CITOLOGIA TIROIDEA IN STRATO SOTTILE: UNA SFIDA PER IL TERZO MILLENNIO

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1 CITOLOGIA TIROIDEA IN STRATO SOTTILE: UNA SFIDA PER IL TERZO MILLENNIO PROF. GUIDO FADDA ISTITUTO DI ANATOMIA E ISTOLOGIA PATOLOGICA UNIVERSITA CATTOLICA DEL SACRO CUORE - ROMA

2 LA CITOLOGIA E LA SFIDA DIAGNOSTICA PIU INTRIGANTE DEL XXI SECOLO

3 APPLICAZIONI DELLA CITOLOGIA SCREENING DI POPOLAZIONE PREVENZIONE DIAGNOSI FATTORI PROGNOSTICI PREDITTIVITA DI RISPOSTA ALLE TERAPIE FOLLOW-UP

4 VANTAGGI DELLA CITOLOGIA raccolta delle cellule con metodi non invasivi necessita di una quantita ridotta di materiale ripetibilita dell esame possibilita di applicazione per screening

5 CLASSIFICAZIONI DELLE LESIONI TIROIDEE USATA PRESSO L U.C.S.C. ( ) 2. INADEGUATO/EMORRAGICO (TIR 1) 3. BENIGNO (STRUMA, TIROIDITE) (TIR 2) 4. NODULO FOLLICOLARE (NFSA) (TIR 3?) SENZA 5. NODULO FOLLICOLARE OSSIFILO) (TIR 3) P.D. ATIPIE (E NF 6. NODULO FOLLICOLARE CON POLIMORFISMO NUCLEARE (NFPN) (TIR 4) 7. MALIGNO (TIR 5) (Fadda G. et al. J Exp Clin Cancer Res 1998; 17: )

6 RISCHIO NEOPLASTICO (NEO BENIGNE E MALIGNE) NELLE VARIE CATEGORIE DI NODULI FOLLICOLARI (UNIV. CATTOLICA DI ROMA : 550 F.N.A.B.CON CONTROLLO ISTOLOGICO) NFSA (227): MAL.2 (0.9%) NEO TOT. 31 (13.6%) NF/NFO (201): MAL. 40 (19.9%) NEO TOT. 121 (60.2%) NFPN (122): MAL. 83 (68%) NEO TOT. 107 (87.7%)

7 CLASSIFICAZIONI DELLE LESIONI TIROIDEE USATA PRESSO L U.C.S.C. ( ) 2. INADEGUATO/EMORRAGICO 3. BENIGNO (STRUMA, TIROIDITE) 4. NODULO (NFSA) FOLLICOLARE 5. NODULO FOLLICOLARE OSSIFILO) SENZA P.D. 6. NODULO FOLLICOLARE POLIMORFISMO NUCLEARE (NFPN) ATIPIE (E NF CON 7. MALIGNO (Fadda G. et al. J Exp Clin Cancer Res 1998; 17: )

8 CLASSIFICAZIONE DELLE LESIONI TIROIDEE ADOTTATA PRESSO L U.C.S.C. DI ROMA ( ) 1. INADEGUATO/EMORRAGICO 2. BENIGNO (STRUMA, TIROIDITE, NFSA) 3. NODULO FOLLICOLARE OSSIFILO) P.D. 4. NODULO FOLLICOLARE POLIMORFISMO NUCLEARE 5. MALIGNO (Fadda G. et al.thyroid 2006; 16: ) (E NF CON

