IL TEST DEL DNA PER L IDENTIFICAZIONE
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1 La prova del DNA e la genetica forense IL TEST DEL DNA PER L IDENTIFICAZIONE Dott. Ugo Ricci ricciugo@tin.it Firenze, marzo 2007
2 Il genetista forense è richiesto dalle varie parti processuali Genetista forense Genetista forense Genetista forense
3 IL TEST DEL DNA NON E UN ESAME DI ROUTINE La genetica forense è una materia complessa. Le eccezionalità sono in realtà piuttosto comuni. Ogni test è unico! La figura del genetista forense condensa conoscenze di biologia, criminalistica, genetica, medicina legale e statistica. La materia va verso una standardizzazione dei sistemi analitici, dei metodi di analisi e dei metodi di interpretazione della prova.
4 18 aprile 2005
5 . Identificazione della natura e dell origine di un campione. Fonti di variabilità genetica. Metodi analitici: estrazione, quantificazione, tipizzazione. Tecnologia. L interpretazione delle evidenze di laboratorio. Applicazioni del test del DNA. Complicazioni nelle indagini forense
6 EMOGENETICA CLASSICA Identificazione della natura e dell origine di un campione Test al luminol per sostanza ematica Falsi positivi Detergenti Tensioattivi Vernici Succhi di frutta
7 . Identificazione della natura e dell origine di un campione. Fonti di variabilità genetica. Metodi analitici: estrazione, quantificazione, tipizzazione. Tecnologia. L interpretazione delle evidenze di laboratorio. Applicazioni del test del DNA. Complicazioni nelle indagini forense
8 Microsatelliti Un microsatellite consiste di una specifica sequenza di basi del DNA o nucleotidi che contiene mono, di, tri, tetra, ecc. ripetizioni a tandem. Sono anche chiamati simple sequence repeat (SSR), ma più conosciuti come short tandem repeat (STR). I microsatelliti sono ereditati secondo le regole Mendeliane. Alleli a uno specifico locus differiscono nel numero di sequenze ripetute.
9 Polimorfismi di lunghezza Coloranti fluorescenti AATG AATG AATG 7 ripetizioni 8 ripetizioni La regione ripetuta è variabile tra campioni mentre le regioni fiancheggianti ove si legano i primer sono costanti. La posizione dei primer determina la lunghezza del frammento di amplificazione.
10 dinucleotidi ~45% Alte stutter Basse stutter tetranucleotidi <2% Tipi di STR Dinucleotide Trinucleotide Tetranucleotide Pentanucleotide Hexanucleotide (CA)(CA)(CA)(CA) (GCC)(GCC)(GCC) (AATG)(AATG)(AATG) (AGAAA)(AGAAA) (AGTACA)(AGTACA) In genetica forense si utilizzano quasi tutti tetranucleotidi.
11 Nomenclatura per i microsatelliti Nell ottobre 1994, la DNA Commission of the International Society of Forensic Haemogenetics (ISFH), ora ISFG, raccomandò l attuale classificazione degli STR. Bar, W., Brinkmann, B., Lincoln, P., Mayr, W.R. and Rossi, U. (1994) DNA recommendations-1994 report concerning further recommendations of the DNA Commission of the ISFH regarding PCR-based polymorphisms in STR (short tandem repeat) systems. Int. J. Leg. Med. 107: Ciascun allele viene indicato in base al numero di sequenze ripetute. Allele (Repeat #) Set bp 210 bp 214 bp 218 bp Set bp 142 bp 146 bp 150 bp Set bp 226 bp 230 bp 234 bp Struttura del repeat [ATTT]7 [ATTT]8 [ATTT]9 [ATTT]10
12 Nomenclatura per i microsatelliti Quando un allele non è conforme al motivo ripetuto standard del sistema esso deve essere indicato dal numero delle ripetizioni complete e dal numero delle paia di basi della ripetizione parziale, separata da un punto decimale. Allele (Repeat #) Set 1, bp 198 bp 199 bp Set bp 173 bp 174 bp Set bp 257 bp 258 bp Set bp 187 bp 188 bp Set bp 179 bp 180 bp Struttura del repeat [AATG] 9 [AATG] 6 ATG[AATG] 3 [AATG] 10 La ISFG raccomanda inoltre l uso di scale alleliche (ladder) contenenti i più comuni alleli nella popolazione, stabiliti in base alle dimensioni e alla sequenza.
