Proteine coinvolte nei meccanismi di trasduzione del segnale

Transcript

1 Proteine coinvolte nei meccanismi di trasduzione del segnale Le proteine ras sono state identificate per la prima volta come prodotti di oncogeni virali; in alcuni tumori (quali ad esempio i carcinomi del colon, del pancreas e della tiroide) l incidenza di mutazioini del gene ras è molto elevata; la mutazione del gene ras rappresenta la seconda più frequente anomalia di oncogeni dominanti riscontrata del tumori umani.le proteine ras sono localizzate sul versante citoplasmatico della membrana plasmatica e passano continuamente da uno stato attivo, che trasmette il segnale, ad uno stato inattivo; nello stato inattivo le proteine ras legano il guanosin difosfato (GDP), quando le cellule vengono stimolate dai fattori di crescita o da altre interazioni ligando-recettore, il ras viene attivato scambiando GDP con GTP e il ras attivato innesca a sua volta la cascata delle MAP (Mitosis Activating Protein) chinasi reclutando la proteina citosolica raf-1; le MAP-chinasi così attivate agiscono su specifici fattori di trascrizioni nucleari e, pertanto, promuovono la proliferazione. Il ciclo rodinato della proteina ras dipende da due reazioni: Lo scambio di nucleotide (GDP con GTP) che attiva la proteina ras. L idrolisi del GTP, che converte il ras attivo legato al GTP, nella foma inattiva legata la GDP. La rimozione del GDP e la sua sostituzione con GTP durante il processo di attivazione del ras sono catalizzati da una famiglia di proteine che inducono il rilascio di nucleotidi guanilinici; tali proteine vengono reclutate sul versante citoplasmatico della forma attiva dei recettori dei fattori di crescita mediante proteine adattatrici. Queste proteine sono molto diffuse e si legano al ras attivo aumenatndone più di volte l attività GTPasica; questo processo produce la rapida idrolisi del GTP a GDP e interrompe il processo di trasduzione del segnale. La risposta a questa funzione frenante delle GAP sembra mancare quando il gene ras è effetto da mutazioni; le proteine ras mutate si legano alle GAP, ma la loro attività GTPasica non è aumentata, le proteine mutate rimangono quindi imprigionate nel loro stato eccitato, legate al GTP e provocano una patologica attivazione del segnale mitogeno. Nella leucemia mieloide cronica e in alcune forme di leucemia linfoblastica acuta l attività tirosi-chinasica del prot-oncogen c-abl viene atitvata in seguito alla traslocazione del gene c-abl dal cromosoma 9 dove è normalmente localizzato, al cromosoma 22, dove si fonde con una parte del gene bcr (break-point cluster region); il gene ibrido che deriva da questa fusione ha una potente attività tirosin-chinasica. Vi sono dati che provocano che il gene abl non sia coinvolto solo nei meccanismi che regolano la proliferazione, ma anche in quelli che regolano la morte cellulare. Vedi figura sotto riportata. 1

2 Modello di attivazione del gene ras. Quando una cellula normale è stimolata dalla attivazione di un recettore per un fattore di crescita, la forma inattiva ( legata al GDP) del ras viene attivata, passando ad uno stato a cui si lega al GTP. Il ras attivato recluta raf-1 e stimola la via della MAPchinasi, che trasmettono il segnale al nucleo. La proteina mutata rimane permanentemente in uno stato attivo in quanto non è in grado di idrolizzare il GTP; conseguentemente la cellula viene continuamente stimolata anche in assenza di segnali esterni. L ancoraggio del ras alla membrana cellulare mediante la catena farnesilica è necessario per la sua azione. Proteine regolatrici della trascrizione nucleare Il destino finale di tutte le vie di trasduzione del segnale è quello di entrare nel nucleo e di regolare la trascrizione di un gran numero di geni che controllano la normale progressione della cellula attraverso le diverse fasi del ciclo cellulare; questo processo è regolato da una famiglia di geni i cui prodotti si localizzano alivello del nucleo, dove a loro volta controllano la trascrizione dei geni che ragolano la proliferazione. Un intero gruppo di oncoproteine, fra cui i prodotti degli oncogeni myc, myb, june e fos si localizzano nel nucleo; tra questi il gene myc è quello più comunemente coinvolto nella genesi dei tumori umani. Gli effettivi meccanismi di controllo della proteina c-myc sulla replicazione cellulare non sono ancora completamente chiariti; è stato però dimostrato che, sia prima che dopo il trasporto nel nucleo, la proteina c-myc forma un eterodimero con un'altra proteina chiamata max e l eterodimero myc-max è un potente attivatore trascrizionale che si lega a specifiche sequenze di DNA. Un altro membro di questa super famiglia di regolatori trascrizionali, mad, può legarsi a max e formare un dimero; l eterodimero mad-max agisce come repressore della trascrizione e sembra che il livello di attivazione trascrizionale di c-myc sia regolato non solo dai livelli dalla proteina c-myc ma anche dalla quantità e disponibilità delle proteine max e mad. 2