9 CLASSIFICAZIONE CLINICO-CITOLOGICA DELLE DIAGNOSI CITOLOGICHE DI LESIONI TIROIDEE SU AGOASPIRATO (CONSENSUS ITALIANA SIAPEC/IAP) BOZZA FINALE FIRENZE CLASSE DIAGNOSTICA CATEGORIA DIAGNOSTICA TRATTAMENTO RACCOMANDATO CORRISPONDENZA ISTOLOGICA TIR 1 Non diagnostico/ rappresentivo Non diagnostico: ripetizione dopo 1 mese Cisti/emorragia: controllo e/o ripetizione Cisti TIR 2 Negativo per cellule maligne Controllo clinico. A giudizio del clinico o su suggerimento del citopatologo si puo ripetere per minimizzare i FN Gozzo nodulare; nodulo adenomatoso microfollicolare in gozzo; tiroidite TIR 3 Inconclusivo/indeterminato (proliferazione follicolare) Asportazione chirurgica della lesione ed esame istologico. Non esame estemporaneo. Decisione presa sulla base del contesto clinico-strumentale. Alcuni marcatori possono essere utili nella discriminazione tra casi chirurgici e casi medici (GAL-3, HBME-1, CK19) Adenoma follicolare; neoplasie a cellule ossifile; carcinoma follicolare minim. invasivo; carcinoma papillare var. follicolare TIR 4 Sospetto di malignità Eventuale ripetizione della FNC a giudizio del clinico o su suggerimento del citopatologo. Asportazione chirurgica della lesione con eventuale esame estemporaneo Prevalentemente varietà follicolare del carcinoma papillare TIR 5 Positivo per cellule maligne Intervento chirurgico per i carcinomi differenziati (anche in considerazione del contesto clinico). Prosecuzione dell iter diagnostico in caso di ca. anaplastico, metastasi o linfoma Neoplasia maligna non

10 CLASSIFICAZIONE DELLE LESIONI TIROIDEE ADOTTATA PRESSO L U.C.S.C. DI ROMA ( ) TIR 1: INADEGUATO/EMORRAGICO TIR 2: BENIGNO (STRUMA, TIROIDITE, NFSA) TIR 3: NODULO FOLLICOLARE P.D. (E NF OSSIFILO) TIR 4: NODULO FOLLICOLARE POLIMORFISMO NUCLEARE TIR 5: MALIGNO (Fadda G. et al.thyroid 2006; 16: ) CON

11 AGOASPIRATI TIROIDEI (2391 CASI) 65,3 2,2 16,7 15,3 IN AD/ EMORR (TIR 1) IN DET/ SOSP (TIR 3/ 4) MALIGN I (TIR 5) BEN IGN I (TIR 2)

12 PERCHE CAMBIARE UN SISTEMA VALIDO?

13 PERCHE CAMBIARE UN SISTEMA VALIDO? PROBLEMI DELLA CITOLOGIA AGOASPIRATIVA TRADIZIONALE quantita e qualita del materiale non prevedibili e predeterminabili difficolta di individuazione dei casi complessi e degli studi retrospettivi difficolta di conservazione del materiale non utilizzato non uniforme esperienza degli operatori (spt. clinici e radiologi)

14 COME MIGLIORARE LA QUALITA E LA QUANTITA DEL MATERIALE? fissazione per immersione (fissativi tradizionali per citologia) o per nebulizzazione sospensione del prelievo in soluzione fisiologica (o altri liquidi non fissativi) sospensione in liquidi fissativi (citologia in strato sottile o in fase liquida) inclusione di microfrustolo tessutale per esame istologico (citoincluso o cell-block)

15 CITOLOGIA IN STRATO SOTTILE (TLC) VANTAGGI DELLA TLC facilita d uso (semplice immersione nel fissativo) possibilita di conservazione del materiale non utilizzato fino a 6 mesi (in frigo) standardizzazione nell allestimento dei preparati eliminazione dei contaminanti (sangue, muco) possibilita di applicazione di metodiche ancillari SVANTAGGI DELLA TLC aumento del lavoro tecnico di allestimento difficolta di interpretazione dei preparati citologici costi elevati

