al., 2008) (Ohtomo et al., 1999)

72 TETHERIN MECHANISM OF VIRUS RETENTION (Hammonds and Spearman, 2009) (Perez-Caballero et al., 2009)

73 Immunità umorale all infezione virale Infezione primaria Vaccinazione Infezione secondaria Vaccinazione (richiamo) IgG IgM

74 Meccanismi di difesa specifici: risposta umorale Gli anticorpi specifici prodotti durante una replicazione virale intervengono durante il recupero in una malattia e nella resistenza ad un contatto successivo con il virus. Effetti positivi degli anticorpi -Possono direttamente neutralizzare l infettività del virus prevenendo l attacco del virus ai recettori sulla cellula ospite o l entrata del virus nella cellula. -Possono anche prevenire l uncoating del virus. -Gli anticorpi possono agire come opsonine e aumentare la fagocitosi dei virus. -Gli anticorpi possono ricoprire una cellula infettata che viene così uccisa dalle NK, contribuendo a prevenire la diffusione dell infezione.

75 Meccanismi di difesa specifici: risposta umorale L immunità mediata da anticorpi tende in generale a neutralizzare i virioni Per molti virus si ha neutralizzazione anticorpale vaccini preventivi molto potenti (antipoliomielite, antirosolia, antimorbillo, antivaioloso, antiparotite, anti febbre gialla, ecc) Gli anticorpi di classe IgG e IgM sono rilevanti per la difesa contro le infezioni virali accompagnate da viremia Gli anticorpi tessutali IgA sono importanti per le infezioni contratte attraverso le mucose

76 Effetti negativi degli anticorpi La fissazione del complemento da parte del complesso immune può provocare un rilascio di amine vasoattive, con richiamo di cellule infiammatorie e un conseguente danno ai tessuti dell ospite (danni immunopatologici) Alcuni es: virus del morbillo, virus respiratorio sinciziale, virus dengue L opsonizzazione dei virus con gli anticorpi può aumentare il loro uptake da parte di cellule fagocitarie Se il virus è in grado di sopravvivere nei fagociti questi possono permette la diffusione del virus Importanti es: Virus Dengue e HIV sono virus che possono sopravvivere nei macrofagi

77 Evasione dalla risposta immunitaria umorale Inibizione dell immunità umorale antivirale (CMV: recettore FC, HSV: recettori solubili del complemento, poxvirus: fattori inibenti la cascata di attivazione del complemento) Interferenza con la presentazione dell antigene virale sulla molecola di MHC(HSV-1,HCMV,EBV,HIV)

78 Immunità cellulare attiva nei confronti delle cellule infettate da virus

79 Componenti cellulari coinvolte nella difesa antivirale Grande importanza riveste l immunitàcellulo-mediata nelle malattie virali nel circoscrivere i focolai di infezione rappresentate dalle cellule infette. Risposta non specifica: Macrofagi e cellule dendritiche Rappresentano una delle prime cellule che i virus incontrano e contribuiscono in differenti modi all attività antivirale: -Attività antivirale intrinseca -Attività antivirale estrinseca -citotossicità cellulo-mediata anticorpo dipendente (ADCC) -Produzione di IFN Cellule NK Possono uccidere cellule infettate da differenti virus limitando il diffondersi dell infezione. Mediano anche l ADCC

80 Componenti cellulari coinvolte nella difesa antivirale Risposta specifica Cellule T Cellule T citotossiche (CTL) sono generate in risposta agli antigeni virali presenti sulle cellule infette e sono in grado di uccidere queste cellule. Cellule T helper sono coinvolte nella generazione dei CTL e collaborano con i linfociti B nella preparazione degli anticorpi. La reazione di citotossicità rappresenta il principale meccanismo antivirale dell immunità mediata da cellule esercitata specificatamente dai CTL sensibilizzati ma che può essere mediata da altre cellule (macrofagi, granulociti, linfociti CD4-e CD8-)

81 La risposta immunitaria all infezione virale Immunità innata Immunità adattativa Titolo virale CTL Attività anticorpale Attività relativa PMN TNF-α IL12 IFN-α/β NK Giorni p.i.