13 Categoria Categorie di marcatori STR Esempio di sequenza ripetuta Ripetizioni semplici contiene unità di identica lunghezza e sequenza (GATA)(GATA)(GATA) Ripetizioni semplici con alleli non consenso (p. es., TH01 9.3) Ripetizioni composte comprende due o più ripetizioni semplici adiacenti (GATA)(GAT-)(GATA) (GATA)(GATA)(GACA) Ripetizioni complesse contiene diversi blocchi ripetuti di lunghezza variabile (GATA)(GACA)(CA)(CATA) 13 CODIS Loci TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539 TH01, D18S51, D7S820 VWA, FGA, D3S1358, D8S1179 D21S11
14 Caratteristiche dei microsatelliti Gli STR usati in genetica forense non danno alcuna informazione riguardo a malattie genetiche, né a predisposizione all insorgenza di patologie. Se un marcatore correla in qualche modo con caratteristiche cliniche, non deve essere più usato in genetica forense. L unica informazione che può acquisirsi sul fenotipo del donatore di una traccia è capire se si tratta di un uomo o di una donna (diagnosi di genere).
15 Microsatelliti o Short Tandem Repeat Criteri di scelta degli STR Alta eterozigosità Alto potere discriminativo Elevata PIC Sequenze ripetute regolari Alleli ben distinguibili Amplificazione efficiente in formato multiplex
16 La misura dell informativit informatività - i parametri forensi Potere discriminativo PD probabilità che due soggetti presi a caso in una popolazione possiedano diversa configurazione genotipica. DP = 1 - (P i ) 2 dove P i = frequenza ciascun genotipo Potere di esclusione di paternità indica quanti individui scelti a caso e falsamente accusati di paternità verrebbero esclusi da una coppia madre/figlio anch essa scelta a caso. n n-1 n Q n = p i (1- p i ) 2 (1-p i + p 2 i ) + pi p j (p i + p j ) (1- p i + p j ) 2 i=1 i=1 j=i+1 Contenuto d informazione polimorfa è una misura diretta del grado di polimorfismo per un sistema ad alleli codominanti. Per le applicazioni forensi sono consigliati marcatori con PIC > 0,70 n n-1 n PIC = 1 - (p 2 i ) - 2 pi 2 p 2 j dove pi = frequenza allele più comune i=1 i=1 j=i+1 p j = frequenza allele successivo
17 Short Tandem Repeat Vantaggi possibilità di analizzare tracce degradate perchè gli ampliconi prodotti sono di basso peso molecolare ( bp); possibilità di allestire sistemi multiplex per l analisi contemporanea di più STR; facile classificabilità; possibilità di gestire le informazioni in banche dati; disponibilità di kit commerciali. VNTR STR ministr Probabilità di ottenere un profilo riproducibile
18 VWA VWA TPOX TH01 TH01 CSF1P0 Lo standard Europeo European Standard Set of loci (ESS) o Interpol Standard Set of Loci (ISSOL) D21S11 FGA D8S1179 D3S1358 Lo standard degli Stati Uniti D21S11 FGA D8S1179 D3S1358 D5S818 D16S539 D13S317 D7S820 D18S51 D18S51 Amelogenina Amelogenina
19 Decisioni al meeting di Glasgow del 4-5 aprile 2005 EDNAP ENFSI SCOPO: facilitare l analisi di campioni parzialmente degradati.. Mini STR debbono essere adottati per incrementare la robustezza e la sensibilità dell analisi;. I loci usati negli attuali database saranno convertiti in mini-str;. Si raccomanda l introduzione di D10S1248, D14S1434 e D22S1045;. Altri loci da introdurre saranno D12S391, D1S1656 e TPOX.