16 PRINCIPALI METODICHE DI TLC THIN PREP 2000 (HOLOGICCYTYC) AUTOCYTE LBC (TRIPATH)

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19 METODICA AGOASPIRATIVA 1 Esecuzione dell agoaspirato sotto guida manuale o ecografica con aghi da 25 o 27G Fase 1: Il materiale prelevato viene strisciato sui vetrini; l ago con il materiale residuo viene risciacquato nel Cytolit (soluzione con proprieta emolitiche e di conservazione delle cellule) nel quale può essere conservato anche per alcuni giorni

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21 METODICA AGOASPIRATIVA 2 Fase 2 : Dopo centrifugazione, il sedimento viene risospeso nel liquido di conservazione Preservcyt e inserito nel processatore automatico T2000, con omogenizzazione del materiale Fase 3: Trasferimento automatico ed uniforme del materiale disposto in strato sottile su apposito vetrino caricato

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23 METODICA AGOASPIRATIVA 3 Fase 4: Il vetrino con le cellule in monostrato viene fissato in etanolo per almeno 30 minuti Fase 5 : Colorazione del vetrino con la metodica di Papanicolaou. Fase 6: Il materiale residuo viene conservato nella soluzione Preservcyt per un ulteriore utilizzo.

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25 CASISTICA DELL UNIVERSITA CATTOLICA DI ROMA

26 CASISTICA UNIVERSITA CATTOLICA Dal marzo del 2000 in via sperimentale e solo sugli agoaspirati interni sono stati eseguiti, con la metodica dello split sample, circa 600 agoaspirati Dal gennaio 2001 all ottobre 2003 anche gli agoaspirati ecoguidati sono stati eseguiti con la metodica in strato sottile (doppio prelievo) Dal novembre 2003 ad oggi tutti gli agoaspirati hanno un campione per la citologia su strato sottile e la maggioranza di quelli tiroidei ha solo il prelievo allestito per la TLC

27 CASISTICA UNIVERSITA CATTOLICA TIROIDE 1500 TOTALI

28 CRITERI GENERALI DI CITOLOGIA DIAGNOSTICA L agoaspirato su organi parenchimali viene eseguito su lesioni nodulari ben individuate per diagnosticare e tipizzare i processi patologici, spt. neoplastici Tuttavia, anche in assenza di neoplasia, il quadro citologico deve essere sempre interpretato e pertanto, salvo rari casi, non esiste

29 UTILIZZAZIONE DEL MATERIALE CELLULARE DA AGOASPIRATO morfologia immunocitochimica morfometria citometria a flusso biologia molecolare

30 UTILIZZAZIONE DEL MATERIALE CELLULARE DA AGOASPIRATO morfologia immunocitochimica morfometria citometria a flusso biologia molecolare

31 CRITERI DIAGNOSTICI TIROIDE

32 DIAGNOSI IN CITOLOGIA TIROIDEA DIAGNOSI SU F.N.A.B. * gozzo tiroideo nodulare * cisti * tiroiditi - granulomatose (subacute) - linfocitarie (croniche) * neoplasie - benigne (adenomi) - maligne (carcinomi e altre)

33 CLASSIFICAZIONE CLINICO-CITOLOGICA DELLE DIAGNOSI CITOLOGICHE DI LESIONI TIROIDEE SU AGOASPIRATO (CONSENSUS ITALIANA SIAPEC/IAP) BOZZA FINALE FIRENZE CLASSE DIAGNOSTICA CATEGORIA DIAGNOSTICA TRATTAMENTO RACCOMANDATO CORRISPONDENZA ISTOLOGICA TIR 1 Non diagnostico/ rappresentivo Non diagnostico: ripetizione dopo 1 mese Cisti/emorragia: controllo e/o ripetizione Cisti TIR 2 Negativo per cellule maligne Controllo clinico. A giudizio del clinico o su suggerimento del citopatologo si puo ripetere per minimizzare i FN Gozzo nodulare; nodulo adenomatoso microfollicolare in gozzo; tiroidite TIR 3 Inconclusivo/indeterminato (proliferazione follicolare) Asportazione chirurgica della lesione ed esame istologico. Non esame estemporaneo. Decisione presa sulla base del contesto clinico-strumentale. Alcuni marcatori possono essere utili nella discriminazione tra casi chirurgici e casi medici (GAL-3, HBME-1, CK19) Adenoma follicolare; neoplasie a cellule ossifile; carcinoma follicolare minim. invasivo; carcinoma papillare var. follicolare TIR 4 Sospetto di malignità Eventuale ripetizione della FNC a giudizio del clinico o su suggerimento del citopatologo. Asportazione chirurgica della lesione con eventuale esame estemporaneo Prevalentemente varietà follicolare del carcinoma papillare TIR 5 Positivo per cellule maligne Intervento chirurgico per i carcinomi differenziati (anche in considerazione del contesto clinico). Prosecuzione dell iter diagnostico in caso di ca. anaplastico, metastasi o linfoma Neoplasia maligna non