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83 Evasione delle difese immunitarie antivirali dell ospite Un efficiente moltiplicazione all interno della cellula ospite è una necessità fondamentale per i virus prima che la loro riproduzione venga bloccata dalla risposta immunitaria Moltissimi virus hanno sviluppato dei meccanismi in grado di modulare le difese del sistema immunitario dell ospite: Meccanismi di evasione della risposta innata Quiescienza o latenza, permanenza in stato provirale (HPV, HSV, HIV) Inibizione dell immunità umorale antivirale (CMV: recettore FC, HSV: recettori solubili del complemento, poxvirus: fattori inibenti la cascata di attivazione del complemento) Interferenza con la presentazione dell antigene virale sulla molecola di MHC (HSV-1,HCMV,EBV,HIV) Produzione di citochine e recettori solubili per citochine (EBV:simil IL- 10 -> diminuzione produzioneifnγ, Poxvirus: recettori solubili per TNF-α,- β,ifnγ) Regolazione dell apoptosi (Adenovirus e EBV: omologhi bcl-2) Regolazione dello stress ossidativo (Virus del mollusco contagioso, HIV) MicroRNA (HSV, SV40, EBV, HIV-1..)

84 Una nuova strategia virale di evasione immune : RNA interference mediato da MicroRNA I microrna sono piccoli RNA di circa 23bp non codificanti espressi da tutti i mammiferi. Tali sequenze risultano complementari a porzioni di numerosi mrna espressi dalle cellule. Hanno un ruolo importante nel controllo post-trascrizionale dell espressione genica, legandosi per complementarietà a specifici mrna espressi dalla cellula Causano il blocco della traduzione o la degradazione dei messaggeri Alcuni virus producono mirna per modulare l espressione delle proteine virali o inibire specifiche proteine cellulari (HSV- 1,EBV, SV40, HIV-1)

85 Immunopatogenesi delle infezioni virali Molti meccanismi immunologici per riconoscere ed eliminare virus Risposta immune può diventare nociva soprattutto se il virus persiste Ipersensibilizzazione agli Ag virali Sindrome da immunocomplessi (es. HBV, EBV, B19) Danni da immunità cellulo-mediata (es. HSV, VZV, HBV, v. influenza)

86 Patogenesi a livello cellulare Virus e cellula competono per lo stesso apparato di sintesi delle macromolecole Equilibrio evolutivo fra la necessità di riprodurre i componenti virali e la necessità di mantenere efficiente l apparato biosintetico cellulare Meccanismi vari per assumere il controllo dell apparato biosintetico a favore della sintesi dei componenti virali Danneggiamento della cellula come effetto collaterale

87 Interazione virus-cellula Cellula sensibile: presenta recettori per quel virus Cellula permissiva: supporta la replicazione di quel virus virus Cellula sensibile Cellula permissiva Cellula non permissiva Infezione produttiva Infezione restrittiva Infezione non produttiva (abortiva)

88 Interazione virus-cellula: esito dell infezione Infezione citocida Effetti morfologici (CPE), sulla fisiologia cellulare (messaggeri secondari, flussi ioni), sulla biochimica cellulare (attività trascrizionale, interazioni proteina-proteina), effetti genotossici (rottura, frammentazione e riarrangiamanto del DNA cellulare), effetti biologici (alterazioni antigeniche) Infezione persistente Latente (espressione parziale del genoma virale) Cronica (produttiva ma intermittente o limitata a poche cellule) Lenta (lungo periodo di incubazione, ingravescente) Trasformazione Introduzione di geni trasformanti virali Attivazione di geni trasformanti cellulari (oncogeni)

89 Infezione citocida: effetto citopatico (CPE) Human embryo skin muscle cells were infected with human cytomegalovirus and stained at selected times to demonstrate (A) uninfected cells, (B) late virus cytopathic effects (nuclear inclusions, cell enlargement), (C) cell degeneration, and (D) a focus of infected cells in a cell monolayer (i.e., a plaque),

90 Infezione citocida: effetto citopatico (CPE) Alterazioni del citoscheletro e cambiamento morfologia (es. arrotondamento) Inclusioni nucleari o citoplasmatiche (addensamento di componenti virali anche associati a microfilamenti cellulari e microtubuli) Formazione di sincizi (cellule giganti multinucleate generate da passaggio virus diretto da cellula a cellula)

91 Alterazioni del citoscheletro Normal cells have networks of microtubules, and intermediate filaments throughout the cytoplasm. Infection with reovirus causes a perinuclear aggregation of microtubules, and infection with cytomegalovirus causes a modification of intermediate filaments proteins, including their relocation into the nuclear and cytoplasmic inclusion bodies.