20 PCR primer convenzionali Le ministr: un nuovo metodo per il DNA degradato ministr primer Prodotti di PCR ridotti lavorano meglio con basso numero di copie di templati di DNA degradato Regione STR ministr primer PCR primer convenzionali STR test convenzionale 150 bp ridotto MiniSTR (Butler et al. 2003)
21 J. Forensic Sci. Sept 2003 Big Mini TH01 Allelic Ladder TH01 PCR product size (bp) TPOX CSF1PO FGA D21S11 D7S820 Dimensioni rispetto a kit tradizionali -105 bp -191 bp -148 bp -117 bp -71 bp -33 bp
22 I loci del CODIS vengono amplificati con primer ridotti
23
24 Altre caratteristiche dei loci STR: le mutazioni Variazioni in genere di un repeat per espansioni o contrazioni che producono incompatibilità genetiche. Queste devono essere trattate come basse probabilità di paternità. Si richiede di analizzare un numero addizionale di polimorfismi; se tutti dimostrano compatibilità e se l incompatibilità osservata è single-step, allora si tratta verosimilmente di una mutazione vera. In letteratura sono descritti casi di doppie e anche triple mutazioni in un singolo test di paternità. Si tratta probabilmente di vere ESCLUSIONI e l alto valore di compatibilità osservata è dovuta all aver esaminato un padre presunto correlato con il padre vero.
25 Mutazioni sui siti di legame dei primer Producono mancata o parziale amplificazione di un allele e determinano in genere un drop-out allelico in un soggetto eterozigote. Un esempio: un test di paternità paradigmatico
26 19 STR TPOX D3S1358 FGA CSF1PO D5S818 D7S820 D8S1179 TH01 VWA D13S317 D16S539 D21S11 D18S51 D2S1538 D19S433 Penta D Penta E SE33 F13B Paternity index Alleged father Mother Son 9, , 11 14, 17 14, , 24 22, 23 22, 24 10, 12 10, 12 10, 12 11, 13 11, 12 11, 12 7, 8 10, 12 7, 12 10, 15 11, 13 10, , 9.3 6, 9 16, 17 14, , 11 12, 13 11, 12 8, , 12 29, , 30 29, 30 13, 14 13, , 23 22, 25 19, 22 14, , , 17 8, 12 10, 13 10, 12 14, 15 10, 11 10, 14 18, 19 18, , 19 8, 10 9, 10 9, ,6x10 10 Daughter 8, , 24 10, , 12 10, , 17 11, 13 8, 11 29, , 18 19, 25 14, 16 10, 12 11, 15 18,
27 Padre presunto Padre presunto Madre Madre Figlio Figlio Figlia Figlia
28 Mutazioni sui siti di legame dei primer mutato Wild-type Gene Fibrinogeno 3116G>A
29 NON PERDIAMO QUESTE INFORMAZIONI!
30 Ruolo dei Single Nucleotide Polymorphism (SNP) in genetica forense Decisioni al meeting di Glasgow del 4-5 aprile 2005 EDNAP ENFSI Per l analisi di campioni particolari, come ossa, specialmente nei disastri di massa, quindi indipendentemente dalle banche dati del DNA; Utili per l analisi dell mtdna e del cromosoma Y; Utili per l individuazione di alcune caratteristiche somatiche (p.es. il colore dei capelli)
31 Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
32 Esercizio collaborativo europeo sugli SNP Materiali e metodi - Analisi di campioni degradati naturalmente (saliva e sangue a 37 C in camera umida a 100 C) Multiplex di STR tradizionali, di ministr e il primo sistema SNP del Forensic Science Service Risultati - Migliori furono ottenuti con ministr multiplex (con 32 cicli di amplificazione).
33 Degradation plot per STR, SNP e ministr
34 SNP sostituti degli STR? Gill P, Werrett DJ, Budowle B, Guerrieri R. Science&Justice 2004, 44, a) Esistono ampi database basati su loci STR; b) Il costo dell analisi SNP è ancora alto; c) Occorrono SNP per ottenere la stessa informatività ottenibile da STR; d) Analisi di tracce miste è impossibile con gli SNP, perché biallelici; e) Gli SNP presentano fenomeni comuni agli STR come il drop-out allelico e il pericolo di contaminazione.