34 STRUMA TIR 2 NF/NFO SOSP TIR 3 TIR 4 Richard M DeMay: The Art and Science of Cytopathology Vol 2; The thyroid pg725

35 STRUMA O NODULO COLLOIDE (TIR 2) COLLOIDE:Multipli piccoli globuli di colloide densa accanto agli aggregati di tireociti TIREOCITI: di piccola taglia, monomorfi e con citoplasma tenuemente colorato ISTIOCITI: numerosi e vacuolizzati (foamy cells)

36 STRUMA (THIN PREP)

37 STRUMA (CONVENZIONALE)

38 TIROIDITE (TIR 2) Numerosi elementi linfoplasmocitari ed istioidi di sfondo Istiociti giganti plurinucleati (tir. subacuta) Elementi ossifili in connessione con le cellule infiammatorie (complessi linfo-epiteliali) Scarsa colloide

39 TIROIDITE (THIN PREP)

40 TIROIDITE (CONVENZIONALE)

41 PROLIF. FOLLICOLARE (TIR 3)

42 NOD. FOLL. OSSIFILO TIR 3

43 NOD. FOLL. CON POLIMORF. NUCL. TIR 4

44 CARCINOMA PAPILLARE (TIR 5) Pseudoinclusioni nucleari ( Orphan Annie s eyes) Presenza di angolature, chiarificazioni e grooves (solchi) nucleari Presenza di formazioni papillari e psammomi Cellule giganti plurinucleate ed elementi squamosi

45 CELLULE NEOPLASTICHE CON - AL CENTRO - UN INCLUSO NUCLEARE (THIN PREP)

46 CARCINOMA PAPILLARE (CONVENZIONALE)

47 CARCINOMA MIDOLLARE (TIR 5) Tireociti con nuclei plasmocitoidi o allungati simili-fibroblastici con lieve polimorfismo nucleare e citoplasmi granulari Scarsa colloide, frustoli di tessuto sclero-ialino La diagnosi citologica di certezza è immunocitochimica.

48 CELLULE FUSATE E PLASMOCITOIDI NEL CARCINOMA MIDOLLARE TIROIDEO (THIN PREP)

49 CARCINOMA MIDOLLARE (CONVENZIONALE

50 RIASSUNTO DELLE PRINCIPALI VARIAZIONI DEL QUADRO MORFOLOGICO IN CITOLOGIA TIROIDEA La colloide si presenta in globuli e non come una laccatura del fondo Gli elementi infiammatori vengono concentrati e pertanto la loro valutazione quantitativa non è affidabile I dettagli nucleari sono molto netti a causa della diversa fissazione e pertanto i nuclei più chiari possono essere scambiati per nuclei da carcinoma papillare

51 EFFICACIA DELLA CITOLOGIA IN STRATO SOTTILE NEGLI

52 2391 FNAB ( ) 3459 FNAB ( ) 4497 FNAB ( ) 25,0 p=n.s. 20,0 15, ,0 5,0 5) R 3) N I( TI A LI G M T. IN D E IN A D.( TI (T IR R 1) 0,0