3 Mentre l espressione c-myc è perfettamente regolata durante la normale proliferazione cellulare, le versioni trasformanti di myc sono associate ad una persistente espressione e, talvolta, ad una iperespressione della proteina myc; questo porta ad una aumentata trascrizione di geni critici e alla possibile trasformazione neoplastica. Una alterata regolazione di c-myc conseguente a traslocazione è quella che si verifica nel linfoma di Burkitt, un tumore delle cellule B; inoltre c-myc è implicato nei cacinomi della mammella, del colon, del polmone e in molti altri, mentre i geni N-myc e L-myc (correlati a c-myc) sono amplificati nei neuroblastomi e nel carcinoma del polmone a piccole cellule. Regolatori del ciclo cellulare Per comprendere le alterazioni del ciclo cellulare che portano al cancro è essenziale ricordare le normali funzioni di queste proteine ed i meccanismi che le regolano; le chinasi-ciclina dipendneti guidano il ciclo cellulare fosforilando specifiche proteine bersaglio che sono indipsensabili per la progressione della cellula nelle diverse fasi. Vedi figura sotto riportata. Schema che illustra il ruolo delle cicline e delle chinasi ciclina-dipendenti (CDK) nella regolazione del ciclo cellulare. Nell esempio riportata, la CDK viene espressa costitutivamente in una forma inattiva e viene attivata solo dopo essersi legata alla ciclia D, sintetrizzata nella fase G 1 ; la forma attivata della CDK consente alla cellula di attraversare il punto di controllo che si interpone tra la fase G 1 e la fase S mediante la fosforilazione della proteina del retinoblastoma (prb). Appena la cellula entra nella fase S, la ciclina D viene degradata, riportando la CDK in uno stato inattivo. Queste chinasi sono espresse costitutivamente durante tutto il cuclo cellulare in una forma inattiva e vengono attivate mediante fosforilazione dopo essersi legate ad un'altra famiglia di proteine chiamate cicline; a differenza delle CDK le cicline vengono sintetizzate durante specifiche fasi del ciclo cellulare e la loro funzione è quella di attivare le CDK. 3

4 Sebbene ogni fase del ciclo cellulare venga attentamente controllata, il passaggio dalla fase G 1 alla fase S rappresenta un punto di controllo estremamente importante, in quanto, una volta che una cellula ha oltrepassato questa barriera, è autorizzata a procedere verso la fase S. Quando una cellula riceve segnali che ne promuovono la crescita, durante la fase G 1 precoce si ha la sintesi delle cicline di tipo D, che si legano alla CDK4 e CDK6; in una fase più avanzata dela G 1 si ha poi la sintesi della ciclina E che a sua volta si lega alla CDK2; vedi figura sotto riportata. Lo schema illustra il ruolo delle cicline, delle CDK e degli inibitori delle chinasi ciclinadipendenti (CDK) nella regolazione del ciclo cellulare. La freccia sfumata identifica la fase del ciclo cellulare durante la quale sono attivi specifici complessi ciclina/cdk. I complessi ciclina D/CDK4, ciclina D/CDK6 e ciclina E/CDK2 regolano la transizione G 1 S fosforilando la proteina del retinoblastoma (prb). I complessi ciclina A/CDK2 e ciclina A/CDK1 sono attivi nella fase S; il complesso ciclina B/CDK1 è fondamentale per la tansizione G 2 M. Esistono due famiglia di inbitori delle CDK: una famiglia è costituita dai cosiddetti inbitori INK4 ed è composta dalla proteina p15, p16, p18, p19 che agiscono sui complessi ciclina D/CDK4 e ciclina D/CDK6; l altra famiglia di inibitori è costituita dalle tre proteine p21, p27, p57, che sono invece in grado di inibire tutte le CDK Attivazione degli oncogeni Si distinguono due tipi di modificazioni: 1. modificazioni della struttura del gene che provocano la sintesi di un prodotto genico anomalo (oncoprpteina) con funzione aberrante. 2. modifcazioni della regolazione dell espressione genica che provocano una aumentata o inadeguata produzione della proteina, strutturalmente normale, che stimola la crescita cellulare. Mutazioni puntiformi Mutazioni puntiformi dei codoni 12, 13 e 61 dei geni N-ras, H-ras e K-ras causano sostituzioni amminoacidiche nelle proteine ras; le stesse così mutate attivano 4