35 . Identificazione della natura e dell origine di un campione. Fonti di variabilità genetica. Metodi analitici: estrazione, quantificazione, tipizzazione. Tecnologia. L interpretazione delle evidenze di laboratorio. Applicazioni del test del DNA. Complicazioni nelle indagini forense
36 Materiali biologici analizzabili Sangue Liquido seminale Saliva Urina Capelli Denti Ossa Tessuti Macchia di sangue E richiesta solo una piccola parte di sangue per un profilo del DNA
37 ESTRAZIONE ORGANICA ESTRAZIONE ESTRAZIONE DA CON RESINE SPOT Macchia di sangue SDS, DTT, EDTA e proteinasi K Macchia di sangue acqua Macchia di sangue INCUBAZIONE (56 o C) Centrifuga Miscela di fenol cloroformio alcool isoamilico INCUBAZIONE (ambiente) Centrifuga RIMOZIONE supernatante SPOT VORTEX Centrifuga Fase acquosa in nuovo tubo TE buffer Resina INCUBAZIONE (56 C) INCUBAZIONE (100 C) Lavaggio con buffer RIMOZIONE supernatante Reagenti per la PCR Concentrazione del campione (Centricon/Microcon-100 o precipitazione in etanolo) QUANTIFICAZIONE Centrifuga QUANTIFICAZIONE PCR Centrifuga QUANTIFICAZIONE OMESSA CON CAMPIONI UNIFORMI PCR PCR
38 Rimuovere una porzione di macchia Estrazione differenziale SDS, EDTA e proteinase K (buffer di lisi) Incubazione a 37 o C Sperma dell assalitore miscelata con cellule epiteliali della vittima SDS, EDTA e proteinase K + DTT Centrifuga DTT lisa la testa degli spermi Pellet di spermi Rimuovere supernatante Frazione maschile Pellet di Frazione femminile Associazione Identificazioni Forensi spermi - A.I.Fo.
39 ISBN-10: ISBN-13:
40 Quantificazione Spettrofotometro lettura a 260 nm: utile solo per DNA non degradato, estratto da sangue e tessuti. Non specifico per materiale umano e per il DNA; Elettroforesi in agarosio non specifico per DNA umano Metodo degli spot in agarosio - non specifico per DNA umano Slot blot hybridization specifico per ciascuna specie e sensibile, ma impegnativo in termini di tempo Real time PCR specifico per DNA umano, molto sensibile e rapido.
41 Importanza della quantificazione del DNA (prima di una multiplex PCR) DNA (log scala) 100 ng 10 ng 1 ng Alti livelli di DNA creano problemi di interpretazione con produzione di artefatti -A +A 2.0 ng Multiplex STR lavorano bene in questo range di input DNA 0.5 ng Troppo DNA Picchi fuori scala Picchi accessori (+/-A) Sbilanciamento tra loci Well-balanced STR multiplex 0.1 ng 0.01 ng L effetto stocastico quando si amplificano bassi livelli di DNA produce allele dropout Troppo poco DNA Sbilanciamento degli eterozigoti Allele drop-out Sbilanciamento tra loci
42 La quantità di prodotto di PCR è proporzionale alla quantità di DNA iniziale Exponential PCR Durante l espansione esponenziale della PCR la quantità di prodotto è proporzionale alla quantità di templato. 1.00E E E E E E E E E E E+00 2ng template 1ng template 0.5ng template # Cycles ng product
43 Grafico di amplificazione di campioni forensi con Real-time PCR Maggiore concentrazione DNA Ciclo soglia Minore concentrazione DNA Assenza di DNA o inibizione per contaminanti Numero di cicli
44 Inibitori e Real-time PCR La presenza di inibitori può fornire risultati non attendibili con questo metodo. Un buon sistema è diluire il campione prima del dosaggio. Real Time bones 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 A A 1:10 B B 1:10 Quantity (ng/ul) DNA samples
45 Altri oggetti potenziali fonti di DNA DNA per contatto = da poche a 50 cellule Analisi low copy number impronte digitali; colletti di camicie, maglie, indumenti in genere; passamontagna, caschi da moto; orologi, anelli, stanghette di occhiali; oggetti impugnati, matite, penne, armi bianche, armi da fuoco ecc.
46 Contaminazione Può avvenire in una qualunque delle fasi preliminari all analisi del campione (repertamento, estrazione, amplificazione, iniezione del campione). Occorre verificare i controlli negativi e positivi, per accertare che tutto sia nella norma. Controllo positivo contaminato
47 Contaminazione L esame di controlli negativi in provette sterili senza DNA, condotto a 34 cicli di amplificazione, mostra la presenza di forme alleliche sporadiche, dovute a contaminazione non meglio identificata. Gill et al. Forensic Sci Int 112, 2000,
48 . Identificazione della natura e dell origine di un campione. Fonti di variabilità genetica. Metodi analitici: estrazione, quantificazione, tipizzazione. Tecnologia. L interpretazione delle evidenze di laboratorio. Applicazioni del test del DNA. Complicazioni nelle indagini forense
49 Multiplex PCR Più di 15 Marcatori possono essere copiati in una volta Sensibilità a livelli di meno di 0.5 ng di DNA Differenti colori fluorescenti sono usati per distinguere alleli STR che si sovrappongono in lunghezza.