53 Inadeguati (TIR 1) IR: 8,4% nel ,4% nel ,3% nel L aumento dell IR nel biennio si spiega con l eliminazione del controllo estemporaneo del materiale per valutare l adeguatezza del prelievo

54 Neoplasie maligne (TIR 5) MR: 2,2% in ,5% in ,2% in Si può considerare un parametro di confidenza del citopatologo. Il MR è simile nei tre periodi e rappresenta pertanto un parametro correlato al tipo di casistica e non alla metodica

55 Indeterminati (Noduli Follicolari) (TIR 3/4) INR: 16,6% in ,3% in ,9% in L aumento dell INR nel secondo biennio si può attribuire al cambiamento di metodo che, nel periodo iniziale, riduce la sicurezza del citopatologo L applicazione di metodiche immunocitochimiche (HBME-1, galectina-3, ecc.), più frequente nell ultimo biennio, potrebbe ridurre ulteriormente i casi dubbi

56 CONFRONTO CITO-ISTOLOGICO SU 311 CASI NELL ANNO SOLARE 2004 (SOLO THIN PREP) Fadda G. e coll. Thyroid 2006;16: CITOL. ISTOL. > LESIONI BENIGNE ( TIR 2 98 CASI) BENIGNI MALIGNI 98 (100) 0 PROLIF. FOLL. (TIR 3 89 (85,6) 104 CASI) NOD. FOLL. SOSPETTI 20 (46,5) (TIR 4 43 CASI) 15 (14,4) NEOPL. MALIGNE (TIR CASI) 30 (100) INADEGUATI/EMORRAGI 29 (80,6) CI (TIR 1 36 CASI) 7 (19,4) 23 (53,5)

57 STUDI DI EFFICACIA DELLA TLC SU AGOASPIRATI TIROIDEI Scurry JP, Duggan MA Cytopathology 2000; 11: Zang Y et al. Diagn Cytopathol 2001; 24: Cochand-Priollet B et al. Cytopathology 2003; 14: Tulecke MA, Wang HH: Diagn Cytopathol 2003; 30:7-13 Malle D et al. Acta Cytologica 2006; 50:2327 Saleh HA et al. Cytojournal 2008; 5 (on-

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59 UTILIZZAZIONE DEL MATERIALE CELLULARE DA AGOASPIRATO morfologia immunocitochimica morfometria citometria a flusso biologia molecolare

60 L IMMUNOCITOCHIMICA NELLA CITOLOGIA AGOASPIRATIVA DIAGNOSI DIFFERENZIALE TRA NEOPLASIE IMMUNOFENOTIPIZZAZIONE DIAGNOSI DI MALIGNITA ASSETTO RECETTORIALE NEL CARCINOMA MAMMARIO

61 METODICHE Su preparati convenzionali fissati e decolorati Su preparati in strato sottile Su citoinclusi (cell blocks)

62 METODICA SU TLC Asciugare all aria per una intera notte Idratare prima di procedere alla colorazione ICC Fare interagire il preparato con l anticorpo specifico (l anticorpo deve essere diluito) Lavare in tampone e incubare con l anticorpo secondario biotinilato Contrastare i nuclei immergendo due volte in ematossilina Montare il coprioggetto

63 DIAGNOSI DIFFERENZIALE TRA NEOPLASIE CA. MIDOLLARE TIROIDEO? CA. RENALE METASTATICO? CALCITONINA

64 IMMUNOFENOTIPIZZAZIONE CD20 CD20 LNH A GRANDI CELLULE LNH A GRANDI CELLULE B

65 DIAGNOSI DI MALIGNITA GALECTINA-3 HBME-1 NODULO FOLLICOLARE TIROIDEO SOSPETTO CARCINOMA RET

66 Rossi ED et al. Cancer Cytopathology 2005; 105:87-95 N.P. ONLY ICC ONLY N.P.+ ICC (W N.P.+ ICC 100% 15.4 % 71 % 100% 76.4% 89.1% 100% 75% 88.9% 100% 92.3 % 96.9 % 69.4 % 83.3% 83.3% 95 % 100% 100 % 100% 100% (W OFN) SENSITIVITY SPECIFICITY DIAGNOSTIC ACCURACY POSIT. PREDICT. VAL. NEG. PREDICT. VAL. OFN) (W / O OFN)