5 costitutivamente la trasduzione del segnale mediata da queste molecole. Mutazioni dei geni ras sono un evento molto diffuso in svariatissimi tumori umani: nei tumori solidi, possono considerarsi praticamente ubiquitarie, mentre nell ambito delle neoplasie ematologiche esse sono ristrette alle leucemie linfoidi e mieloide acuta e al mieloma multiplo. Nella figura sotto riportata è espressa la rappresentazione schematica dei principali meccanismi di lesione genetica dei proto-oncogeni e dei geni oncosopressori. Al centro della figura è esemplificato un gene normale, costituito dalla sequenza codificante (cioè gli esoni, rappresentata dal rettangolo bianco) e da sequenze regolatorie (SR), in posizioe 5 rispetto alla sequenza codificante. Nel caso dell amplificazione, il gene intero viene moltiplicato in un alto numero di coppie, spesso nei tumori umani. Nel caso delle mutazioni puntiformi, un singolo nucleotide della sequenza codificante (indicato in figura con una M) viene sotituito da un altro nucleotide e questa sostituzione nucleotidica conporta una sostituzione aminoacidica a livello della proteina codificata dal gene. Nel caso della delezione, un tratto di genoma di dimensioni variabili viene perso dal corredo cromosomico della cellula; in figura la delezione è limitata alla sequenza codificante del gene. Nel caso della traslocazione, due geni, in condizioni normali situati su cromosomi diversi, vengono giustapposti; nel caso in figura, i due geni implicati nella traslocazione e derivati da cromosomi diversi sono rappresentati da due rettangoli di diverso colore (uno bianco ed uno grigio). Le traslocazioni dei tumori umani comportono due effetti principali: in un primo caso, la traslocazione può sostituire le normali sequenze regolatorie del gene con quelle del gene cui viene giustapposto; nel secondo caso, i due geni coinvolti nella traslocazione possono forndersi in un unico gene ibrido, che darà luogo ad un trascritto di fusione. Sebbene le mutazioni del ras siano molto comuni, la loro presenza non è essenziale per il processo di cancerogenesi; il processo di cancerogenesi può avvenire attraverso diverse vie e, tra esse, quelle della mutazione del ras e certamente una delle più seguite. Riarrangiamenti cromosomici Le due forme di riarrangiamento cromosomico che possono attivare proto-oncogeni sono così ripartite: 1. nei tumori linfatici, traslocazioni specifiche producono la iperespressione di proto-oncogeni mettendoli sotto il controllo degli elementi regolatori dei loci delle immunoglobuline e del recettore del linfocita T. 2. in molti tumori emopoietici le trasclocazione fanno si che sequenze normalmente non legate tra loro e localizztae su cromosomi diversi si ricombinino e formino geni ibridi che codifcano per le poteine chimeriche capaci di promuovere la crescita cellulare. Il miglior esempio di iperespressione di un proto-oncogene indotta da una traslocazione è rappresentato dal linfoma di Burkitt; tutti questi linfomi sono caratterizzati dalla presenza di almenao una di tre possibili traslocazioni, tutte interessanti il cromosoma 8q24 (dove è stato mappato il gene myc) ed uno dei tre 5