50 Profilo multilocus con elettroforesi capillare
51 Profilo genetico con elettroforesi su gel
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55 ISBN-10: ISBN-13:
56 . Identificazione della natura e dell origine di un campione. Fonti di variabilità genetica. Metodi analitici: estrazione, quantificazione, tipizzazione. Tecnologia. L interpretazione delle evidenze di laboratorio. Applicazioni del test del DNA. Complicazioni nelle indagini forense
57 Da un test del DNA può emergere: COMPATIBILITA GENETICA INCOMPATIBILITA GENETICA Individuazione del soggetto donatore di una traccia; Conferma di un legame biologico di parentela. Esclusione che una traccia provenga da quel donatore; Negazione del legame biologico di parentela.
58 La comparazione tra profili genetici N Amelog. D3S1358 vwa FGA D8S1179 D21S11 D18S51 CSF1PO TH01 TPOX traccia X-Y vittima X-Y sospetto X-Y testimone X-Y inquirente X-X Se non vi sono errori nella tipizzazione, se quindi possiamo essere certi del risultato analitico ed escludere errori nella repertazione, nel campionamento, nell etichettatura, nelle performance del laboratorio, i profili possono fornire dei risultati concreti:
59 N Amelog. D3S1358 vwa FGA D8S1179 D21S11 D18S51 CSF1PO TH01 TPOX traccia X-Y vittima X-Y sospetto X-Y testimone X-Y inquirente X-X Incompatibilità tra uno o più sistemi ESCLUSIONE N Amelog. D3S1358 vwa FGA D8S1179 D21S11 D18S51 CSF1PO TH01 TPOX traccia X-Y vittima X-Y sospetto X-Y testimone X-Y inquirente X-X Compatibilità di tutti i sistemi match giudizio di ATTRIBUZIONE?
60 ECCEZIONE! Gemelli monozigoti hanno identico profilo genetico Gemelli monozigoti hanno diverse impronte digitali
61 Il ruolo del consulente Sulla base della mia esperienza accumulata in tanti anni di lavoro, sono certo che il campione viene dal sospetto Pericolo di essere autoreferenziali!
62 Concetti rilevanti per valutare l evidenza genetico-forense. Intuitivo basato sulla rarità del profilo genetico;. Definizione delle ipotesi contrapposte e successiva valutazione;. La legge di Bayes.
63 Cam Freq PERCHE IN CRIMINALISTICA MARCATORI AUTOSOMICI SONO RITENUTI SUFFICIENTI? La probabilità di discriminare a priori un soggetto falsamente accusato di aver lasciato quella traccia è > 99,999% D8 D21 D7 CSF D3 TH01 D13 D16 vwa TPO D18 D5 13, 14 29, 30 10, 11 11, 12 15, 16 6, 7 11, 12 11, 12 16, 17 8, 8 12, 14 11, 12 13% 11% 12% 20% 13% 13% 18% 17% 12% 28% 5% 22% Frequenza del profilo stimata in una popolazione italiana Match probability o probabilità di associazione casuale 1 su FGA 21, 22 6%
64 Concetti rilevanti per valutare l evidenza genetico-forense. Intuitivo basato sulla rarità del profilo genetico;. Definizione delle ipotesi contrapposte e successiva valutazione;. La legge di Bayes.
65 Ipotesi differenti vengono comparate dal punto di vista probabilistico Evidenza scientifica Likelihood ratio rapporto di verosomiglianza LR = Pr (E\ ipotesi dell accusa) Pr (E\ ipotesi della difesa)
66 Test di paternità Evidenza scientifica La prova DNA viene valutata come rapporto di verosomiglianza LR, che nel caso dei test di paternità è indicato come indice di paternità PI. PI = Pr (E\ padre presunto padre biologico) Pr (E\ padre presunto Є popolazione di rif.)