92 Es. HSV, HIV, v. morbillo Formazione di sincizi

93 Correlazione fra cambiamenti morfologici e effetti sulla fisiologia e biochimica cellulare A. formation of secondary messengers, Ca2+ influx, activation of protein kinases and cellular transcription factors; B. transcriptional activation of cellular genes, increased camp and cgmp levels, arrest of cell cycle progression; C. overexpression of cytokines, inhibition of cellular DNA synthesis. Cascata di eventi innescati dall interazione fra recettore cellulare e antirecettore virale

94 Regolazione dell espressione del genoma virale e cellulare in seguito a infezione I processi di regolazione della replica virale sono del tutto analoghi a quelli della regolazione dell espressione dei geni cellulari Fattori di trascrizione Promotori Enhancer Fosforilazione Defosforilazione Dissociazione Dimerizzazione

95 Regolazione dell espressione del genoma virale e cellulare in seguito a infezione Il virus può esprimere fattori di regolazione propri ma deve anche sfruttare i fattori di trascrizione cellulare i quali riconoscono zone di regolazione sul genoma virale simili alle sequenze di regolazione sul genoma cellulare (es. Sp1, NFkB, AP-1) Interazione fra proteine virali ( early ) e cellulari (es. E6 e E7 di HPV, IE di HSV con proteina Rb) Interazione fra proteine virali e sequenze cellulari di regolazione (es. tax di HTLV e promotore IL-2 e IL2-R)

96 Alterazioni cromosomiche in seguito a infezione Causate da riarrangiamenti durante la replica del genoma virale e da interferenze con i meccanismi di manutenzione del DNA cellulare Spesso letali, altrimenti instabilità genetica e espressione alterata di geni cellulari, possibilità di accumulo mutazioni e immortalizzazione Chromosomal aberrations resulting from cytomegalovirus infection of human peripheral blood lymphocytes.

97 Infezione persistente Mancata eliminazione del virus dopo l infezione primaria e permanenza a tempo indefinito Spesso coinvolti stadi di infezione silente e produttiva Tre tipologie non mutualmente esclusive Latente Cronica Lenta Modulazione dell espressione del genoma virale e cellulare Possibilità di riattivazione della replica virale Possibilità di trasformazione Grande difficoltà nel controllo e nella terapia (es. AIDS, epatite cronica, PML, SSPE)

98 Infezione persistente - tipologie Acute infection Influenza Hepatitis A Latent infection Herpes simplex Varicella-zoster Virus Chronic infection Hepatitis B HIV Slow infection HIV unconventional agents Early disease Months or years Late disease

99 Fattori implicati nelle infezioni persistenti Modulazione della risposta immunitaria (evasione) Riconoscimento limitato Ridotta espressione Ag virali (es. HIV, SSPE) Modulazione Ag Ab-dipendente (es. SSPE) Variazione antigenica (HIV, HCV) Ab bloccanti che prevengono neutralizzazione (es. SSPE) Diminuita espressione MHC (CMV, HSV, Adenovirus) Diminuita espressione molecole adesione (es. EBV, CMV) Alterazione attività linfociti / monociti (citochine) Localizzazione in siti privilegiati (es. HSV, VZV in CNS) Modulazione dell espressione del genoma virale Proteine virali associate a letenza (es. EBV EBNAs) Trascritti virali associati a letenza (es. HSV LATs)

100 Latenza e riattivazione Infezione LATENTE Altre infezioni (varie infezioni in paziente HIV+) Trauma (es. HSV dopo chirurgia ganglio trigemino) Cambiamenti fisici / fisiologici (es. temperatura, UV, cambi ormonali) Immunosoppressione (chemioterapia antiblastica, trapianti, AIDS) RIATTIVAZIONE

101 Infezioni persistenti sistema immunitario Molti virus infettano le cellule del sistema immunitario durante l infezione acuta, alcuni persistono Virus Sede latenza Genoma Meccanismo Patologia HIV Cellule T CD4+ macrofagi integrato Restrizione replica, variazione Ag AIDS EBV Cellule B episomico sintesi fattori cellulari (ICAM-1, LFA-3) e virali Linfomi, pat. EBV in HIV+ CMV Linfomonociti e altre cellule episomico sintesi fattori cellulari (HLA, FcR) e virali Infez. cong. Disordini CNS, retinite, polmonite HHV-6 Cellule T CD4+ episomico sintesi fattori cellulari e virali VI malattia, disordini linfoproliferativi HTLV Cellule T integrato sintesi fattori cellulari e virali Leucemie, disordini neurol.

102 Infezioni persistenti sistema nervoso Diverse malattie croniche degenerative del sistema nervoso sono correlate a infezioni virali persistenti Virus Sede latenza Genoma Meccanismo Patologia HSV Neuroni gangli sensoriali episomico Restrizione espressione (LATs di antisenso) Lesioni mucose, cheratite, encefalite VZV Neuroni gangli spinali episomico Restrizione espressione (LATs di senso) Zoster JCV oligodendrociti Integrato /? PML episomico Morbillo Neuroni episomico Restrizione espressione (spec. proteina M) SSPE (prioni)? (cr. 20)? CJD, GSS, kuru

103 Infezione primaria e riattivazione da HSV / VZV (A) Establishment of herpes simplex virus or varicella-zoster virus latency in ganglia after primary infection of skin or mucosa. (B) Reactivation of virus in ganglion and spread through nerves to skin or mucosa to cause surface lesions or retrograde spread through nerves to central nervous system to cause encephalitis (infrequent).