6 cromosomi in cui sono localizzati i geni delle immunoglobuline. Nel linfoma di Burkitt la forma più comune di traslocazione è quella in cui un segmento del cromosoma 8 contenente c-myc viene trasfrito sul cromosoma 14, banda 32; questa traslocazione porta c-myc vicino al gene che codifica per la catena pesante delle immunoglobuline (IGH). I meccanismi molecolari di attivazione di c-myc in seguito alla traslocazione sono variabili, in tutti i casi, comunque, le sequenze codificanti del gene rimangono intatte ed il gen c-myc viene espresso costitutivamente ad alti livelli. Il cromosoma Philadelphia, caratteristico della leucemia mieloide, cronica e di un gruppo di leucemie linfoblastiche acute, rappresenta un classico esempio di un concogene che deriva dalla fusione di due geni originariamente separati. In questo caso, infatti, una traslocazione reciproca fra cromosomi 9 e 22 porta alla porzione troncata del proto-oncogene c-abl (che origina dal cromosoma 9) vicino al locus bcr sul cromosoma 22; il gene ibrido c-abl-bcr codifica per una proteina chimerica che ha attività tirosin-chinasica; vedi figure sotto riportate. Traslocazioni cromosomiche e oncogeni coinvolti nel linfoma di Burkitt e nella leucemia mieloide cronica. 6

7 Geni oncosopressori La funzione fisiologica di questi geni è quella di regolare la crescita cellulare e la perdita di questi geni è un evento chiave in molti, se non in tutti, i tumori umani; i geni oncosopressori più significativi che controllano il ciclo cellulare e la trascrizione nucleare e che regolano pertanto la divisione cellulare. Il gene Rb La proteina Rb prodotta dal gene Rb è una fosfoproteina nucleare che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del ciclo cellulare; nel suo stato attivo p-rb costituisce un freno al passaggio dalla fase G 1 alla fese S del ciclo cellulare. Quando le cellule sono stimolate a dividersi, la proteina Rb viene inattivata mediante fosforilazione (prb-p), il freno è rimosso e la cellula può passare il punto di controllo interposto fra la fase G 1 e la fase S; una volta entrata in fase S, la cellula è in grado di completare il ciclo mitotico anche in assenza di ulteriori fattori di crescita. Le cellule quiescenti (nella fase G 0 o G 1 precoce) presentano la forma attiva, cioè ipofosforilata di prb; in questo stato, prb inibisce la regolazione cellulare legando e quindi sequestrando, i fattori di trascrizione che appartengono alla famiglia E2F. Quando le cellule quiescenti vengono stimolate da fattori di crescita, la concentrazione di cicline D ed E si innalza e la conseguente attivazione dei complessi ciclina D/CDK4, D/CDK6 e E/CDK2 portano alla fosforilazione di prb; la forma ipoerfosforilata di prb rilascia i fattori di trascrizione E2F, i quali formano degli eterodimeri con la famiglia di proteine DP ed attivano la trascrizione di diversi geni bersaglio. I dati più recenti sulla biochimica di queste attività suggeriscono che il complesso prb-e2f si leghi attivamente al DNA e inibisca la trascrizione dei geni che controllano la fase S; risulta chiaro che lo stato di fosforilazione di prb rappresenta un elemento critico per la progressione del ciclo cellulare. Se la proteina Rb è assente (causa una delezione del gene che la codifica) o se la sua capacità di regolare i fattori di trascrizione della famiglia E2F è alterata da mutazioni, i freni che agiscono sul ciclo cellulare vengono rilasciati e la cellula progredisce verso la fase S. Le osservazioni che emergono da quanto descritto sono: la perdita del controllo della normale proliferazione cellulare è un evento centrale del processo di trasformazione maligna e che almeno uno dei quattro elementi regolatori del ciclo cellulare (p16, ciclina D, CDK4, Rb) risulta mutato nella grande maggioranza delle neoplasie maligne umane. Vedi figura sotto riportata. 7