67 PERCHE NEI TEST DI PATERNITA MARCATORI AUTOSOMICI SONO RITENUTI SUFFICIENTI? SISTEMA Figlio Madre Padre D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO D3S1358 TH01 D13S317 D16S539 VWA TPOX D18S51 D5S818 12, 15 29, 29 9, 12 10, 12 13, 16 6, 6 13, 14 11, 11 17, 18 8, 8 16, 17 11, 13 12, 14 29, 30 10, 12 10, 13 13, 18 6, 6 11, 14 11, 13 17, 17 7, 8 16, 17 12, 13 13, 15 29, 33 9, 11 12, 14 15, 16 6, 9 11, 13 9, 11 17, 18 8, 10 14, 16 11, 13 Rapporto costo-beneficio Esaminando 13 marcatori del DNA la probabilità a priori, cioè prima di eseguire il test, di escludere un uomo falsamente accusato della paternità è superiore al 99,999% FGA 21, 26 21, 25 24, 26 W (50%) > 0,9999 con una mutazione osservata
68 Concetti rilevanti per valutare l evidenza genetico-forense. Intuitivo basato sulla rarità del profilo genetico;. Definizione delle valutazione; delle ipotesi contrapposte e successiva. La legge di Bayes.
69 Teorema di Bayes - usato nei test di paternità Il punto di vista dell esperto forense: dare elementi utili alla Corte, basati su evidenze scientifiche, perché essa possa obiettivamente decidere sulle ipotesi rilevanti. Il punto di vista della Corte: valutare il peso delle ipotesi rilevanti. Gli organi giudicanti devono attribuire una probabilità a priori, in base agli elementi che emergono nel dibattimento, prima della testimonianza dell esperto forense. In genere l esperto fornisce varie probabilità a posteriori assumendo varie probabilità a priori.
70 Pr posteriori = LR X Pr priori Pr posteriori = la richiesta della Corte LR = termine che deve valutare l esperto forense Pr priori = valore che deve essere fornito dalla Corte
71 Ruolo del consulente è quindi anche valutare i risultati con la necessaria obiettività. Sulla base dei risultati ottenuti ho valutato le ipotesi contrapposte riguardo alla provenienza del profilo genetico che ho determinato sul reperto. Risulta 100 volte più probabile che esso provenga dal sospetto che da una persona sconosciuta non imparentata con il sospetto.
72 ISBN-10: ISBN-13:
73 . Identificazione della natura e dell origine di un campione. Fonti di variabilità genetica. Metodi analitici: estrazione, quantificazione, tipizzazione. Tecnologia. L interpretazione delle evidenze di laboratorio. Applicazioni del test del DNA. Complicazioni nelle indagini forense
74 DNA usato in casi forensi Test di paternità/maternità o parentela Esami di criminalistica Analisi di tracce e confronto con sospetti donatori (vittima, indagati, testimoni, investigatori, ecc.) In casi di violenza sessuale (>2 su 3) Ricostruzione ipotetica delle dinamiche di un fatto Esami indiretti (ricerca in database, confronto con parenti) Identificazione in disastri di massa Identificazione di persone scomparse Costruzione di banche dati del DNA
75 Esami di criminalistica CON IL DNA SI PUO PROVARE L INNOCENZA DI UNA PERSONA!
76 Esami di criminalistica esami diretti, banche dati del DNA Il profilo genetico può dirci se un soggetto ha lasciato parte di sé su un oggetto o se è probabile che sia passato da un certo posto. E fondamentale che il sopralluogo giudiziario sia compiuto con le dovute cautele per evitare contaminazioni. La repertazione e conservazione del reperto è fondamentale per ottenere risultati attendibili dalle analisi del DNA.
77 In criminalistica è utile studiare L EREDITARIETA Marcatori autosomici Marcatori parentali Autosomici (trasmessi in parte da tutti gli antenati) Cromosoma Y (trasmesso intero, ma solo tra maschi) DNA mitocondriale (trasmesso intero, ma solo dalle femmine)
78 La ricerca di persone scomparse Il DNA consente di stabilire l identità di una persona scomparsa:. Esami diretti confronto tra il DNA della persona scomparsa e materiale biologico di sua certa provenienza (presente su oggetti come pettini, spazzolini da denti, indumenti ecc.). Esami indiretti si basa sulle regole di trasmissione e sui principi dell eredità. Viene effettuato il confronto dei profili genetici di parenti biologici della persona scomparsa.