104 Infezioni persistenti altri distretti Virus Sede latenza Genoma Meccanismo Patologia HBV Epatociti, cell. pancreatiche Integrato / episomico Restrizione espressione Epatite cronica, cirrosi, HCC HCV Epatociti?? Epatite cronica, cirrosi, HCC ADV Linfociti adenoidi? Integrato / episomico sintesi fattori cellulari (HLA) e virali (IE3)? Parvo Precursori eritroidi episomico? Anemia emolitica cronica, artrite HPV Cellule epiteliali germinali episomico Restrizione espressione mediante fattori cellulari (p53) e virali (E1) Verruche, papillomi, carcinomi

105 Controllo delle infezioni virali persistenti Successo finora maggiore con antivirali che con metodi immunomodulanti Potenziamento della risposta immune ( vaccinazione terapeutica ) (es. sperimentali HSV, HIV) Interferone (es. HCV, HBV, HPV) Antivirali (es. HIV, HCV, HBV, HSV, CMV)

106 Trasformazione cellulare La trasformazione neoplastica è un processo multifattoriale e multifasico causata da più eventi genetici sopravvenienti, che si accumulano nel DNA cellulare e che, alla fine, determinano la perdita del controllo fisiologico della replicazione cellulare

107 La cellula trasformata possiede due caratteristiche principali: Capacità di moltiplicarsi illimitatamente in coltura (immortalizzazione) Causare tumore in animale da esperimento singenico o immunodepresso

108 La proliferazione cellulare è normalmente controllata da fattori inducenti o inibenti denominati rispettivamente: Oncogeni Promuovono la proliferazione, sopravvivenza, crescita e differenziamento cellulare (es. fattori di crescita, recettori per fattori di crescita, messaggeri secondari, fattori di trascrizione, inibitori dell apoptosi) Geni oncosoppressori Controllano negativamente la proliferazione cellulare (es. p53 e Rb) promuovendo in molti casi l apoptosi

109 Le proteine virali devono promuovere uno stato proliferativo della cellula per permettere la sintesi degli acidi nucleici e la replicazione virali Per fare ciò utilizzano diverse strategie: Disregolazione ciclo cellulare Inibizione apoptosi cellulare Interferenza con risposta immunitaria In questo modo un virus può inavvertitamente iniziare il processo di trasformazione cellulare

110 Trasformazione cellulare virus-mediata Introduzione di alterazioni genetiche che comportano cambiamenti nella regolazione della crescita e immortalizzazione La trasformazione in vitro è il corrispettivo della formazione di tumori in vivo Alterazioni di crescita (es. no inibizione da contatto, ridotto fabbisogno di siero, crescita in agar, crescita su più strati) Alterazioni di superficie (es. cambi Ag, secrezione proteasi, giunzioni meno strette, cambiamenti tintoriali) Alterazioni intracellulari (cambiamenti citoscheletro, variazioni messaggeri)

111 Oncogeni e trasformazione Gli oncogeni sono geni cellulari essenziali implicati nei meccanismi di regolazione della crescita e del differenziamento La trasformazione è il risultato di una serie di alterazioni a carico di oncogeni cellulari il cui effetto ultimo è la perdita del normale controllo della divisione cellulare (processo MULTISTEP) Fattori responsabili dell alterazione degli oncogeni: Fisici (es. UV) Chimici (es. nitrosammine) Biologici (es. virus)

112 Attività dei prodotti degli oncogeni cellulari

113 Anti-Oncogenes Rb Gene Retinoblastoma Adenovirus E1A Rb protein Rb 105kD Rb Rb Stops replication Cell cycle continues

114 Anti-Oncogenes p53 P53 gene SV40 T HPV E6 P53 P53 P53 proteolysis P53 DNA Stops replication replication replication

115 Virus, oncogeni e trasformazione Possibilità di trasformazione rapida grazie all attività polifunzionale di alcuni loro geni ( oncogeni virali) (es. retrovirus con oncogene) Alterata espressione di oncogeni cellulari Inattivazione di proteine ad attività anti-oncogena Virus HSV EBV HHV-8 HPV HBV HCV HTLV Cancro Carcinoma cervice uterina Linfomi, carcinoma nasofaringeo Sarcoma di Kaposi Carcinoma cervice uterina Carcinoma epatocellulare Carcinoma epatocellulare Leucemia T