8 Ruolo di prb nella regolazione della trascrizione G 1 S del ciclo cellulare. La forma ipofosforilata di prb complessata ai fattori di trascrizione E2F si lega la DNA ed inibisce la trascrizione dei genei i cui prodotti sono necessari alla fase S del ciclo cellulare. Quando prb viene forsforilata dai complessi ciclina D/CDK4, D/CDK6 e E/CDK2, rilascia i fattori E2F che attivano la trascrizione dei geni che regolano la fase S. La fosforilazione della di prb è inibita dagli inibitori della CDK in quanto essi inattivano i complessi ciclina/cdk. Virtualmente tutte le cellule neoplastiche presentano una deregolazione del punto di controllo interposto tra la fase G 1 e la fase S dovuta alle mutazioni di uno dei 4 geni che regolano la fosforilazione di prb; questi geni (Rb, CDK4, ciclina D e p16) sono indicati da un asterisco. Il gene p53 Le azioni relative alla proteine E2F richiede, par la sua ttività, la funzione del gene p53; questi è localizzato sul cromosoma 17 (banda p13.1), e rappresenta la seconda sede più frequente di alterazioini geniche nei tumori umani. La perdita omozigote del gene p53 si riscontra virtualmente in tutti i tipi di neoplasie, compresi i carcinomi del polmone, del colon, della mammella, che rappresentano i tre casi di morte più frequenti nelle neoplasie. La proteina p53 è localizzata nel nucleo, e quando entra in azione la sua funzione primaria è rappresentata dal controllo di trascrizione di diversi altri geni; probabilmente per l azione proteolitica del sistema mediato dalla ubiquitina, la sua emivita è breve (20 minuti), pertanto a differenza di prb, non sorveglia il ciclo cellulare. La proteina p53 entra in gioco come freno di emergenza quando il DNA è danneggiato da radiazioni ionizzanti, luce ultravioletta o sostanze chimiche mutagene; in risposta a questi attacchi al patrimonio genetico della cellula, il prodotto del gemne p53 si lega al DNA e stimola la trascrizione di alcuni geni che mediano due funzioni fondamentali: l arresto del ciclo cellulare e la apoptosi. L arresto del ciclo cellulare avviene nella fase G 1 tardiva ed è causato dalla trascrizione, mediata da p53 e dell inibitore delle CDK p21 inibendo in questo modo la fosforilazione di prb necessaria alla progressione della cellula nella fase S. P53 interviene direttamente in questo processo inducendo la trascrizione di GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage), una proteina coinvolta nei processi di riparazione del DNA; se il danno viene riparato con successo, p53 attiva un gene chiamato mdm2, il cui prodotto si lega a sua volta a p53 e lo inattiva, sbloccando in questo modo il ciclo cellulare. 8

9 Se invece il danno al DNA non può essere riparato in maniera soddisfacente, la p53 induce i geni dell apoptosi: i geni bax e IGF-BP3 che stanno sotto il controllo di p53 e che eseguono l ordine di morte che parte da esso. Riassumendo, p53 è in grado di riconoscere il danno al DNA e di contribuire alla sua riparazione bloccando le cellule in G 1 ed attivando geni specifici; una cellula che abbia subito un danno al DNA che non può essere riparata è indirizzata da p53 all apoptosi. Tenendo conto di queste sue funzioni, nel caso in cui si abbia una perdita omozigote di p53, il danno al DNA non viene riparato e le mutazioni permangono nelle cellule che, continuando a dividersi, iniziano un percorso destinato alla trasformazione maligna. Vedi figura. Ruolo di p53 nel mentenimento dell intergrità del genoma. Geni che regolano l apoptosi Recentemente è stata identificata una grande famiglia che regolano l apoptosi; il primo gene antipaptotico identificato, il bcl2, appartiene ad una grande famiglia di proteine che formano omodimeri ed eterodimeri, alcuni dei quali inibiscono l apoptosi (come lo stesso bcl-2 e bcl-xs) mentre altri ( come bax, bad e bcl-xs) favoriscono la morte cellulare programmata. La base biochimica dell azione di bcl-2, che portano all attivazione di enzimi proteolitici (caspasi), responsabili della morte cellulare, non sono ancora ben note, ma sulla bse delle conoscenze attuali, questi meccanismi possono essere così riassunti: 9

10 Il rilascio del citocromo C dai mitocondri che sembra rappresentare una fase critica della catena degli eventi che portano alla morte cellulare. Localizzati strategicamente sulla membrana mitocondriale esterna, bcl-2 ed i suoi partner si pensa regolino l uscita del citocromo C dal mitocondrio verso il citoplasma. La risposta di una cellula agli stimoli apoptotici è determinata dal rapporto tra antagonisti (bcl-2, bcl-sl) ed agonisti (bax, bcl-xs, bad e bid) della morte cellulare; pertanto, sebbene gli omodimeri di bcl-2 favoriscano la soppravvivenza della cellula (probabilmente annullando bax che forma canali per l uscita del citocromo C), gli omodimeri di bax favoriscono l apoptosi. Vedi figura sotto riportata. Regolazione della morte cellulare da parte di bcl-2, bax e p53. I dimeri di bcl-2 favoriscono lk accumulo delle cellule inibendo l apoptosi, mentre i dimeri di bax la favoriscono. La capacità del gene p53 di indurre l apoptosi è mediata in parte dall amentata sintesi della proteina bax. 10