79 (A) Random man (B) Test di paternità Padre presunto? Madre figlio Regole di trasmissione Il figlio ha due alleli per ciascun marcatore autosomico, ereditati uno dalla madre ed uno dal padre biologico Test di paternità reverse Padre presunto Madre presunta Il figlio, indipendentemente dal sesso, ha l aplotipo mitocondriale della madre.? Figlio scomparso Il figlio, se maschio, possiede l aplotipo del cromosoma Y del padre.
80 Accertamenti indiretti di tipo investigativo Acquisire informazioni sul DNA attraverso parenti del sospetto Cromosoma Y DNA mitocondriale
81 . Identificazione della natura e dell origine di un campione. Fonti di variabilità genetica. Metodi analitici: estrazione, quantificazione, tipizzazione. Tecnologia. L interpretazione delle evidenze di laboratorio. Applicazioni del test del DNA. Complicazioni nelle indagini forense
82 Complicazioni delle analisi forensi Tracce ridotte - L esame di quantità ridotte di DNA può produrre risultati o negativi o di difficile interpretazione. Campioni degradati - la degradazione rende difficoltoso l ottenimento di un profilo genetico riproducibile. Tracce miste - quando campioni di più soggetti sono mescolati tra loro le analisi risultano più complesse. Soggetti imparentati - soggetti correlati ad un sospetto condividono una maggior proporzione di DNA.
83 Profili con basso numero di copie di DNA (Low Copy Number - LCN) Chi ha impugnato l arma del delitto? Profili complessi da interpretare!
84 Interpretazione di profili genetici da DNA low copy number Profili con artefatti rendono la utilizzazione del risultato problematica, di agevole confutazione probatoria nelle sedi appropriate, anche quando vengono utilizzati modelli matematici e linee-guida per l interpretazione dei dati (Tagliabracci A. et al. GeFI Verona 2002).
85 L esame di campioni tumorali Profilo genetico da tessuto tumorale L instabilità nei profili genetici è comune ai campioni degradati
86 Le tracce miste: comuni negli casi reali
87 Interpretazione di tracce miste Valutazione qualitativa Stima della probabilità di match dopo aver individuato i genotipi Calcolo delle probabilità di esclusione CPE Calcolo del rapporto di verosomiglianza di varie ipotesi identificative.
88 Interpretazione di tracce miste Valutazione qualitativa. indicare tutti gli alleli presenti nella traccia. comparare i profili della vittima e del sospetto per tutti i marcatori esaminati. verificare se tutti gli alleli del sospetto sono presenti nella traccia mista: sì il sospetto non può essere escluso no il sospetto deve essere escluso (a meno non vi siano evidenze di drop-out o drop-in allelici)
89 Ladder traccia 11,12, 14 A 1 A 2 A 3 vittima Sospetti inclusi Sospetto escluso 11,14 11,12 11,11 11,13 L allele 13 non è presente nella traccia
90 Valutazione qualitativa Il sospetto non può essere escluso quale donatore questa affermazione ha un basso valore probatorio «Senza un valore di probabilità, il Giudice non sa che farne dell affermazione: il Giudice non sa se i profili sono comuni come quadri con due occhi o unici come Monna Lisa» US v Yee, 134 FRD 161, 181 [ND Ohio, 1991]
91 Stima della probabilità di match dopo aver individuato i genotipi In alcuni casi è possibile dedurre i genotipi dei contributori in base alle aree dei picchi e quindi stimare la probabilità di match combinata per la componente maggiore e minore. Studi collaborativi hanno dimostrato tuttavia errori nella corretta individuazione del genotipo con componente maggioritaria (10%) e minoritaria (13%).
92 Stima della probabilità di match dopo aver individuato i genotipi
93 Calcolo delle probabilità di esclusione CPE Non richiede la conoscenza del numero di contributori, né di profili di riferimento. CPE indica la proporzione di popolazione che ha un genotipo composto di almeno un allele non osservato nella traccia mista (DNA Advisory Board 2000). Fornisce una stima indicativa delle persone che possono essere escluse quali contributori della traccia, ma non sfrutta tutta l informazione disponibile.