67 Rossi ED et al. Cancer Cytopathology 2005; 105:87-95 N.P. ONLY ICC ONLY N.P.+ ICC (W N.P.+ ICC 100% 15.4 % 71 % 100% 76.4% 89.1% 100% 75% 88.9% 100% 92.3 % 96.9 % 69.4 % 83.3% 83.3% 95 % 100% 100 % 100% 100% (W OFN) SENSITIVITY SPECIFICITY DIAGNOSTIC ACCURACY POSIT. PREDICT. VAL. NEG. PREDICT. VAL. OFN) (W / O OFN)

68 ASSETTO RECETTORIALE NEL CARCINOMA MAMMARIO Estrogen Receptor (ER) Antibody on ThinPrep Breast FNA

69 CASISTICA UNIVERSITA CATTOLICA Nel periodo in esame sono stati eseguiti oltre 500 esami immunocitochimici. La maggior parte di essi è stata eseguita sugli aspirati tiroidei sia con anticorpi organospecifici (tireoglobulina e calcitonina) sia con anticorpi indicatori di malignità (HBME-1, galectina-3, Ret, CK19) Una quota di esami ICC è stata inoltre eseguita sugli aspirati di altri organi (spt mammella) per la diagnosi e per la determinazione dell assetto recettoriale estro-progestinico e per la valutazione dei fattori prognostici

70 IMMUNOCITOCHIMICA SU CITOINCLUSO (CELL BLOCK) VANTAGGIOSA VS. CITOLOGIA Sack MJ, Astengo-Osuna C, Lin BT, Battifora H, LiVolsi VA Mod Pathol 1997; 10: Papotti M, Volante M, Saggiorato E, Deandreis D, Veltri A, Orlandi F Eur J Endocrinol 2002; 147:

71 IMMUNOCITOCHIMICA SU CITOINCLUSO (CELL BLOCK) NESSUN VANTAGGIO VS. TLC Nigro K, Tynski Z, Wasman J, AbdulKarim F, Wang N: Diagn Cytopathol 2007; 35: Saleh HA, Hammod J, Zakaria R, Zeb Khan A: Cytojournal 2008; 5 (on-line)

72 UTILIZZAZIONE DEL MATERIALE CELLULARE DA AGOASPIRATO morfologia immunocitochimica morfometria citometria a flusso biologia molecolare

73 MOLECULAR BIOLOGY ON A THIN-LAYER SMEAR FROM FINE-NEEDLE ASPIRATION BIOPSY A Analisi del riarrangiamento del gene IgH, frammento FR2A/JH. Caso n 2006-C-3625 B C D MW A: campione 2006-C-3625 B: controllo negativo C: controllo monoclonale (Raji cell line) D: controllo (linfonodo) policlonale MW: molecular weight marker (100bp) Conclusioni: l analisi del riarrangiamento del gene IgH, frammento FR2A/JH, per il campione mostra un riarrangiamento di tipo

74 CONCLUSIONI i quadri citologici non differiscono sostanzialmente tra citologia convenzionale e strato sottile la fissazione in fase liquida consente una standardizzazione nell allestimento dei preparati il materiale fissato, opportunamente conservato, consente l applicazione di metodiche che possono apportare significativi miglioramenti nella diagnostica

75 RINGRAZIAMENTI DOTT.SSA ESTHER DIANA ROSSI

76 GRAZIE PER LA PAZIENZA