94 Calcolo del rapporto di verosomiglianza di varie ipotesi identificative. Fornisce una stima precisa di osservare un certo genotipo sotto ipotesi diverse, che debbono essere indicate. Sfrutta tutte le informazioni disponibili e richiede di formulare delle ipotesi circa il numero di contributori e probabilizzarle. Può essere complicata da calcolare, ma utile per valutare il peso dell evidenza sotto varie ipotesi. LR = il profilo genetico della macchia mista è dovuto al contributo dell indagato e a quello della vittima, senza il contributo di altri individui il profilo genetico della macchia mista è dovuto al contributo della vittima e a quello di un individuo sconosciuto appartenente alla popolazione di riferimento che NON corrisponde all indagato
95 Approccio futuro dovrebbe elaborare tutti gli aspetti tra cui la presenza di stutter, contaminazioni e altri artefatti, drop-out allelici, usando sistemi probabilistici appropriati. Accreditamento e sistemi esperti Lo standard ISO17025 richiede la tracciabilità, che può essere interpretata come la necessità di escludere scatole nere, considerazione specialmente importante nell uso di sistemi esperti.
96 Presenza di soggetti correlati Soggetti correlati hanno maggiori possibilità di condividere un certo numero di alleli a differenti loci. Maggiore è il coefficiente di correlazione tra queste persone, maggiore è il numero di alleli condivisi % 18.00% 16.00% 14.00% 12.00% 10.00% 8.00% Synthetic Cous ins Siblings Percent of Total 6.00% 4.00% 2.00% 0.00% Num ber of Shared Alleles
97 Presenza di soggetti correlati E importante tener conto dell esistenza di soggetti correlati. In R v Watters (2000) All ER(D) 1469 l imputato era accusato di aver commesso 5 furti con scasso, nei quali era stato stabilito match con una frequenza del profilo di 1 su 86 milioni. L esistenza di due fratelli dell accusato portò il valore di LR a posteriori di 1 su 267. In primo grado l imputato fu condannato, ma la Corte d Appello annullò la sentenza, ritenendo ragionevole che l autore del fatto potesse essere in realtà uno dei suoi fratelli.
98 Riassumendo i limiti del test del DNA Gemelli identici non possono essere distinti con il DNA. Campioni degradati e/o contaminati, tracce miste eccessivamente complesse possono essere di difficile o impossibile interpretazione. Il test del DNA è quasi sempre un esame comparativo. Soggetti correlati condividono un alta percentuale di DNA. Inoltre il campione biologico si può facilmente trasportare: identificare un campione non vuol dire necessariamente che una persona fosse presente nel luogo del rinvenimento del reperto.
99 SOPRALLUOGO GIUDIZIARIO REPERTAZIONE Gli errori LABORATORIO RICEZIONE REPERTI CATALOGAZIONE, RILIEVI FOTOGRAFICI, PRELIEVI Il miraggio della prova assoluta non esiste: è indispensabile mettere in conto la possibilità di un errore umano. SESSO GENETICO ALTRE INDAGINI DI CRIMINALISTICA POLIMORFISMI AUTOSOMICI ANALISI BIOLOGICA : DIAGNOSI INDIVIDUALE RACCOLTA DATI PROFILO DNA ANALISI BIOLOGICA: DIAGNOSI GENERICA E DI SPECIE POLIMORFISMI CROMOSOMA Y DNA MITOCONDRIALE DATABASE INTERPRETAZIONE PROFILO L ESCLUSIONE L ATTRIBUZIONE DATABASE INDAGINI INDIRETTE
100 Che cosa puo dire a priori il test del DNA riguardo alle caratteristiche fisiche del donatore di una traccia? OGGI Il sesso dell individuo che ha depositato la traccia biologica DOMANI (FORSE ) informazioni riguardo alle origini etniche di chi ha depositato la traccia biologica informazioni sulle caratteristiche antropometriche di chi ha depositato la traccia biologica IDENTIKIT GENETICO
101
102 ASTM and American Academy of Forensic Sciences Springer-Verlag Elsevier Science
103 Padova, 2008
104 Riferimenti web Peter de Knijff s Y STR web page: Y STR Haplotype database: STRBase
105 GRAZIE DELL ATTENZIONE
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